Estudio de la regulación transcripcional de los transportadores hepatobiliares e identificación de los elementos de respuesta en el promotor del gen Organic solute transporter beta (SLC51B)

Bile acids are amphipathic molecules produced in hepatocytes from cholesterol that act as a detergent, contributing to the hepatobiliary secretion of endogenous and xenobiotic metabolites, as well as the intestinal absorption of lipids, hydrophobic vitamins and drugs. In addition, they are also signaling molecules and metabolic regulators. Given the delicate biological role of bile acids, their metabolism and transport are finely regulated. Therefore, the disruption of these processes is associated with liver cholestatic diseases, fatty liver disease, dyslipidemias, diabetes, obesity and cardiovascular diseases. In the present work we focused on the regulation of transcription of a broad spectrum of human hepatobiliary canalicular transporters (BSEP, MRP2, ABCG5/ABCG8, MDR3, BCRP and MDR1) and basolateral / sinusoidal transporters (NTCP, MRP3, MRP4, OSTa/OSTb, OATP1B1, OATP1B3 and OATP1A2), by nuclear receptors and liver-enriched transcription factors: PPARa, RXRa, CAR, LXRa, PXR, FOXA1, HNF4a, C/EBPa, C/EBPb, VDR and the coactivator PGC1a. For this purpose, we have performed overexpression experiments of these factors and their combinations in HepG2, using adenoviral vectors, followed by the quantification of the level of expression of the transporters, using real-time PCR (RT-PCR). The limiting subunit (OSTb) of the heterodimeric transporter Organic solute transporter (OSTa/OSTb) is encoded by the SLC51B gene and has a fundamental function in the enterohepatic circulation since in enterocytes it is responsible for the secretion of bile acids to the portal circulation. It is also reported that it is expressed in hepatocytes where OSTb appears to play a protective role against bile acid toxicity. In cholestatic conditions, in which bile acid accumulation damage is occurring in hepatocytes, these transporters are induced as an alternative route of protection, transporting bile acids back into the blood through the basolateral membrane to allow excretion throughout the renal route. Interestingly, OSTa/OSTb is abundantly expressed in human liver, in contrast with rat or mouse liver. However, the mechanistic basis of this differential expression in human hepatocytes has not been investigated. Therefore, we have studied in greater detail the regulation of SLC51B, cloning its promoter and characterizing the binding areas of the different transcription factors, through luciferase reporter assays, with a special focus on C/EBPa and C/EBPb.Los ácidos biliares son moléculas anfipáticas producidas en los hepatocitos a partir del colesterol que actúan como detergentes, facilitando la secreción hepatobiliar de metabolitos endógenos y xenobióticos, así como la absorción intestinal de lípidos, vitaminas hidrofóbicas y fármacos. Además, también son moléculas de señalización y reguladores metabólicos. Dado el delicado rol biológico de los ácidos biliares, su metabolismo y transporte están finamente regulados. El desarreglo de estos procesos se asocia con enfermedades colestásicas hepáticas, hígado graso, dislipemias, diabetes, obesidad y enfermedades cardiovasculares.En el presente trabajo nos centramos en la regulación de la transcripción de un amplio espectro de transportadores hepatobiliares humanos, tanto basolaterales/sinusoidales (NTCP, MRP3, MRP4, OSTa/OSTb, OATP1B1, OATP1B3, OATP1A2) como canaliculares (BSEP, MRP2, ABCG5/ABCG8, MDR3, BCRP y MDR1), como por parte de factores de transcripción de relevancia en el hígado: PPARa, RXRa, CAR, LXRa, PXR, FOXA1, HNF4a, C/EBPa, C/EBPb, VDR y el coactivador PGC1a. Para ello se han realizado experimentos de sobreexpresión de dichos factores, y combinaciones de los mismos, en HepG2 mediante el uso de vectores adenovirales, seguido de la cuantificación del nivel de expresión de los transportadores, utilizando PCR en tiempo real (RT-PCR). La subunidad limitante (OSTb) del transportador heterodimérico Organic solute transporter (OSTa/OSTb) está codificada por el gen SLC51B y tiene una función fundamental en la circulación enterohepática, ya que en los enterocitos es responsable de la secreción de los ácidos biliares, absorbidos en el intestino, a la circulación portal. Asimismo, está descrito que también se expresa en los hepatocitos donde OSTb juega un papel protector frente a la toxicidad de los ácidos biliares. En condiciones colestásicas, en las cuales se está produciendo un daño por acumulación de ácidos biliares en los hepatocitos, estos transportadores se inducen como vía alternativa de protección, transportando ácidos biliares de nuevo a la sangre a través de la membrana basolateral, para permitir la excreción por vía renal. Curiosamente, la expresión de OSTa/OSTb es abundante en hígado humano pero muy escasa en hígado de rata o ratón. Sin embargo, la base mecanística de esta expresión diferencial en hepatocitos humanos no ha sido investigada. Por ello, hemos estudiado con mayor detalle la regulación de SLC51B, clonando su promotor y caracterizando las zonas del mismo en las cuales se unen los diferentes factores de transcripción mediante ensayos reporteros, con un foco especial en C/EBPa y C/EBPb.Morante Palacios, O. (2017). Estudio de la regulación transcripcional de los transportadores hepatobiliares e identificación de los elementos de respuesta en el promotor del gen Organic solute transporter beta (SLC51B). http://hdl.handle.net/10251/86110TFG

Understanding the relevance of DNA methylation changes in immune differentiation and disease

Altres ajuts: We thank CERCA Programme/Generalitat de Catalunya and Josep Carreras Foundation for institutional support. E.B. was funded by [...] and was co-funded by FEDER funds/European Regional Development Fund (ERDF)-a way to build Europe.Immune cells are one of the most complex and diverse systems in the human organism. Such diversity implies an intricate network of different cell types and interactions that are dependently interconnected. The processes by which different cell types differentiate from progenitors, mature, and finally exert their function requires an orchestrated succession of molecular processes that determine cell phenotype and function. The acquisition of these phenotypes is highly dependent on the establishment of unique epigenetic profiles that confer identity and function on the various types of effector cells. These epigenetic mechanisms integrate microenvironmental cues into the genome to establish specific transcriptional programs. Epigenetic modifications bridge environment and genome regulation and play a role in human diseases by their ability to modulate physiological programs through external stimuli. DNA methylation is one of the most ubiquitous, stable, and widely studied epigenetic modifications. Recent technological advances have facilitated the generation of a vast amount of genome-wide DNA methylation data, providing profound insights into the roles of DNA methylation in health and disease. This review considers the relevance of DNA methylation to immune system cellular development and function, as well as the participation of DNA methylation defects in immune-mediated pathologies, illustrated by selected paradigmatic diseases

SIRT1/2 orchestrate acquisition of DNA methylation and loss of histone H3 activating marks to prevent premature activation of inflammatory genes in macrophages

Sirtuins 1 and 2 (SIRT1/2) are two NAD-dependent deacetylases with major roles in inflammation. In addition to deacetylating histones and other proteins, SIRT1/2-mediated regulation is coupled with other epigenetic enzymes. Here, we investigate the links between SIRT1/2 activity and DNA methylation in macrophage differentiation due to their relevance in myeloid cells. SIRT1/2 display drastic upregulation during macrophage differentiation and their inhibition impacts the expression of many inflammation-related genes. In this context, SIRT1/2 inhibition abrogates DNA methylation gains, but does not affect demethylation. Inhibition of hypermethylation occurs at many inflammatory loci, which results in more drastic upregulation of their expression upon macrophage polarization following bacterial lipopolysaccharide (LPS) challenge. SIRT1/2-mediated gains of methylation concur with decreases in activating histone marks, and their inhibition revert these histone marks to resemble an open chromatin. Remarkably, specific inhibition of DNA methyltransferases is sufficient to upregulate inflammatory genes that are maintained in a silent state by SIRT1/2. Both SIRT1 and SIRT2 directly interact with DNMT3B, and their binding to proinflammatory genes is lost upon exposure to LPS or through pharmacological inhibition of their activity. In all, we describe a novel role for SIRT1/2 to restrict premature activation of proinflammatory genes

Vitamin C enhances NF-κB-driven epigenomic reprogramming and boosts the immunogenic properties of dendritic cells

Dendritic cells (DCs), the most potent antigen-presenting cells, are necessary for effective activation of naïve T cells. DCs' immunological properties are modulated in response to various stimuli. Active DNA demethylation is crucial for DC differentiation and function. Vitamin C, a known cofactor of ten-eleven translocation (TET) enzymes, drives active demethylation. Vitamin C has recently emerged as a promising adjuvant for several types of cancer; however, its effects on human immune cells are poorly understood. In this study, we investigate the epigenomic and transcriptomic reprogramming orchestrated by vitamin C in monocyte-derived DC differentiation and maturation. Vitamin C triggers extensive demethylation at NF-κB/p65 binding sites, together with concordant upregulation of antigen-presentation and immune response-related genes during DC maturation. p65 interacts with TET2 and mediates the aforementioned vitamin C-mediated changes, as demonstrated by pharmacological inhibition. Moreover, vitamin C increases TNFβ production in DCs through NF-κB, in concordance with the upregulation of its coding gene and the demethylation of adjacent CpGs. Finally, vitamin C enhances DC's ability to stimulate the proliferation of autologous antigen-specific T cells. We propose that vitamin C could potentially improve monocyte-derived DC-based cell therapies

SIRT1/2 orchestrate acquisition of DNA methylation and loss of histone H3 activating marks to prevent premature activation of inflammatory genes in macrophages

Altres ajuts: CERCA Programme/Generalitat de Catalunya; [...].Sirtuins 1 and 2 (SIRT1/2) are two NAD-dependent deacetylases with major roles in inflammation. In addition to deacetylating histones and other proteins, SIRT1/2-mediated regulation is coupled with other epigenetic enzymes. Here, we investigate the links between SIRT1/2 activity and DNA methylation in macrophage differentiation due to their relevance in myeloid cells. SIRT1/2 display drastic upregulation during macrophage differentiation and their inhibition impacts the expression of many inflammation-related genes. In this context, SIRT1/2 inhibition abrogates DNA methylation gains, but does not affect demethylation. Inhibition of hypermethylation occurs at many inflammatory loci, which results in more drastic upregulation of their expression upon macrophage polarization following bacterial lipopolysaccharide (LPS) challenge. SIRT1/2-mediated gains of methylation concur with decreases in activating histone marks, and their inhibition revert these histone marks to resemble an open chromatin. Remarkably, specific inhibition of DNA methyltransferases is sufficient to upregulate inflammatory genes that are maintained in a silent state by SIRT1/2. Both SIRT1 and SIRT2 directly interact with DNMT3B, and their binding to proinflammatory genes is lost upon exposure to LPS or through pharmacological inhibition of their activity. In all, we describe a novel role for SIRT1/2 to restrict premature activation of proinflammatory genes

Epigenetic and transcriptomic reprogramming in monocytes of severe COVID-19 patients reflects alterations in myeloid differentiation and the influence of inflammatory cytokines

COVID-19; Monocytes; Single-cell transcriptomicsCOVID-19; Monocitos; Transcriptómica unicelularCOVID-19; Monòcits; Transcriptòmica unicel·lularBackground COVID-19 manifests with a wide spectrum of clinical phenotypes, ranging from asymptomatic and mild to severe and critical. Severe and critical COVID-19 patients are characterized by marked changes in the myeloid compartment, especially monocytes. However, little is known about the epigenetic alterations that occur in these cells during hyperinflammatory responses in severe COVID-19 patients. Methods In this study, we obtained the DNA methylome and transcriptome of peripheral blood monocytes from severe COVID-19 patients. DNA samples extracted from CD14 + CD15- monocytes of 48 severe COVID-19 patients and 11 healthy controls were hybridized on MethylationEPIC BeadChip arrays. In parallel, single-cell transcriptomics of 10 severe COVID-19 patients were generated. CellPhoneDB was used to infer changes in the crosstalk between monocytes and other immune cell types. Results We observed DNA methylation changes in CpG sites associated with interferon-related genes and genes associated with antigen presentation, concordant with gene expression changes. These changes significantly overlapped with those occurring in bacterial sepsis, although specific DNA methylation alterations in genes specific to viral infection were also identified. We also found these alterations to comprise some of the DNA methylation changes occurring during myeloid differentiation and under the influence of inflammatory cytokines. A progression of DNA methylation alterations in relation to the Sequential Organ Failure Assessment (SOFA) score was found to be related to interferon-related genes and T-helper 1 cell cytokine production. CellPhoneDB analysis of the single-cell transcriptomes of other immune cell types suggested the existence of altered crosstalk between monocytes and other cell types like NK cells and regulatory T cells. Conclusion Our findings show the occurrence of an epigenetic and transcriptional reprogramming of peripheral blood monocytes, which could be associated with the release of aberrant immature monocytes, increased systemic levels of pro-inflammatory cytokines, and changes in immune cell crosstalk in these patients.This study has been funded by R+D+i project of the Spanish Ministry of Science and Innovation (grant number PID2020-117212RB-I00/ MICIN/AEI/10.13039/501100011033). We also thank the Chan Zuckerberg Initiative (grant 2020–216799) and Wellcome Sanger core funding (WT206194). This publication has also been supported by the Unstoppable campaign of the Josep Carreras Leukaemia Foundation. Additional funding comes from Project PI18/00346 (Instituto de Salud Carlos III and co-funded by European Union (ERDF/ESF ). A.B. received additional support from a Gates Cambridge Scholarship

JAK2-STAT Epigenetically Regulates Tolerized Genes in Monocytes in the First Encounter With Gram-Negative Bacterial Endotoxins in Sepsis

Metilación del ADN; Tolerancia a la endotoxina; MonocitosDNA methylation; Endotoxin tolerance; MonocytesMetilació de l'ADN; Tolerància a l'endotoxina; MonòcitsMicrobial challenges, such as widespread bacterial infection in sepsis, induce endotoxin tolerance, a state of hyporesponsiveness to subsequent infections. The participation of DNA methylation in this process is poorly known. In this study, we perform integrated analysis of DNA methylation and transcriptional changes following in vitro exposure to gram-negative bacterial lipopolysaccharide, together with analysis of ex vivo monocytes from septic patients. We identify TET2-mediated demethylation and transcriptional activation of inflammation-related genes that is specific to toll-like receptor stimulation. Changes also involve phosphorylation of STAT1, STAT3 and STAT5, elements of the JAK2 pathway. JAK2 pathway inhibition impairs the activation of tolerized genes on the first encounter with lipopolysaccharide. We then confirm the implication of the JAK2-STAT pathway in the aberrant DNA methylome of patients with sepsis caused by gram-negative bacteria. Finally, JAK2 inhibition in monocytes partially recapitulates the expression changes produced in the immunosuppressive cellular state acquired by monocytes from gram-negative sepsis, as described by single cell-RNA-sequencing. Our study evidences both the crucial role the JAK2-STAT pathway in epigenetic regulation and initial response of the tolerized genes to gram-negative bacterial endotoxins and provides a pharmacological target to prevent exacerbated responses.EB was funded by the Spanish Ministry of Science, Innovation and Universities (grant numbers SAF2017-88086-R & PID2020-117212RB-I00), and was cofunded by FEDER funds/European Regional Development Fund (ERDF) - a way to build Europe. OM-P holds an i-PFIS PhD fellowship (grant number IFI17/00034) from Acción Estratégica en Salud 2013-2016 ISCIII, cofinanced by the Fondo Social Europeo

Epigenomic Dynamics Associated with Myeloid Cell Immune Response Remodeling

Programa de Doctorat en Biomedicina[eng] Monocytes are highly plastic cells and possess the ability to differentiate into cell types with very different immunological properties. Depending on the external stimuli and the specific immune context, they can give rise to cells that promote immune responses or immune tolerance. These extracellular signals are recognized by specific receptors and integrated by signaling pathways which lead to the participation of transcription factors. Transcriptional remodeling promoted by these transcription factors is generally associated with epigenetic modifications such as histone modifications and DNA methylation. DNA methylation is crucial in the acquisition of immune cells' identity and function. In particular, DNA methylation changes in several human monocytes differentiation models have been previously described. In this thesis, the molecular mechanisms and epigenomic remodeling regulating the development of immunogenic or tolerogenic phenotypes of three clinically relevant monocyte-derived differentiation processes have been studied. Firstly, we investigated the transcriptomic and epigenomic remodeling associated with glucocorticoid-mediated monocyte differentiation to tolerogenic dendritic cells (tolDCs), a cell type that constitutes a potential treatment for various autoimmune diseases. We revealed a major role of MAFB in this process, in synergy with GR. Although both GR and MAFB interact with TET2 and can drive DNA demethylation, the role of MAFB is more extensive, binding to thousands of genomic loci in tolDCs. In this regard, we demonstrated that MAFB knockdown erases the tolerogenic properties of tolDCs and reverts the specific DNA demethylation and gene upregulation. Moreover, in vivo monocyte-derived cells from synovium in rheumatoid arthritis patients treated with glucocorticoids presented an expansion of ‘tolDC-like’ cells with upregulation of MAFB and MAFB target genes. Secondly, we analyzed the effects of vitamin C treatment during monocyte to dendritic cell (DC) differentiation and their subsequent maturation. DNA demethylation has been previously reported to be crucial in that process. Vitamin C is a known cofactor of TET enzymes, which are involved in active demethylation. We outlined extensive vitamin C-mediated demethylation, together with concordant gene expression changes during DC maturation. p65 ( NF-κB) interacts with TET2 and is associated with gene upregulation and DNA demethylation produced by vitamin C treatment. Finally, vitamin C increases TNFβ production and T cell stimulation capabilities of DCs. Thirdly, we integrated the DNA methylation and gene expression remodeling following in vitro exposure of human monocytes to lipopolysaccharide (LPS), a process that generates endotoxin tolerance, a state of hyporesponsiveness to further immune stimuli. In addition, we described phosphorylation of STAT1, STAT3, and STAT5, factors of the JAK2 pathway, after LPS treatment of monocytes. We identified TET2- mediated demethylation and gene upregulation during the first encounter with LPS associated with the JAK2-STAT signaling pathway. In addition, we found that JAK2 inhibition accentuates the tolerant phenotype of monocytes and reduces the expression of tolerized genes. Finally, monocytes from gram-negative septic patients showed lower levels of STAT1 phosphorylation after a second LPS challenge, indicating a reduced JAK2 activity.[cat] Els monòcits són cèl·lules plàstiques amb capacitat de diferenciació a tipus cel·lulars amb propietats immunològiques molt diferents. Depenent dels estímuls externs i del context immunològic, poden donar lloc a cèl·lules que promouen una resposta immunitària o tolerància. Aquests senyals extracelul·lars són reconeguts per receptors específics i integrats per vies de senyalització que condueixen a la participació de factors de transcripció. La remodelació transcripcional promoguda per aquests factors de transcripció s'associa generalment amb canvis epigenètics com a modificacions d'histones o la metilació del DNA. La metilació del DNA és crucial en l'adquisició de la identitat i la funció de les cèl·lules immunitàries. En particular, s'han descrit canvis en la metilació del DNA en diversos models de diferenciació de monòcits humans. En aquesta tesi, hem estudiat els mecanismes moleculars i la remodelació epigenòmica que regulen el desenvolupament de fenotips inmunogènics o tolerogènics de tres processos de diferenciació de monòcits clínicament rellevants. En primer lloc, hem investigat la remodelació transcriptòmica i epigenòmica associada a la diferenciació de monòcits a cèl·lules dendrítiques tolerogèniques (tolDC) amb glucocorticoides, un tipus cel·lular que constitueix un tractament potencial per a diverses malalties autoimmunes. MAFB té un paper fonamental en aquest procés, en sinergia amb GR. Encara que tant GR com MAFB interactuen amb TET2 i poden promoure la desmetilació del DNA, el paper de MAFB és més ampli, ja que s'uneix a milers de loci en el genoma de les tolDC. En aquest sentit, hem demostrat que l'eliminació de MAFB reverteix les propietats tolerogèniques de les tolDC, la desmetilació específica del DNA i la regulació dels gens. A més, les cèl·lules derivades de monòcits in vivo obtingudes de membrana sinovial de pacients amb artritis reumatoide tractats amb glucocorticoides van presentar una expansió de cèl·lules similars a les tolDC amb una alta expressió tant de MAFB com dels seus gens diana. En segon lloc, hem analitzat els efectes del tractament amb vitamina C durant la diferenciació de monòcits a cèl·lules dendrítiques (DC) i la seua posterior maduració. La desmetilació del DNA ha sigut prèviament descrita com a crucial en aquest procés. La vitamina C és un cofactor conegut dels enzims TET, que participen en la desmetilació activa. En aquest sentit, hem descrit una àmplia desmetilació mediada per la vitamina C, juntament amb canvis concordants en l'expressió gènica durant la maduració de les DCs. p65 (NF-κB) interactua amb TET2 i s'associa amb la inducció de gens i la desmetilació del DNA produïda pel tractament amb vitamina C. Finalment, la vitamina C augmenta la producció de TNFβ i la capacitat d'estimulació de cèl·lules T de les DC. En tercer lloc, hem integrat la metilació del DNA i la remodelació de l'expressió gènica després de l'exposició in vitro de monòcits humans a lipopolisacàrid (LPS), un procés que genera un tipus de memòria immunitària innata denominat tolerància a endotoxines, el qual constitueix un estat hiporesponsiu a nous estímuls immunitaris. A més, hem descrit la fosforilació de STAT1, STAT3 i STAT5, elements associats amb JAK2, després del tractament dels monòcits amb LPS. Durant la primera exposició dels monòcits a LPS, hem trobat desmetilació mediada per TET2 i inducció de gens associats a JAK2-STAT. Addicionalment, hem descrit que la inhibició de JAK2 accentua la tolerància en els monòcits i redueix l'expressió dels gens toleritzats. Finalment, monòcits de pacients sèptics infectats amb bacteris gramnegatius van mostrar menors nivells de fosforilació de STAT1 després d'un segon tractament amb LPS, indicant que presenten una menor activitat de JAK2.[spa] Los monocitos son células plásticas con capacidad de diferenciación a tipos celulares con propiedades inmunológicas muy diferentes. Dependiendo de los estímulos externos y del contexto inmunológico, pueden dar lugar a células que promuevan una respuesta inmunitaria o tolerancia. Estas señales extracelulares son reconocidas por receptores específicos e integradas por vías de señalización que conducen a la participación de factores de transcripción. La remodelación transcripcional promovida por estos factores de transcripción se asocia generalmente con cambios epigenéticos como modificaciones de histonas o la metilación del DNA. La metilación del DNA es crucial en la adquisición de la identidad y la función de las células inmunitarias. En particular, se han descrito cambios en la metilación del DNA en varios modelos de diferenciación de monocitos humanos. En esta tesis, hemos estudiado los mecanismos moleculares y la remodelación epigenómica que regulan el desarrollo de fenotipos inmunogénicos o tolerogénicos de tres procesos de diferenciación de monocitos clínicamente relevantes. En primer lugar, hemos investigado la remodelación transcriptómica y epigenómica asociada a la diferenciación de monocitos a células dendríticas tolerogénicas (tolDC) con glucocorticoides, un tipo celular que constituye un tratamiento potencial para varias enfermedades autoinmunes. MAFB tiene un papel fundamental en este proceso, en sinergia con GR. Aunque tanto GR como MAFB interactúan con TET2 y pueden promover la desmetilación del DNA, el papel de MAFB es más amplio, ya que se une a miles de loci en el genoma de las tolDC. En este sentido, hemos demostrado que la eliminación de MAFB borra las propiedades tolerogénicas de las tolDC y revierte la desmetilación específica del DNA y la regulación de los genes. Además, las células derivadas de monocitos in vivo, obtenidas de membrana sinovial de pacientes con artritis reumatoide tratados con glucocorticoides presentaron una expansión de células similares a las tolDC con una alta expresión tanto de MAFB como de sus genes diana. En segundo lugar, hemos analizado los efectos del tratamiento con vitamina C durante la diferenciación de monocitos a células dendríticas (DC) y su posterior maduración. La desmetilación del DNA ha sido previamente descrita como crucial en ese proceso. La vitamina C es un cofactor conocido de las enzimas TET, que participan en la desmetilación activa. En este sentido, hemos descrito una amplia desmetilación mediada por la vitamina C, junto con cambios concordantes en la expresión génica durante la maduración de las DC. p65 (NF-κB) interactúa con TET2 y se asocia con la inducción de genes y la desmetilación del DNA producida por el tratamiento con vitamina C. Por último, la vitamina C aumenta la producción de TNFβ y la capacidad de estimulación de células T de las DC. En tercer lugar, hemos integrado la metilación del DNA y la remodelación de la expresión génica tras la exposición in vitro de monocitos humanos a lipopolisacárido (LPS), un proceso que genera un tipo de memoria immune innata denominado tolerancia a endotoxinas, el cual constituye un estado hiporesponsivo a nuevos estímulos inmunitarios. Además, hemos descrito la fosforilación de STAT1, STAT3 y STAT5, factores asociados con JAK2, tras el tratamiento de los monocitos con LPS. Durante la primera exposición de los monocitos a LPS, encontramos desmetilación mediada por TET2 e inducción de genes asociados a JAK2-STAT. Adicionalmente, encontramos que la inhibición de JAK2 acentúa la tolerancia en los monocitos y reduce la expresión de los genes tolerizados. Por último, monocitos de pacientes sépticos gram- negativos mostraron menores niveles de fosforilación de STAT1 tras un segundo tratamiento con LPS, lo cual indica que presentan una menor actividad de JAK2

Epigenomic Dynamics Associated with Myeloid Cell Immune Response Remodeling

[eng] Monocytes are highly plastic cells and possess the ability to differentiate into cell types with very different immunological properties. Depending on the external stimuli and the specific immune context, they can give rise to cells that promote immune responses or immune tolerance. These extracellular signals are recognized by specific receptors and integrated by signaling pathways which lead to the participation of transcription factors. Transcriptional remodeling promoted by these transcription factors is generally associated with epigenetic modifications such as histone modifications and DNA methylation. DNA methylation is crucial in the acquisition of immune cells' identity and function. In particular, DNA methylation changes in several human monocytes differentiation models have been previously described. In this thesis, the molecular mechanisms and epigenomic remodeling regulating the development of immunogenic or tolerogenic phenotypes of three clinically relevant monocyte-derived differentiation processes have been studied. Firstly, we investigated the transcriptomic and epigenomic remodeling associated with glucocorticoid-mediated monocyte differentiation to tolerogenic dendritic cells (tolDCs), a cell type that constitutes a potential treatment for various autoimmune diseases. We revealed a major role of MAFB in this process, in synergy with GR. Although both GR and MAFB interact with TET2 and can drive DNA demethylation, the role of MAFB is more extensive, binding to thousands of genomic loci in tolDCs. In this regard, we demonstrated that MAFB knockdown erases the tolerogenic properties of tolDCs and reverts the specific DNA demethylation and gene upregulation. Moreover, in vivo monocyte-derived cells from synovium in rheumatoid arthritis patients treated with glucocorticoids presented an expansion of ‘tolDC-like’ cells with upregulation of MAFB and MAFB target genes. Secondly, we analyzed the effects of vitamin C treatment during monocyte to dendritic cell (DC) differentiation and their subsequent maturation. DNA demethylation has been previously reported to be crucial in that process. Vitamin C is a known cofactor of TET enzymes, which are involved in active demethylation. We outlined extensive vitamin C-mediated demethylation, together with concordant gene expression changes during DC maturation. p65 ( NF-κB) interacts with TET2 and is associated with gene upregulation and DNA demethylation produced by vitamin C treatment. Finally, vitamin C increases TNFβ production and T cell stimulation capabilities of DCs. Thirdly, we integrated the DNA methylation and gene expression remodeling following in vitro exposure of human monocytes to lipopolysaccharide (LPS), a process that generates endotoxin tolerance, a state of hyporesponsiveness to further immune stimuli. In addition, we described phosphorylation of STAT1, STAT3, and STAT5, factors of the JAK2 pathway, after LPS treatment of monocytes. We identified TET2- mediated demethylation and gene upregulation during the first encounter with LPS associated with the JAK2-STAT signaling pathway. In addition, we found that JAK2 inhibition accentuates the tolerant phenotype of monocytes and reduces the expression of tolerized genes. Finally, monocytes from gram-negative septic patients showed lower levels of STAT1 phosphorylation after a second LPS challenge, indicating a reduced JAK2 activity.[cat] Els monòcits són cèl·lules plàstiques amb capacitat de diferenciació a tipus cel·lulars amb propietats immunològiques molt diferents. Depenent dels estímuls externs i del context immunològic, poden donar lloc a cèl·lules que promouen una resposta immunitària o tolerància. Aquests senyals extracelul·lars són reconeguts per receptors específics i integrats per vies de senyalització que condueixen a la participació de factors de transcripció. La remodelació transcripcional promoguda per aquests factors de transcripció s'associa generalment amb canvis epigenètics com a modificacions d'histones o la metilació del DNA. La metilació del DNA és crucial en l'adquisició de la identitat i la funció de les cèl·lules immunitàries. En particular, s'han descrit canvis en la metilació del DNA en diversos models de diferenciació de monòcits humans. En aquesta tesi, hem estudiat els mecanismes moleculars i la remodelació epigenòmica que regulen el desenvolupament de fenotips inmunogènics o tolerogènics de tres processos de diferenciació de monòcits clínicament rellevants. En primer lloc, hem investigat la remodelació transcriptòmica i epigenòmica associada a la diferenciació de monòcits a cèl·lules dendrítiques tolerogèniques (tolDC) amb glucocorticoides, un tipus cel·lular que constitueix un tractament potencial per a diverses malalties autoimmunes. MAFB té un paper fonamental en aquest procés, en sinergia amb GR. Encara que tant GR com MAFB interactuen amb TET2 i poden promoure la desmetilació del DNA, el paper de MAFB és més ampli, ja que s'uneix a milers de loci en el genoma de les tolDC. En aquest sentit, hem demostrat que l'eliminació de MAFB reverteix les propietats tolerogèniques de les tolDC, la desmetilació específica del DNA i la regulació dels gens. A més, les cèl·lules derivades de monòcits in vivo obtingudes de membrana sinovial de pacients amb artritis reumatoide tractats amb glucocorticoides van presentar una expansió de cèl·lules similars a les tolDC amb una alta expressió tant de MAFB com dels seus gens diana. En segon lloc, hem analitzat els efectes del tractament amb vitamina C durant la diferenciació de monòcits a cèl·lules dendrítiques (DC) i la seua posterior maduració. La desmetilació del DNA ha sigut prèviament descrita com a crucial en aquest procés. La vitamina C és un cofactor conegut dels enzims TET, que participen en la desmetilació activa. En aquest sentit, hem descrit una àmplia desmetilació mediada per la vitamina C, juntament amb canvis concordants en l'expressió gènica durant la maduració de les DCs. p65 (NF-κB) interactua amb TET2 i s'associa amb la inducció de gens i la desmetilació del DNA produïda pel tractament amb vitamina C. Finalment, la vitamina C augmenta la producció de TNFβ i la capacitat d'estimulació de cèl·lules T de les DC. En tercer lloc, hem integrat la metilació del DNA i la remodelació de l'expressió gènica després de l'exposició in vitro de monòcits humans a lipopolisacàrid (LPS), un procés que genera un tipus de memòria immunitària innata denominat tolerància a endotoxines, el qual constitueix un estat hiporesponsiu a nous estímuls immunitaris. A més, hem descrit la fosforilació de STAT1, STAT3 i STAT5, elements associats amb JAK2, després del tractament dels monòcits amb LPS. Durant la primera exposició dels monòcits a LPS, hem trobat desmetilació mediada per TET2 i inducció de gens associats a JAK2-STAT. Addicionalment, hem descrit que la inhibició de JAK2 accentua la tolerància en els monòcits i redueix l'expressió dels gens toleritzats. Finalment, monòcits de pacients sèptics infectats amb bacteris gramnegatius van mostrar menors nivells de fosforilació de STAT1 després d'un segon tractament amb LPS, indicant que presenten una menor activitat de JAK2.[spa] Los monocitos son células plásticas con capacidad de diferenciación a tipos celulares con propiedades inmunológicas muy diferentes. Dependiendo de los estímulos externos y del contexto inmunológico, pueden dar lugar a células que promuevan una respuesta inmunitaria o tolerancia. Estas señales extracelulares son reconocidas por receptores específicos e integradas por vías de señalización que conducen a la participación de factores de transcripción. La remodelación transcripcional promovida por estos factores de transcripción se asocia generalmente con cambios epigenéticos como modificaciones de histonas o la metilación del DNA. La metilación del DNA es crucial en la adquisición de la identidad y la función de las células inmunitarias. En particular, se han descrito cambios en la metilación del DNA en varios modelos de diferenciación de monocitos humanos. En esta tesis, hemos estudiado los mecanismos moleculares y la remodelación epigenómica que regulan el desarrollo de fenotipos inmunogénicos o tolerogénicos de tres procesos de diferenciación de monocitos clínicamente relevantes. En primer lugar, hemos investigado la remodelación transcriptómica y epigenómica asociada a la diferenciación de monocitos a células dendríticas tolerogénicas (tolDC) con glucocorticoides, un tipo celular que constituye un tratamiento potencial para varias enfermedades autoinmunes. MAFB tiene un papel fundamental en este proceso, en sinergia con GR. Aunque tanto GR como MAFB interactúan con TET2 y pueden promover la desmetilación del DNA, el papel de MAFB es más amplio, ya que se une a miles de loci en el genoma de las tolDC. En este sentido, hemos demostrado que la eliminación de MAFB borra las propiedades tolerogénicas de las tolDC y revierte la desmetilación específica del DNA y la regulación de los genes. Además, las células derivadas de monocitos in vivo, obtenidas de membrana sinovial de pacientes con artritis reumatoide tratados con glucocorticoides presentaron una expansión de células similares a las tolDC con una alta expresión tanto de MAFB como de sus genes diana. En segundo lugar, hemos analizado los efectos del tratamiento con vitamina C durante la diferenciación de monocitos a células dendríticas (DC) y su posterior maduración. La desmetilación del DNA ha sido previamente descrita como crucial en ese proceso. La vitamina C es un cofactor conocido de las enzimas TET, que participan en la desmetilación activa. En este sentido, hemos descrito una amplia desmetilación mediada por la vitamina C, junto con cambios concordantes en la expresión génica durante la maduración de las DC. p65 (NF-κB) interactúa con TET2 y se asocia con la inducción de genes y la desmetilación del DNA producida por el tratamiento con vitamina C. Por último, la vitamina C aumenta la producción de TNFβ y la capacidad de estimulación de células T de las DC. En tercer lugar, hemos integrado la metilación del DNA y la remodelación de la expresión génica tras la exposición in vitro de monocitos humanos a lipopolisacárido (LPS), un proceso que genera un tipo de memoria immune innata denominado tolerancia a endotoxinas, el cual constituye un estado hiporesponsivo a nuevos estímulos inmunitarios. Además, hemos descrito la fosforilación de STAT1, STAT3 y STAT5, factores asociados con JAK2, tras el tratamiento de los monocitos con LPS. Durante la primera exposición de los monocitos a LPS, encontramos desmetilación mediada por TET2 e inducción de genes asociados a JAK2-STAT. Adicionalmente, encontramos que la inhibición de JAK2 acentúa la tolerancia en los monocitos y reduce la expresión de los genes tolerizados. Por último, monocitos de pacientes sépticos gram- negativos mostraron menores niveles de fosforilación de STAT1 tras un segundo tratamiento con LPS, lo cual indica que presentan una menor actividad de JAK2

Understanding the relevance of DNA methylation changes in immune differentiation and disease

Altres ajuts: We thank CERCA Programme/Generalitat de Catalunya and Josep Carreras Foundation for institutional support. E.B. was funded by [...] and was co-funded by FEDER funds/European Regional Development Fund (ERDF)-a way to build Europe.Immune cells are one of the most complex and diverse systems in the human organism. Such diversity implies an intricate network of different cell types and interactions that are dependently interconnected. The processes by which different cell types differentiate from progenitors, mature, and finally exert their function requires an orchestrated succession of molecular processes that determine cell phenotype and function. The acquisition of these phenotypes is highly dependent on the establishment of unique epigenetic profiles that confer identity and function on the various types of effector cells. These epigenetic mechanisms integrate microenvironmental cues into the genome to establish specific transcriptional programs. Epigenetic modifications bridge environment and genome regulation and play a role in human diseases by their ability to modulate physiological programs through external stimuli. DNA methylation is one of the most ubiquitous, stable, and widely studied epigenetic modifications. Recent technological advances have facilitated the generation of a vast amount of genome-wide DNA methylation data, providing profound insights into the roles of DNA methylation in health and disease. This review considers the relevance of DNA methylation to immune system cellular development and function, as well as the participation of DNA methylation defects in immune-mediated pathologies, illustrated by selected paradigmatic diseases