Refinement of experimental models aiming at reducing both animal suffering and variability of the pharmacological response

Orientador: João Ernesto de CarvalhoTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: Aliviar a dor e o sofrimento dos animais de laboratório é ético, humanitário e promove boa ciência. A inclusão de agentes supressores da dor em modelos farmacológicos, entretanto, requer detalhada pesquisa envolvendo as diversas opções de analgésicos ou anestésicos a fim de minimizar o estresse do animal experimental sem interferir negativamente no resultado da pesquisa. Utilizando o conceito de refinamento lançado por Russell e Burch na década de 50, o presente projeto tem por objetivo principal propor modificações em modelos experimentais de atividade secretora gástrica, inflamação e câncer, através do tratamento da dor e/ou estresse inerentes à metodologia em questão. No modelo de ligadura de piloro em ratos foi possível observar os benefícios decorrentes da supressão da dor nos dados experimentais através do uso de anestesia geral durante todo o período de teste. Tal medida de refinamento permitiu a redução da variabilidade da resposta intragrupo, a redução do número de animais utilizados, maior facilidade na execução dos procedimentos trans e pós-cirúrgico e, finalmente, a eliminação do sofrimento animal de forma significativa. O teste de edema de pata em ratos, quando utilizado apenas para a avaliação de possível atividade anti-inflamatória ¿ e não antinociceptiva ¿ provoca dor intensa nos animais em decorrência da inoculação do agente flogístico. Neste modelo foi proposto, portanto, a redução do sofrimento animal através do uso de anestésicos gerais e locais. O bloqueio do nervo ciático visando a eliminação da dor provocada pela inflamação induzida por carragenina não comprometeu a evolução do edema de pata em ratos, embora análises específicas de citocinas inflamatórias ainda sejam necessárias. Outro modelo experimental que possui a dor como subproduto não avaliado é o tumor de Ehrlich, frequentemente utilizado para a investigação de propriedades anticâncer de novos compostos. Em sua forma sólida, tanto em pata como em dorso, foi sugerido o uso de analgésicos opióides e enriquecimento ambiental, respectivamente. Em tumor de Ehrlich de flanco, a inclusão de tubos de PVC não ofereceu prejuízo à qualidade dos dados experimentais gerados, corroborando a tendência atual de inclusão desta forma de refinamento. Por sua vez, em modelo de Ehrlich de pata, o uso diário de morfina foi responsável por um melhor estado clínico dos animais, além de atuar de forma sinérgica com o quimioterápico na redução da massa tumoral. Como conclusão, o estresse decorrente dos procedimentos experimentais representa importante viés na pesquisa, influenciando tanto o bem-estar dos animais experimentais como a qualidade dos dados geradosAbstract: Relieving pain and suffering from laboratory animals is ethical, humane and promotes good quality science. The inclusion of pain suppressors to pharmacological models, however, requires detailed research involving the various choices of analgesic drugs or anesthetics in order to minimize animal discomfort without impairing the parameters to be evaluated. Based on the concept of refinement introduced by Russell and Burch in the fifties, our project aims to propose modifications in three pharmacological experimental models: gastric secretion, inflammation and cancer. In the gastric secretion model in rats, it was possible to observe the benefits due to the use of general anesthesia during the entire experimental period. Such a refinement technique helped reduce the variability of intra-group response, the number of animals used, improved the execution of surgical procedures and, finally, decreased animal suffering significantly. The results obtained encouraged us to investigate the use of pain killers in other pharmacological models. The paw edema test in rats, for example, when used for assessing only the anti-inflammatory activity ¿ not the antinociceptive one ¿ causes intense pain due to the injection of the phlogistic agent. In this case, therefore, we propose the reduction of animal suffering through the use of anesthesia. Another experimental model in which pain is a non-evaluated byproduct involves the Ehrlich tumor, often used for the study of anticancer properties of a given substance. In both solid forms, either in the hind paw or the flank, we suggest the inclusion of opioid analgesic drugs or environmental enrichment, respectively. As a whole, this project is based on the investigation of the benefits of pain/stress relieving agents in the pharmacological models mentioned above. The refinement of the experimental protocols will be recommended in cases where benefits are not followed by any damage to relevant parametersDoutoradoClinica MedicaDoutora em Ciência

Efeito de fermentado (utilizado como alimento funcional) sobre: a citoproteção gástrica, atividade anti-secretória e a motilidade intestinal em animais

Objetivo: Confirmar o mecanismo de ação do fermentado, através da quantificação do muco gastroprotetor e da produção de secreção gástrica ácida em ratos Wistar, além de verificar a interferência na motilidade gastrointestinal em camundongos. Métodos: Nesse estudo foi inicialmente utilizado o modelo de indução de úlcera com administração de solução salina (10mL/kg de peso) como controle negativo, carbenoxolona (200 mg/kg) como controle positivo e o produto fermentado em pó na dose de 2000 mg/kg de peso animal. Em seguida foi utilizado o modelo para determinação quantitativa do muco gastroprotetor e atividade anti-secretória em ratos. Para avaliação da atividade sobre a motilidade intestinal em camundongos cada grupo de animais recebeu, por via oral, solução salina (10mL/kg) como controle negativo, atropina (3mg/kg) como controle positivo e o produto fermentado em pó na dose de 2000mg/kg de peso corporal animal. Resultados: O fermentado apresentou atividade antiulcerogênica de 57,1% e a carbenoxolona de 92,3%. Para a confirmação do mecanismo de ação via prostaglandinas foi realizado a quantificação do muco gástrico no qual o fermentado foi capaz de aumentá-lo em 48,9% e a carbenoxolona em 108,6%. Na avaliação da atividade antisecretória em ratos e da motilidade intestinal em camundongos o fermentado não interferiu na secreção acida gástrica e na motilidade. Conclusão: Com base nos dados obtidos nesse experimento com ratos e camundongos, concluiu-se que o fermentado provavelmente promove a citoproteção da mucosa gástrica, através do aumento da produção de muco gastroprotetor especialmente por meio dos níveis de prostaglandinas

Phytochemical analysis and antifungal activity of extracts from leaves and fruit residues of brazilian savanna plants aiming its use as safe fungicides

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)The increasing demand for safe food without preservatives or pesticides residues has encouraged several studies on natural products with antifungal activity and low toxicity. In this study, ethanolic extracts from leaves and fruit residues (peel and seeds) of three Brazilian savanna species (Acrocomia aculeata, Campomanesia adamantium and Caryocar brasiliense) were evaluated against phytopathogenic fungi. Additionally, the most active extract was chemically characterized by ESI-MS and its oral acute toxicity was evaluated. Extracts from C. brasiliense (pequi) peel and leaves were active against Alternaria alternata, Alternaria solani and Venturia pirina with minimal inhibitory concentrations between 350 and 1000 mu g/mL. When incorporated in solid media, these extracts extended the lag phase of A. alternata and A. solani and reduced the growth rate of A. solani. Pequi peel extract showed better antifungal activity and their ESI-MS analysis revealed the presence of substances widely reported as antifungal such as gallic acid, quinic acid, ellagic acid, glucogalin and corilagin. The oral acute toxicity was relatively low, being considered safe for use as a potential natural fungicide. [GRAPHICS] .The increasing demand for safe food without preservatives or pesticides residues has encouraged several studies on natural products with antifungal activity and low toxicity. In this study, ethanolic extracts from leaves and fruit residues (peel and seeds6195204FAPESP - FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULOFundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)2011/19057-7; 2012/21395-0We are grateful to São Paulo Research Foundation for the financial support of this research and for the fellowships awarded to C.A.B. (FAPESP No. 2011/19057-7) and G.A.B. (FAPESP No. 2012/21395-0) and to Study Group of Cerrado Agro-industrial Processes (

Chitosan-tripolyphosphate Nanoparticles As Arrabidaea Chica Standardized Extract Carrier: Synthesis, Characterization, Biocompatibility, And Antiulcerogenic Activity.

Natural products using plants have received considerable attention because of their potential to treat various diseases. Arrabidaea chica (Humb. & Bonpl.) B. Verlot is a native tropical American vine with healing properties employed in folk medicine for wound healing, inflammation, and gastrointestinal colic. Applying nanotechnology to plant extracts has revealed an advantageous strategy for herbal drugs considering the numerous features that nanostructured systems offer, including solubility, bioavailability, and pharmacological activity enhancement. The present study reports the preparation and characterization of chitosan-sodium tripolyphosphate nanoparticles (NPs) charged with A. chica standardized extract (AcE). Particle size and zeta potential were measured using a Zetasizer Nano ZS. The NP morphological characteristics were observed using scanning electron microscopy. Our studies indicated that the chitosan/sodium tripolyphosphate mass ratio of 5 and volume ratio of 10 were found to be the best condition to achieve the lowest NP sizes, with an average hydrodynamic diameter of 150±13 nm and a zeta potential of +45±2 mV. Particle size decreased with AcE addition (60±10.2 nm), suggesting an interaction between the extract's composition and polymers. The NP biocompatibility was evaluated using human skin fibroblasts. AcE-NP demonstrated capability of maintaining cell viability at the lowest concentrations tested, stimulating cell proliferation at higher concentrations. Antiulcerogenic activity of AcE-NP was also evaluated with an acute gastric ulcer experimental model induced by ethanol and indomethacin. NPs loaded with A. chica extract reduced the ulcerative lesion index using lower doses compared with the free extract, suggesting that extract encapsulation in chitosan NPs allowed for a dose reduction for a gastroprotective effect. The AcE encapsulation offers an approach for further application of the A. chica extract that could be considered a potential candidate for ulcer-healing pharmaceutical systems.103897-390

Sleep pattern and learning in knockdown mice with reduced cholinergic neurotransmission

Impaired cholinergic neurotransmission can affect memory formation and influence sleep-wake cycles (SWC). In the present study, we describe the SWC in mice with a deficient vesicular acetylcholine transporter (VAChT) system, previously characterized as presenting reduced acetylcholine release and cognitive and behavioral dysfunctions. Continuous, chronic ECoG and EMG recordings were used to evaluate the SWC pattern during light and dark phases in VAChT knockdown heterozygous (VAChT-KDHET, n=7) and wild-type (WT, n=7) mice. SWC were evaluated for sleep efficiency, total amount and mean duration of slow-wave, intermediate and paradoxical sleep, as well as the number of awakenings from sleep. After recording SWC, contextual fear-conditioning tests were used as an acetylcholine-dependent learning paradigm. The results showed that sleep efficiency in VAChT-KDHET animals was similar to that of WT mice, but that the SWC was more fragmented. Fragmentation was characterized by an increase in the number of awakenings, mainly during intermediate sleep. VAChT-KDHET animals performed poorly in the contextual fear-conditioning paradigm (mean freezing time: 34.4±3.1 and 44.5±3.3 s for WT and VAChT-KDHET animals, respectively), which was followed by a 45% reduction in the number of paradoxical sleep episodes after the training session. Taken together, the results show that reduced cholinergic transmission led to sleep fragmentation and learning impairment. We discuss the results on the basis of cholinergic plasticity and its relevance to sleep homeostasis. We suggest that VAChT-KDHET mice could be a useful model to test cholinergic drugs used to treat sleep dysfunction in neurodegenerative disorders.Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Departamento de FisiologiaUniversidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Departamento de PsicobiologiaUniversidade Federal do Rio Grande do Norte Instituto do CerebroUniversidade Federal do ABC Computacao e Cognicao Centro de MatematicaUniversidade Federal de Minas Gerais Departamento de Fisiologia e Biofisica Nucleo de NeurocienciasUniversity of Western Ontario Department of Physiology and Pharmacology and Department of Anatomy and Cell Biology Robarts Research InstituteUNIFESP, Depto. de FisiologiaUNIFESP, Depto. de PsicobiologiaSciEL

"TK3" : association between L-tryptophan and thymine toxicological and pharmacological studies

Orientadores: João Ernesto de Carvalho, Ana Lucia Tasca Gois RuizDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias MedicasResumo: O complemento nutricional ¿TK3¿ foi inicialmente estudado por um bioquímico alemão, Sr. Friedrich Lavitcshka, que desenvolveu uma formulação em 1969, inicialmente líquida, constituída basicamente pela associação de triptofano e timina. Seus estudos em modelos experimentais de tumores de pele induzidos por alcatrão em ratos não foram publicados. Entretanto, seus resultados, bem como relatos de casos provenientes do uso informal de tal suplementação, apontavam para efeitos benéficos superiores ao de um mero complemento nutricional ou ¿fortificante¿, como se costumava denominar tal categoria de substâncias. A avaliação toxicológica deste complemento, como parte inicial deste estudo pré-clínico, revelou: 1. Estudos ¿in vitro¿: atividade não citotóxica de ¿TK3¿ em cultura de células humanas normais ¿ fibroblastos ¿ e tumorais; 2. Estudos agudos ¿in vivo¿: a administração aguda de ¿TK3¿ (5 g/Kg, p.o. e 2g/Kg, i.p.) em ratos Wistar não produziu quaisquer sinais clínicos de toxicidade. A análise macroscópica dos órgãos destes animais experimentais não revelou quaisquer alterações sugestivas de toxicidade; 3. Estudos sub-crônicos ¿in vivo¿: a administração doses-repetidas 90 dias de ¿TK3¿ (100 mg/Kg, 300 mg/Kg e 1000 mg/Kg, p.o.) em ratos Wistar de ambos os sexos igualmente não revelou quaisquer sinais de toxicidade, confirmados pela análise macroscópica dos órgãos. Finalmente, as análises hematológicas e bioquímicas não identificaram alterações indicativas de toxicidade. A triagem farmacológica deste complemento revelou: 1. Em modelo de úlcera induzida por etanol em ratos , o tratamento com ¿TK3¿ (1000 mg/Kg, p.o.) reduziu o índice de lesão ulcerativa (86.2%). Esta atividade antiulcerogênica foi superior àquela apresentada pela administração dos componentes isoladamente (triptofano: 400mg/Kg [61.5%] e timina: 400 mg/Kg [+30.8%]); 2. Na avaliação da atividade antisecretora, em modelo de ligadura de piloro por 4 horas, a administração intraduodenal de ¿TK3¿ (1000 mg/Kg, p.o.) não reduziu o volume, nem a acidez total e nem aumentou o pH da secreção ácida gástrica basal; 3. Na triagem dos mecanismos de citoproteção gástrica, o pré-tratamento de ratos com indometacina (5 mg/Kg, p.o.) não inibiu o efeito protetor do ¿TK3¿ (1000 mg/Kg, p.o.) nas lesões induzidas por etanol; 4. O pré-tratamento de ratos com L-NAME (5 mg/Kg, i.v.) não inibiu o efeito protetor do ¿TK3¿ (1000 mg/Kg, p.o.) nas lesões induzidas por etanol; 5. Finalmente, o pré-tratamento de ratos com NEM (10 mg/Kg, s.c.) foi capaz de inibir em 50% o efeito protetor do ¿TK3¿ (1000 mg/Kg, p.o.) nas lesões induzidas por etanol, sugerindo a participação de compostos contendo grupos sulfidrila no mecanismo de ação do referido complementoAbstract: The nutritional supplement ¿TK3¿ was originally studied by a German biochemist, Mr. Friedrich Lavitcshka, who first associated L-tryptophan and thymine, in a liquid formula, in 1969. His early studies using experimental tar-induced skin cancer models were not published even though they seemed to confirm the benefits reported by informal use of such association at that time. These reports suggested some pharmacological effects beyond the nutritional one. The toxicological evaluation of this new association of substances, as part of its pre-clinical trial, revealed: 1. ¿In vitro¿ studies: no citotoxicity activity of ¿TK3¿ on normal (fibroblasts) and cancer human cells; 2. ¿In vivo¿ acute studies: acute administration of ¿TK3¿ (5 g/Kg, p.o. and 2g/Kg, i.p.) in Wistar rats revealed no signs of systemic toxicity or impending death; 3. ¿in vivo¿ sub-chronic studies: 90 day repeated-dose study of ¿TK3¿ (100 mg/Kg, 300 mg/Kg and 1000 mg/Kg, p.o.) in Wistar rats of both sexes revealed no clinical signs of toxicity, confirmed by both histopathological and biochemical analysis. The pharmacological screening of this nutritional supplement revealed: 1. In the ethanol-induced gastric ulcer experimental model in rats, the treatment with ¿TK3¿ (1000mg/Kg, p.o.) reduced the ulcerative ulcer index (86.2%). This antiulcerogenic activity was superior to the ones presented by the isolated components administrated individually (L-tryptophan: 400mg/Kg [61.5%] and thymine: 400mg/Kg [+30.8%]); 2. In the evaluation of gastric secretion through pyloric ligation model in rats, the treatment with ¿TK3¿ (1000 mg/Kg, i.d.) had no significant effect over the gastric juice volume, nor the pH or hydrogenionic concentration of gastric content; 3. In the evaluation of possible gastric cytoprotective mechanisms of action, pre-treatment of experimental rats with indomethacin (5 mg/Kg, p.o.) did not inhibit the antiulcerogenic effect of ¿TK3¿ (1000 mg/Kg, p.o.) in the ethanol induced ulcer model; 4. Similarly, pre-treatment of experimental rats with L-NAME (5 mg/Kg, i.v.) did not inhibit the antiulcerogenic effect of ¿TK3¿ (1000 mg/Kg, p.o.) in the ethanol induced ulcer model; 5. Finally, pre-treatment of experimental rats with NEM (10 mg/Kg, s.c.) decreased 50% of the antiulcerogenic effect of ¿TK3¿ (1000 mg/Kg, p.o.) in the ethanol induced ulcer model, suggesting the participation of endogenous non-protein SH-containing compounds. However, as this reduction was not complete, there seems to be more aspects involved in this mechanism of actionMestradoCiencias BasicasMestre em Clinica Medic

Antioxidant capacity and pharmacologic screening of crude extracts of Byrsonima crassifolia and Inga edulis leaves

In order to evaluate the effect of two Amazonian species on chronic diseases linked with the oxidative processes, we performed antioxidant capacity analyses (Oxygen Radical Absorbance Capacity - ORAC and Folin-Ciocalteu - PT assays) and pharmacological effects in vitro (antiproliferative effect) and in vivo (antinociceptive, antiinflammatory, antiulcerogenic effects) for ethanolic extracts (65:35; v/v; ethanol:water) from Byrsonima crassifolia (BC) and Inga edulis (IE) leaves. Both BC and IE extracts showed high ORAC values (1,422 and 694 mmol of Trolox equivalent/g of dry leaf, respectively) and high PT contents (35.93 and 24.50 mg gallic acid equivalent g-1 dry leaf, respectively). The ORAC values had no correlation with PT, suggesting the presence of other chemical groups in the antioxidant activity value. The two extracts did not present significant antiproliferative activity on nine lines of human tumor cells, and cytotoxic effect was detected only at the highest concentration. The antinociceptive effect was investigated using the hot plate test, and IE extract presented a longer latency (P < 0.05) 30 and 60 min after oral administration. The antiinflammatory activity was only observed at the highest concentration, suggesting that the antinociceptive effect observed was not due to the antiinflammatory effect. The extracts of both species reduced the ulcerative lesions produced by ethanol up to 84% (P < 0.05), suggesting a relation with the antioxidant capacity. More studies are necessary to elucidate the mechanisms of action involved on antiulcerative effects.Com o objetivo de avaliar o efeito de duas espécies amazônicas em doenças relacionadas aos processos de oxidação, determinou-se a capacidade antioxidante (método Oxygen Radical Absorbance Capacity), o teor de polifenóis totais (método Folin-Ciocalteu - PT), bem como os efeitos farmacológicos in vitro (efeito antiproliferativo) e in vivo (antinociceptivo, antiinflamatório, antiulcerogênico) dos extratos hidroalcoólicos (65:35; v/v; etanol:água) das folhas de Byrsonima crassifolia (BC) e Inga edulis (IE). Os extratos de BC e IE apresentaram elevada capacidade antioxidante (1.422 e 694 µmol de Trolox Equivalente g-1 de folha seca - FS, respectivamente) e um valor relativamente alto de PT (35,93 e 24,50 mg Equivalente ácido gálico g-1 FS, respectivamente). Essa atividade antioxidante não teve relação direta com o teor de compostos fenólicos dos extratos, sugerindo a contribuição de outros grupos químicos nessa atividade. Em cultura de células tumorais humanas (nove linhagens), os extratos não apresentaram atividade antiproliferativa significante, com efeito citotóxico somente na concentração mais elevada. Em modelo de nocicepção induzida pelo calor (placa quente), o extrato de IE apresentou efeito antinociceptivo (P < 0,05) após 30 (250 e 500 mg kg-1) e 60 min (125 e 500 mg kg-1) de sua administração oral. Nos modelos de inflamação houve somente redução do edema para IE na concentração de 500 mg kg-1. Os extratos das duas espécies reduziram as lesões ulcerativas produzidas por etanol em até 84% (P < 0,05), sugerindo uma possível ligação com a atividade antioxidante observada e indicando a necessidade de estudos para a elucidação do mecanismo de ação envolvido.ROGEZ, H. L. G. Universidade Federal do Par

Spilanthol, the principal alkylamide from Acmella oleracea, attenuates 5-fluorouracil-induced intestinal mucositis in mice

Mucositis is one of the commonest side effects in cancer patients undergoing treatment with radiotherapy and/or chemotherapy, and it currently lacks appropriate and effective treatment. Acmella oleracea , a species of flowering herb from South America, contains spilanthol, an alkylamide that has several pharmacological properties, including anesthetic, analgesic, and anti-inflammatory activities. Therefore, the purpose of this work was to evaluate the effect of spilanthol in intestinal mucositis in Swiss mice induced by 5-fluorouracil (5-FU), an antineoplastic agent administered systemically for the treatment of many different cancers. The repeated administration of 5-FU resulted in intestinal mucositis and consequent decreased food intake, together with weight loss, in all the animals. Daily administration of spilanthol significantly lowered the severity of intestinal mucositis, reducing histopathological changes and increasing the villus height in the animals treated with spilanthol at a dosage of 30mg/kg (p<0.0044) compared to a group exposed only to 5-FU. A decrease of myeloperoxidase activity was also observed in the animals treated with 30mg/kg of spilanthol (p<0.05), although several pro-inflammatory cytokines were not quantifiable in any group. In conclusion, the data demonstrated that spilanthol effectively reduced inflammation in a mouse model of intestinal mucositis induced by 5-FU, and that the compound might be a promising therapeutic candidate for the prevention and treatment of this condition853203209FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP2014/06461-2; 2014/16186-