Development of new squalene sources and further examination of its antioxidant properties

The aim of the PhD thesis was the search for new squalene sources with the aid of biotechnology as well as the examination of the stability of the end product and its antioxidant properties. Safe means for human consumption were chosen. The inherent difficulty of the bioprocess is that squalene is an intermediate and not the end product of ergosterol biosynthesis. The yeast Saccharomyces was chosen by taking into account food safety requirements and its high production yield of ergosterol. Different cultivation conditions, strains and chemical compounds were examined due to the lack of previous knowledge since biotechnological production of squalene is a new area of interest. The bioprocess was optimized by Response Surface Methodology and Central Composite Design. It was concluded that the inherent difficulties for squalene production can be confronted under strict control of the regulation of enzymic activity in the ergosterol biosynthetic pathway. Among the chemical compounds that were tested (ethanol, terbinafine, methyl jasmonate), terbinafine resulted in higher squalene selectivity, yield and productivity. Concomitantly, by the use of terbinafine, Saccharomyces was cultivated under aerobic conditions, facilitating the scale up of the process in bioreactors, the majority of which operates under such conditions. Recovery of squalene by yeast cells with ultrasound assisted extraction, led to the recovery of a lipid fraction enriched in squalene. Squalene yield in this fraction is superior to that of amaranthus seed oil and of the distillates of soybean oil while it is comparable to that of the distillates of olive oil, the richest commercialized squalene source. Squalene acts a weak lipid antioxidant when present at considerable concentrations through competitive reaction mechanism. Identification of squalene oxidation products using various spectroscopic techniques (direct and hyphenated ones such as RP-HPLC, GC/MS, UV, FT-MIR, RAMAN, NMR) showed the presence of hydroxy- and epoxy – derivates. The examination of the pro-oxidant properties of squalene oxidation products in a model lipid substrate (olive oil triacylglycerols purified from pro-oxidants and primary antioxidants), never studied before, revealed that these superseded its antioxidant properties. This finding is of high technological importance particularly in the case of a future scaling-up of the biotechnological production of squalene and its food applications. Protection from oxidation can be achieved using primary antioxidants.Σκοπός της διδακτορικής διατριβής ήταν η ανάπτυξη τεχνογνωσίας για νέα πηγή σκουαλενίου με τη βοήθεια της βιοτεχνολογίας, ο έλεγχος της σταθερότητας και η εξέταση των αντιοξειδωτικών ιδιοτήτων του τελικού προϊόντος. Στο πλαίσιο της βιοτεχνολογικής παραγωγής του σκουαλενίου, αναζητήθηκαν μέσα ασφαλή για τον άνθρωπο. Η εγγενής δυσκολία αυτής της διεργασίας έγκειται στο ότι το λιπίδιο αποτελεί ενδιάμεσο και όχι τελικό προϊόν της βιοσύνθεσης της εργοστερόλης. Ως μικροοργανισμός επιλέχθηκε ο ζυμομύκητας Saccharomyces, λόγω του αδιαμφισβήτητου ιστορικού ασφαλούς χρήσης στα τρόφιμα και λόγω της υψηλής ικανότητας παραγωγής εργοστερόλης. Η αρκετά περιορισμένη βιβλιογραφία για τη βιοτεχνολογική παραγωγή του σκουαλενίου, οδήγησε στη διερεύνηση της επίδρασης πολλών συνθηκών, στελεχών και βοηθητικών ενώσεων. Η βελτιστοποίηση των βιοδιεργασιών έγινε με τη Μεθοδολογία Επιφάνειας Απόκρισης και το Σύνθετο Κεντρικό Σχεδιασμό. Από τα ευρήματα προέκυψε ότι η εγγενής δυσκολία παραγωγής σκουαλενίου αντιμετωπίζεται με αυστηρό έλεγχο της δράσης κρίσιμων ενζύμων της βιοσύνθεσης της εργοστερόλης. Μεταξύ των ρυθμιστικών ενώσεων που εξετάστηκαν (αιθανόλη, terbinafine, μεθυλεστέρας ιασμονικού οξέος), ικανοποιητικότερη παραγωγή του σκουαλενίου με όρους εκλεκτικότητας, απόδοσης και παραγωγικότητας, επετεύχθη με τη βοήθεια της terbinafine. Η παρουσία της terbinafine επέτρεψε την παραγωγή του σκουαλενίου σε αερόβιο περιβάλλον, διευκολύνοντας τη μελλοντική κλιμάκωση της βιοδιεργασίας σε βιομηχανικούς βιοαντιδραστήρες, που στην πλειοψηφία τους λειτουργούν σε αερόβιες συνθήκες. Η παραλαβή του σκουαλενίου από τη βιομάζα του ζυμομύκητα με τη βοήθεια των υπερήχων, μέθοδος που εφαρμόζεται σε βιομηχανική κλίμακα, οδήγησε στην παραλαβή κλάσματος λιπιδίων εμπλουτισμένου σε σκουαλένιο που υπερτερεί ως προς την απόδοση σε σκουαλένιο έναντι άλλων εμπορικής σημασίας πηγών του (έλαιο από το σπόρο του αμάρανθου, απόβλητα απόσμησης του σογιελαίου) και βρίσκεται στην ίδια τάξη μεγέθους με την πλουσιότερη και εμπορικά αξιοποιήσιμη προς το παρόν πηγή του (απόβλητα απόσμησης του ελαιολάδου). Το σκουαλένιο φάνηκε να παρουσιάζει ελαφρά αντιοξειδωτική δράση όταν απαντάται σε αξιοσημείωτες συγκεντρώσεις στο λιπαρό υπόστρωμα. Η δράση αυτή αποδίδεται στο φαινόμενο της ανταγωνιστικής οξείδωσης. Η ταυτοποίηση των προϊόντων οξείδωσης του σκουαλενίου με διάφορες φασματοσκοπικές τεχνικές (RP-HPLC, GC/MS, UV, FT-MIR, RAMAN, NMR) έδειξε την παρουσία κυρίως υδροξυ- και εποξυ- παραγώγων. Η διερεύνηση της προοξειδωτικής δράσης των προϊόντων οξείδωσης του σκουαλενίου σε μοντέλο λιπαρού υποστρώματος (παρθένο ελαιόλαδο πλήρως απαλλαγμένο από αντιοξειδωτικούς και προοξειδωτικούς παράγοντες), δεν έχει αναφερθεί προηγουμένως στη βιβλιογραφία και φάνηκε να αναιρεί την αντιοξειδωτική δράση του σκουαλενίου. Το εύρημα αυτό έχει μεγάλη τεχνολογική σημασία στην κλιμάκωση της βιοδιεργασίας που αναπτύχθηκε για την περαιτέρω αξιοποίηση του τελικού προϊόντος στη βιομηχανία τροφίμων. Η προοξειδωτική δράση αυτή βρέθηκε να περιορίζεται από την παρουσία πρωτοταγών αντιοξειδωτικών

Recovery of Squalene from Wine Lees Using Ultrasound Assisted ExtractionA Feasibility Study

The present work is a systematic approach for valorization of wine lees regarding the recovery of squalene, a bioactive lipid. Such a study is presented for the first time in literature. Separate examination of squalene content in “light” and “heavy” lees from different vinification processes by RP-HPLC demonstrated that these waste streams can be used as a source for this lipid, despite variations due to technological or genetic effects. Next, ultrasound assisted extraction of squalene from the “industrial waste” (the mixture of wine lees generated from different wines) using <i>n</i>-hexane was optimized with the aid of response surface methodology (independent variables: sonication duration and duty cycles). Autolysis was monitored through optical microscopy. Squalene yield (0.6 ± 0.08 g SQ/kg dry lees) was comparable to that of recently examined potential sources (0.2–0.35 g SQ/kg dry olive pomace and 0.06 g SQ/kg olive leaves)

Advantages of supercritical fluid extraction for recovery of squalene from wine lees

Utilization of wastes from winery industry seems to be a cost-effective and an environmental friendly investment. A number of valuable components can be recovered from winery wastes and specifically from wine lees like tartaric acid, b-1,3-glucans, squalene. The main goal of this study was to apply supercritical carbon dioxide (SCCO2) extraction for the isolation of squalene from wine lees. The samples were collected during the fractionation at 12-30 MPa under isothermal conditions at 40 degrees C to monitor the changes in the chemical composition and extract yield with respect to pressure and CO2 consumption. Using SCCO2, total squalene content in the extracts was found to be 16.9 g/kg, a value comparable to the one obtained by using ultrasound assisted extraction (20.4 g/kg hexane extract) or a reference method (acid assisted extraction using organic solvents) (17.6 g/kg). Examination of lipid composition by TLC verified the absence of squalene oxidation products in the extracts marked previously as a drawback of the other extraction techniques

Exploring the Potential of Halloumi Second Cheese Whey for the Production of Lactic Acid Cultures for the Dairy Industry

Production of halloumi cheese in Cyprus has increased rapidly over the last decade since the popularity of the cheese is growing. This results in excess production of whey streams that pose serious environmental concerns and are difficult to manage. In our study, the poorly investigated second cheese whey (SCW) generated after the extraction of anari, a by-product of halloumi cheese manufacture, was examined for dairy industry lactic acid bacteria (LAB) culture production. The LAB studied were all initially isolated from SCW. These LAB were molecularly identified and characterized in an attempt to explore their potential use as starter cultures for the dairy industry. A total of 11 Gram-positive and catalase-negative isolates were identified, belonging to four different species/subspecies: Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus delbrueckii subsp. jakobsenii, Lactobacillus leichmannii and Lactobacillus crispatus. Lactose/galactose utilization tests demonstrated species-specific differences in galactose and lactose catabolism. Interestingly, culturing the selected isolates in SCW supplemented with skimmed milk (30% total solids) improved their freeze-drying tolerance (75–91% survival rate depending on the species). Moreover, isolates in vacuum-packed powders maintained viability and metabolic activity over 3-month storage at 4 °C