Study of the virulence factors from avian pathogenic Escherichia coli strains (APEC)

Orientador: Wanderley Dias da SilveiraTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Duas linhagens de Escherichia co/i patogênicas isoladas de aves (APEC) com sinais clínicos de septicemia (517 e 521) e wna isolada de aves com sinais clínicos de 5índrome de Cabeça Inchada (5CIl O) foram selecionadas, do conjunto de 49 linhagens pertencentes ao Laboratório de Biologia Molecular Bacteriana, após a caracterização das mesmas quanto à presença das capacidades de adesão e invasão em células HEp-2 e HeLa, perfil de resistência a diferentes antimicrobianos, presença de genes (detectados por PCR) relacionados à patogenicidade, e perfil de DNA plasmidial. Teste de REP-PCR também foi realizado para separação destas linhagens em grupos clonais. Os plasmídios dessas linhagens foram transferidos, através de conjugação, para a linhagem receptora não patogênica, E. co/i HBI0l. A análise das amostras recombinantes obtidas, através das características estudadas, demonstrou que somente aquelas transconjugantes derivadas da linhagem 517, uma delas denominada de 517-1, apresentaram adesão e invasão nessas culturas celulares utilizadas, indicando que os genes responsáveis por estas características estão localizados no plasmídio que foi transferido (70 MDa). Pelo fato das capacidades de adesão e invasão das linhagens 521 e SCIl O não terem sido detectadas em transconjugantes em que ocorreram as transferências de plasmídios existentes nestas duas linhagens, indica que os genes responsáveis por estas características não são plasmídio-mediado, podendo, ou serem cromossômicos, ou mesmo serem plasmidiais, porém com controle de genes cromossômicos. A mutação da amostra 517-1, com o transposon TnphoA levou à perda das capacidades de adesão e/ou invasão em células HEp-2 e HeLa, o que indica que o processo de inserção do transposon tenha ocorrido em genes relacionados aos processos citados. O gene tsh (hemaglutinina termo-sensível) presente na linhagem 521, e os genes relacionados ao sistema de aerobactina presentes nas linhagens SCIlO ifepC) e 521 (iucA), também não foram identificados nas amostras transconjugantes. Com isso, sugere-se que estes genes possam estar localizados no cromossomo destas linhagens, bem como os genes de adesão e invasão dessas linhagens. Esta observação pode indicar a presença de possíveis "ilhas de patogenicidade" nestas linhagens, porém outros estudos devem ser realizados para que esta hipótese se confirme. A produção de colicinas (Ia, Ib, El, E3, B, K) pela linhagem SCIlO também foi passível de ser transferida para a linhagem bacteriana receptora, o que indica que esta característica é expressa por genes presentes no plasmídio transferido (120 MDa). Através de testes de invasão na linhagem celular HEp-2, Microscopia Eletrônica de Varredura e teste de F AS verificou-se que a capacidade de invasão celular presente na linhagem S 17 é diferente daquelas descritas para outras E. coZi invasivas, Salmonella spp. e Shigella spAbstract: Two pathogenic Escherichia coZi strains isolated from avian (APEC) showing c1inical signs of septicemia (817 and 821), and one isolated from avian showing c1inical signs of 8wollen Head 8yndrome (8H8 1 O), were selected from a total of 49 strains belonging to the Laboratory of Bacterial Molecular Biology, after a biological characterization regarding the presence of adhesion and invasion capacities to HEp-2 and HeLa cells, resistance profile to different antimicrobial drugs, presence of genes (detected by PCR) associated with pathogenicity, and plasmidial DNA profile. REP-PCR assay also was performed for separation of these strains in c10nal groups. Plasmids from these strains were transferred by conjugation assays to the non-pathogenic E. coZi strain HB 1 O 1. The analysis of the obtained recombinants strains, demonstrated that only recombinant strains derived from 817, one of these designated as 817-1, showed adhesion and invasion to these cells, indicating that the genes responsible for these characteristics are located in the transferred plasmid (70 MDa). 8ince the adhesion and invasion capacities of 821 and 8H8 1 O strains were not detected in recombinant strains where the transference of plasmids presents in these two strains occurred, indicates that the genes responsible for these characteristics are not plasmid-mediated. The location of these genes could be chromosomal, or thus plasmidial, but with chromosomal control. The mutation of 817-1 strain, with TnphoA transposon, resulted in the lost of adhesion and/or invasion capacities to HEp-2 and HeLa cells, which indicate that the transposon insertion process had occur at genes associated with the described processo The tsh gene (temperature-sensitive hemagglutinin) from 821 strain, and aerobactin genes from 8H810 ifepC) and 821 (iucA) strains, also were not found in the recombinants strains. These results suggest that these genes could be located in chromosomal regions as well as the adhesion and invasion genes from these strains. This observation could indicate that the presence of possible "pathogenicity islands" in these strains, but other studies must be realized for confirmation of this hypothesis. The production of colicins (Ia, Ib, El, E3, B and K) by strain 8H810 also was transferred to the recipient strain, which indicate that this characteristic is expressed by genes located at the transferred plasmid (120 MDa). Using invasion assays to HEp-2 cells, 8canning Electron Microscopy and FA8 assay, it was possible to observe that the cellular invasion capacity from 817 strain is different of those processes described by others invasive E. coZi, Salmonella spp. and Shigella spDoutoradoMicrobiologiaDoutor em Genetica e Biologia Molecula

Ocorrência de seqüências relacionadas com a virulência e análise filogenética de estirpes comensais e patogênicas de Escherichia coli aviário (APEC)

The presence of iron uptake (irp-2, fyuA, sitA, fepC, iucA), adhesion (iha, lpfA O157/O141, lpfA O157/O154, efa, toxB) and invasion (inv, ial-related DNA sequences and assignment to the four main Escherichia coli phylogenetic groups (A, B1, B2 e D) were determined in 30 commensal E. coli strains isolated from healthy chickens and in 49 APEC strains isolated from chickens presenting clinical signs of septicemia (n=24) swollen head syndrome (n=14) and omphalitis (n=11) by PCR. None of the strains presented DNA sequences related to the inv, ial, efa, and toxB genes. DNA sequences related to lpfA O157/O154, iucA, fepC, and irp-2 genes were significantly found among pathogenic strains, where iucA gene was associated with septicemia and swollen head syndrome and fepC and irp-2 genes were associated with swollen head syndrome strains. Phylogenetic typing showed that commensal and omphalitis strains belonged mainly to phylogenetic Group A and swollen head syndrome to phylogenetic Group D. Septicemic strains were assigned in phylogenetic Groups A and D. These data could suggest that clonal lineage of septicemic APEC strains have a multiple ancestor origin; one from a pathogenic bacteria ancestor and other from a non-pathogenic ancestor that evolved by the acquisition of virulence related sequences through horizontal gene transfer. Swollen head syndrome may constitute a pathogenic clonal group. By the other side, omphalitis strains probably constitute a non-pathogenic clonal group, and could cause omphalitis as an opportunistic infection. The sharing of virulence related sequences by human pathogenic E. coli and APEC strains could indicate that APEC strains could be a source of virulence genes to human strains and could represent a zoonotic risk.A presença de seqüências de DNA associadas à capacidade de captação de ferro (irp-2, fyuA, sitA, fepC, iucA), adesão (iha, lpfA O157/O141, lpfA O157/O154, efa, toxB) e de invasão (inv, ial) e a classificação dentro dos quatro grupos filogenéticos principais de Escherichia coli (Grupos A, B1, B2 e D) foram determinadas, através de PCR, em 30 amostras comensais de E. coli isoladas de frangos e de 49 linhagens APEC (24 isoladas de frangos com septicemia, 14 isoladas de frangos com síndrome da cabeça inchada e 11 isoladas de embriões de galinhas com onfalite). Nenhuma das linhagens apresentou os genes inv, ial, efa, e toxB. Os genes lpfA O157/O154, iucA, fepC e irp-2 foram encontrados em freqüências significativas entre as amostras patogênicas. O gene iucA foi associado com amostras causadoras de septicemia e de síndrome da cabeça inchada. Os genes fepC e irp-2 foram associados a amostras causadoras de síndrome da cabeça inchada. A análise filogenética demonstrou que linhagens comensais e causadoras de onfalite pertenceram principalmente ao Grupo filogenético A, não patogênico. Amostras causadoras de síndrome da cabeça inchada pertenceram, em sua maioria, ao Grupo patogênico D. Linhagens causadoras de septicemia pertenceram aos Grupos A e D. Estes dados sugerem que linhagens APEC causadoras de septicemia provavelmente têm uma origem ancestral múltipla: uma derivada de uma linhagem patogênica e outra de uma linhagem não patogênica que possivelmente evoluiu através da aquisição horizontal de genes de virulência. Amostras causadoras de síndrome da cabeça inchada possivelmente constituem um grupo clonal patogênico. Por outro lado, amostras causadoras de onfalite possivelmente constituem um grupo clonal não patogênico, que, possivelmente causam onfalite devido a uma infecção oportunista. A presença de genes de virulência também encontrados em E. coli de origem humana pode indicar a possível ocorrência de zoonoses causadas por APEC.533540Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq

Nanopharmaceuticals as a solution to neglected diseases: is it possible?

The study of neglected diseases has not received much attention, especially from public and private institutions over the last years, in terms of strong support for developing treatment for these diseases. Support in the form of substantial amounts of private and public investment is greatly needed in this area. Due to the lack of novel drugs for these diseases, nanobiotechnology has appeared as an important new breakthrough for the treatment of neglected diseases. Recently, very few reviews focusing on filiarasis, leishmaniasis, leprosy, malaria, onchocerciasis, schistosomiasis, trypanosomiasis, and tuberculosis, and dengue virus have been published. New developments in nanocarriers have made promising advances in the treatment of several kinds of diseases with less toxicity, high efficacy and improved bioavailability of drugs with extended release and fewer applications. This review deals with the current status of nanobiotechnology in the treatment of neglected diseases and highlights how it provides key tools for exploring new perspectives in the treatment of a wide range of diseases.Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriale

Nanopharmaceuticals as a solution to neglected diseases: Is it possible?

The study of neglected diseases has not received much attention, especially from public and private institutions over the last years, in terms of strong support for developing treatment for these diseases. Support in the form of substantial amounts of private and public investment is greatly needed in this area. Due to the lack of novel drugs for these diseases, nanobiotechnology has appeared as an important new breakthrough for the treatment of neglected diseases. Recently, very few reviews focusing on filiarasis, leishmaniasis, leprosy, malaria, onchocerciasis, schistosomiasis, trypanosomiasis, and tuberculosis, and dengue virus have been published. New developments in nanocarriers have made promising advances in the treatment of several kinds of diseases with less toxicity, high efficacy and improved bioavailability of drugs with extended release and fewer applications. This review deals with the current status of nanobiotechnology in the treatment of neglected diseases and highlights how it provides key tools for exploring new perspectives in the treatment of a wide range of diseases.Fil: Islan, German Abel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales; ArgentinaFil: Durán, Marcela. Universidade Estadual de Campinas; BrasilFil: Cacicedo, Maximiliano Luis. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales; ArgentinaFil: Nakazato, Gerson. Universidade Estadual de Londrina; BrasilFil: Kobayashi, Renata K. T.. Universidade Estadual de Londrina; BrasilFil: Martinez, Diego S. T.. Universidade Estadual de Campinas; BrasilFil: Castro, Guillermo Raul. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales; ArgentinaFil: Durán, Nelson. Universidade Estadual de Campinas; Brasi

Subpathotypes of Avian Pathogenic Escherichia coli (APEC) Exist as Defined by their Syndromes and Virulence Traits

Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) strains cause different types of systemic extraintestinal infections in poultry, collectively termed colibacillosis, which can cause significant economic losses in the poultry industry. To date, there have been no descriptions of genes or characteristics that allow for the classification of avian strains pathotypes responsible for causing specific diseases in their hosts. In this study we aimed to characterize avian E. coli strains representing 4 groups, including one of commensal strains (AFEC – Avian Fecal Escherichia coli) and 3 groups of APEC strains, where each group is responsible for causing a different disease syndrome in their respective hosts (septicemia, omphalitis and swollen head syndrome). We chose to examine several biological characteristics of these strains including: adhesion to eukaryotic cells, pathogenicity levels according to the lethal dose (50%) assay, phylogenetic group and virulence gene profiles. The comparison of strains based on these genotypic and phenotypic traits, using multivariate statisticals tools and complex networks, allowed us to infer information about the population structure of the studied groups. Our results indicate that APEC strains do not constitute a unique homogeneous group, but rather a structured set of subgroups, where each one is associated with a specific infectious syndrome which can possibly be used to define pathotypes or subpathotypes within APEC strains. These results offer new possibilities with which to study the genes responsible for various pathogenetic processes within APEC strains, and for vaccine development. It may be important to consider these subgroups when developing a vaccine in an effort for obtain cross protection, which has not yet been successfully accomplished when working with APEC strains

Multi-target drug with potential applications: violacein in the spotlight

The aim of the current review is to address updated research on a natural pigment called violacein, with emphasis on its production, biological activity and applications. New information about violacein’s action mechanisms as antitumor agent and about its synergistic action in drug delivery systems has brought new alternatives for anticancer therapy. Thus, violacein is introduced as reliable drug capable of overcoming at least three cancer hallmarks, namely: proliferative signaling, cell death resistance and metastasis. In addition, antimicrobial effects on several microorganisms affecting humans and other animals turn violacein into an attractive drug to combat resistant pathogens. Emphasis is given to effects of violacein combined with different agents, such as antibiotics, anticancer agents and nanoparticles. Although violacein is well-known for many decades, it remains an attractive compound. Thus, research groups have been making continuous effort to help improving its production in recent years, which can surely enable its pharmaceutical and chemical application as multi-task compound, even in the cosmetics and food industries.Fil: Durán, Nelson. Universidade Estadual de Campinas; BrasilFil: Nakazato, Gerson. Universidade Estadual de Londrina; BrasilFil: Durán, Marcela. Universidade Estadual de Campinas; BrasilFil: Rivero Berti, Ignacio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales; ArgentinaFil: Castro, Guillermo Raul. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales; ArgentinaFil: Stanisic, Danijela. Universidade Estadual de Campinas; BrasilFil: Brocchi, Marcelo. Universidade Estadual de Campinas; BrasilFil: Fávaro, Wagner J.. Universidade Estadual de Campinas; BrasilFil: Ferreira Halder, Carmen V.. Universidade Estadual de Campinas; BrasilFil: Justo, Giselle Z.. Universidade Federal de Sao Paulo.; BrasilFil: Tasic, Ljubica. Universidade Estadual de Campinas; Brasi

ANÁLISE COMPARATIVA DOS FATORES DE VIRULÊNCIA DOS ISOLADOS CLÍNICOS E AMBIENTAIS DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA

Pseudomonas aeruginosa is a very important bacteria for public health because it is present in the environment and clinical infections. The aim of this study was to evaluate the virulence factors such as motility, protease and rhamnolipids in clinical and environmental P. aeruginosa isolates. Twenty-five clinical isolates and ten environmental isolates were analyzed by phenotypic assays and categorized into non-mobile, weakly, moderately and highly mobile strains; and producers of protease and rhamnolipids. The isolates were tested in triplicate on three different days. Environmental isolates produced virulence factors such as motility (Swimming and Twitching), and Ramnolipids significantly higher than clinical isolates. This study alerts us to the high level of pathogenicity of P. aeruginosa strains, mainly environmental strains. For a better understanding of motility and rhamnolipids, virulence factors that are directly associated with the biofilms formation, may favor studies that complement the research aimed at the control of pathogenic bacteriaPseudomonas aeruginosa possui grande importância para a saúde pública por estar presente no ambiente e nas infecções clínicas. O objetivo deste trabalho foi avaliar fenotipicamente os fatores de virulência motilidade, protease e ramnolipídeos em isolados clínicos e ambientais de P. aeruginosa. Vinte e cinco isolados clínicos e dez isolados ambientais foram analisados através de ensaios fenotípicos e categorizados em cepas não móveis, fracamente, moderadamente e altamente móveis; e produtores ou não de protease e ramnolipídeos. Em todos os ensaios, os isolados foram testados em triplicata em três dias diferentes. Os isolados ambientais produziram fatores de virulência como a motilidade (Swimming e Twitching) e Ramnolipídeos significativamente maior que os isolados clínicos. Este estudo nos alerta para o elevado nível de patogenicidade das cepas de P. aeruginosa, principalmente ambientais. A melhor compreensão da motilidade e produção de ramnolipídeos, fatores que estão diretamente associados à formação de biofilmes, pode favorecer estudos complementares às pesquisas visando o controle de bactérias patogênicas

Presence of virulence genes and pathogenicity islands in extraintestinal pathogenic Escherichia coli isolates from Brazil.

International audienceExtraintestinal pathogenic Escherichia coli (ExPEC) is associated with various diseases such as urinary tract infections, neonatal meningitis and septicemia. There are many virulence factors (VF) encoded by genes in ExPEC, including papC, papG, ecpA, iroN, fyuA, iutA, ompTp, tsh, hlyF, hlyA and iss. These virulence genes may be present in pathogenicity islands (PAI) or plasmids. In this study, we analyzed the presence of VF encoding genes, PAI sequences and phylogenetic groups of 96 ExPEC strains isolated from the urine and blood of patients at the University Hospital of Londrina, and we compared them with 50 faecal commensal strains from healthy individuals. The VF fyuA (65.60%) was detected in pathogenic strains and commensal strains (46%). A comparison of the distribution of ExPEC and commensal strains in the phylogenetic groups showed that more ExPEC strains belonged to group B2 whereas more of the commensal isolates belonged to group A. The distribution of the seven PAI sequences between commensal strains and ExPEC strains showed that PAI IV536 was common in both ExPEC and commensal isolates. These results showed that the ExPEC strains that belonged to group B2 had more PAI sequences compared to those of the other groups, especially group B1, which had virulence genes but the lowest percentage of PAI sequences, which leads us to conclude that the virulence of ExPEC strains characterized as B2 is likely attributed to PAI encoded genes, whereas the virulence of ExPEC strains belonging to phylogenetic group B1 is likely due to plasmid encoded virulence genes

PERFIL MICROBIOLÓGICO E QUÍMICO DE EXTRATOS PADRONIZADOS DE INGA MARGINATA

Doenças infecciosas vêm apresentando crescente mortalidade no mundo, para o tratamento destas enfermidades as plantas se destacam por apresentar diversas espécies que atuam como agentes terapêuticos. Inga marginata Willd está classificado entre as dez espécies de plantas mais importantes da região do médio Tibagi do estado do Paraná. De acordo com alguns autores a atividade antimicrobiana de folhas de Inga marginata revela um potencial uso desta planta frente a alguns patógenos humanos. Mas devido à carência de uma avaliação mais precisa da espécie, surgiu à necessidade de um estudo, visando elucidar algumas propriedades químicas e microbiológicas desta planta. Com este trabalho foi possível obter informações sobre as melhores condições de extração dos compostos de interesse da planta por meio de um modelo de misturas, determinar o teor de compostos fenólicos totais e avaliar a atividade antimicrobiana da planta contra bacterias Gram positivas e negativas como S. aureus, S. epidermidis, E. coli e P. aeruginosa, como também para fungos como Candida albicans, C. tropicalis and C. glabrata. Com os resultados se constatou que os extratos 1 e 2 extraídos com somente água e etanol, respectivamente, demonstraram efeito bacteriostático contra os microorganismos testados. Isso demonstra uma potencial atividade antibacteriana dos extratos, podendo ser aplicados em formulações farmacêuticas com finalidade antisséptica. Desta forma, a espécie pesquisada pode ser uma alternativa promissora para substituição dos antissépticos usuais de origem sintética por antissépticos de origem natural com menor toxicidade para o ser humano e meio ambiente

Tipificação de amostras aviárias patogênicas de Escherichia coli pela REP-PCR

In the present study the repetitive extragenic palindromic (REP) polymerase chain reaction (PCR) technique was used to establish the clonal variability of 49 avian Escherichia coli (APEC) strains isolated from different outbreak cases of septicemia (n=24), swollen head syndrome (n=14) and omphalitis (n=11). Thirty commensal strains isolated from poultry with no signs of these illnesses were used as control strains. The purified DNA of these strains produced electrophoretic profiles ranging from 0 to 15 bands with molecular sizes varying from 100 bp to 6.1 kb, allowing the grouping of the 79 strains into a dendrogram containing 49 REP-types. Although REP-PCR showed good discriminating power it was not able to group the strains either into specific pathogenic classes or to differentiate between pathogenic and non-pathogenic strains. On the contrary, we recently demonstrated that other techniques such as ERIC-PCR and isoenzyme profiles are appropriate to discriminate between commensal and APEC strains and also to group these strains into specific pathogenic classes. In conclusion, REP-PCR seems to be a technique neither efficient nor universal for APEC strains discrimination. However, the population clonal structure obtained with the use of REP-PCR must not be ignored particularly if one takes into account that the APEC pathogenic mechanisms are not completely understood yet.A técnica de REP (Repetitive extragenic palindrome)-PCR foi utilizada para avaliar a variabilidade genética de 49 amostras de Escherichia coli patogênicas para aves (APEC), isoladas de aves de corte (frangos) em diferentes surtos de septicemia (n=24), síndrome da cabeça inchada (n=14) e onfalite (n=11). Trinta amostras comensais, isoladas de frangos sem sinais de doença, foram utilizadas como controle. A análise do perfil eletroforético obtido por reação de REP-PCR utilizando DNA purificado das amostras evidenciou a amplificação de 0 a 15 bandas de DNA com pesos moleculares variando entre 100 pb e 6.1 Kb. A análise deste padrão permitiu a construção de um dendrograma demonstrando o agrupamento das 79 amostras em 49 perfis distintos. Embora a técnica de REP-PCR tenha apresentado grande poder discriminatório, as amostras patogênicas e não patogênicas não foram discriminadas entre si assim como não foi observado o agrupamento de amostras causadoras do mesmo tipo de doença. Por outro lado, demonstramos recentemente que outras técnicas tais como ERIC-PCR e a análise de isoenzimas foram eficientes quando utilizadas para esta mesma finalidade. Concluindo, REP-PCR parece não ser uma técnica eficiente e universal para discriminar entre amostras APEC. Porém, a estrutura clonal populacional obtida com o uso de REP-PCR não deve ser desprezada, particularmente se considerarmos que os mecanismos de patogenicidade de APEC ainda não são completamente conhecidos.6973Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq