23 research outputs found
Identifizierung und Charakterisierung neuer Interaktionspartner des mitochondrialen Hsp70
Mitochondriales Hsp70 spielt eine wichtige Rolle bei der Biogenese und Funktion von
Mitochondrien. Es ist essenziell fĂŒr den Import, die Faltung und den Abbau mitochondrialer
Proteine. Wie alle Hsp70-Proteine arbeitet mtHsp70 dabei mit Cochaperonen zusammen. In
dieser Arbeit wurden neue Interaktionspartner von mtHsp70 identifiziert und funktionell
charakterisiert.
MtHsp70 ist die zentrale Komponente des Importmotors der TIM23-Translokase, der den
ATP-abhĂ€ngigen Transport von Proteinen ĂŒber die Innenmembran der Mitochondrien
vermittelt. Mit Tim14 und Mdj2 wurden in dieser Arbeit zwei Proteine des Importmotors als
J-Cochaperone identifiziert. Sowohl Tim14 als auch Mdj2 wurden als MBP-Fusionsproteine
aus E. coli gereinigt und stimulierten die ATPase-AktivitÀt von mtHsp70. Eine Variante von
Tim14 mit einer Mutation im HPD-Motiv, die die Stimulation der ATPase-AktivitÀt von
mtHsp70 durch Tim14 verhindert, konnte die Funktion von Tim14 in Hefezellen nicht
ĂŒbernehmen. Die Entdeckung von membranassoziierten J-Proteinen im Importmotor macht
deutlich, dass mtHsp70 durch die Stimulation seiner ATPase-AktivitÀt effizient an ein
importiertes Protein binden kann, sobald dieses die Translokationspore des TIM23-
Komplexes verlÀsst. Ebenso wird die evolutionÀre Konservierung zwischen dem Importmotor
und bakteriellen Hsp70-Systemen ersichtlich. Der Importmotor der TIM23-Translokase ist
aber eine Ausnahme unter den Hsp70-Systemen, da in diesem System mit Tim16 eine
weitere, regulatorische Komponente identifiziert werden konnte. Tim16 ist ein J-Ă€hnliches
Protein, das selber keine stimulierende Wirkung auf die ATPase-AktivitÀt von mtHsp70 hat,
aber die Stimulation von mtHsp70 durch Tim14 reguliert. Dies könnte einen unnötigen
Verbrauch von ATP durch mtHsp70 in Abwesenheit eines PrÀproteins verhindern.
Mit der Charakterisierung der J- und J-Ă€hnlichen Proteine des Importmotors wurden
wesentliche Erkenntnisse ĂŒber die Funktionsweise des Importmotors geliefert.
Ein bisher nicht bekanntes Protein wurde zusammen mit mtHsp70 aus S. cerevisiae gereinigt
und anschlieĂend biochemisch charakterisiert. Dieses Protein, Hep1, ist ein lösliches Protein
der mitochondrialen Matrix. Es interagiert mit mtHsp70 in seiner nukleotidfreien und ADPgebundenen
Form. FĂŒr diese Interaktion ist die ATPase-DomĂ€ne von mtHsp70 notwendig.
Jedoch trÀgt vermutlich auch die PBD zur Bindung von mtHsp70 an Hep1 bei, da eine solche
Bindung nur beobachtet werden konnte, wenn mtHsp70 sowohl die ATPase-DomÀne als auch
die PBD aufweist.
Hep1 hat im Gegensatz zu den bekannten Cochaperonen keinen Einfluss auf den ATPase-
Zyklus von mtHsp70. Allerdings aggregieren in Abwesenheit von Hep1 mitochondriale
Hsp70-Proteine. Diese Aggregation ist irreversibel und fĂŒhrt zum Verlust der Funktion der
mitochondrialen Hsp70-Proteine. Diese BeeintrĂ€chtigung fĂŒhrt wiederum zu Defekten in
Prozessen, die funktionelle mitochondriale Hsp70-Proteine benötigen. So wurden in âhep1-
Zellen Defekte im mitochondrialen Proteinimport und der Biogenese von Eisen-Schwefel-
Clustern beobachtet. Aufgrund dieser Defekte zeigen âhep1-Zellen einen Temperatursensitiven
WachstumsphÀnotyp.
Die Tendenz zur Aggregation ist spezifisch fĂŒr mitochondriale Hsp70-Proteine, wobei
besonders die nukleotidfreie Form von mtHsp70 betroffen ist. Im aggregierten Material lieĂ
sich eine erhöhte SensitivitĂ€t der ATPase-DomĂ€ne gegenĂŒber zugesetzter Protease feststellen,
was auf eine Fehlfaltung dieser DomÀne deutet. Es wurde eine Region in der ATPase-
DomÀne von mtHsp70 identifiziert, die zur Aggregation von mtHsp70 beitrÀgt. Durch
Austausch dieser Region gegen die entsprechende Region aus DnaK, dem nÀchsten nicht
mitochondrialen Verwandten von mtHsp70, konnte ein teilweise funktionsfÀhiges Hsp70-
Protein hergestellt werden, dessen Löslichkeit nicht mehr von Hep1 abhÀngig ist. MtHsp70
aggregiert nur, wenn es sowohl die ATPase-DomÀne als auch die PBD aufweist. Die
InterdomÀnenkommunikation zwischen der ATPase-DomÀne und der PBD von mtHsp70
scheint zur Ausbildung einer instabilen Konformation notwendig zu sein. Hep1 bindet an
mtHsp70 in dieser Konformation und verhindert somit die Aggregation.
Mit Hep1 wurde in dieser Arbeit ein neuer Typ von Interaktionspartnern mitochondrialer
Hsp70-Proteine entdeckt. Es wirkt als Chaperon fĂŒr dieses Hsp70-Proteine, indem es an sie
bindet und deren Aggregation verhindert
The peroxin PEX14 of Neurospora crassa is essential for the biogenesis of both glyoxysomes and Woronin bodies
In the filamentous fungus Neurospora crassa, glyoxysomes and Woronin bodies coexist in the same cell. Because several glyoxysomal matrix proteins and also HEX1, the dominant protein of Woronin bodies, possess typical peroxisomal targeting signals, the question arises as to how protein targeting to these distinct yet related types of microbodies is achieved. Here we analyzed the function of the Neurospora ortholog of PEX14, an essential component of the peroxisomal import machinery. PEX14 interacted with both targeting signal receptors and was localized to glyoxysomes but was virtually absent from Woronin bodies. Nonetheless, a pex14 Delta mutant not only failed to grow on fatty acids because of a defect in glyoxysomal beta-oxidation but also suffered from cytoplasmic bleeding, indicative of a defect in Woronin body-dependent septal pore plugging. Inspection of pex14 Delta mutant hyphae by fluorescence and electron microscopy indeed revealed the absence of Woronin bodies. When these cells were subjected to subcellular fractionation, HEX1 was completely mislocalized to the cytosol. Expression of GFP-HEX1 in wild-type mycelia caused the staining of Woronin bodies and also of glyoxysomes in a targeting signal-dependent manner. Our data support the view that Woronin bodies emerge from glyoxysomes through import of HEX1 and subsequent fission
Tim14, a novel key component of the import motor of the TIM23 protein translocase of mitochondria
The TIM23 translocase mediates the ÎΚ- and ATP-dependent import of proteins into mitochondria. We identified Tim14 as a novel component of the TIM23 translocase. Tim14 is an integral protein of the inner membrane with a typical J-domain exposed to the matrix space. TIM14 genes are present in the genomes of virtually all eukaryotes. In yeast, Tim14 is essential for viability. Mitochondria from cells depleted of Tim14 are deficient in the import of proteins mediated by the TIM23 complex. In particular, import of proteins that require the action of mtHsp70 is affected. Tim14 interacts with Tim44 and mtHsp70 in an ATP-dependent manner. A mutation in the HPD motif of the J-domain of Tim14 is lethal. Thus, Tim14 is a constituent of the mitochondrial import motor. We propose a model in which Tim14 is required for the activation of mtHsp70 and enables this chaperone to act in a rapid and regulated manner in the Tim44-mediated trapping of unfolded preproteins entering the matrix
The osmotic stress technique was applied to partially plastinated iliotibial tract samples.
<p>Each sample pair consisting of one native tract and its corresponding acellular counterpart were submersed for 24 h in a 2.5 wt % polyethylene glycol solution before uniaxial tensile testing. Scale bar â=â10 mm</p
Do Cells Contribute to Tendon and Ligament Biomechanics?
<div><p>Introduction</p><p>Acellular scaffolds are increasingly used for the surgical repair of tendon injury and ligament tears. Despite this increased use, very little data exist directly comparing acellular scaffolds and their native counterparts. Such a comparison would help establish the effectiveness of the acellularization procedure of human tissues. Furthermore, such a comparison would help estimate the influence of cells in ligament and tendon stability and give insight into the effects of acellularization on collagen.</p><p>Material and Methods</p><p>Eighteen human iliotibial tract samples were obtained from nine body donors. Nine samples were acellularized with sodium dodecyl sulphate (SDS), while nine counterparts from the same donors remained in the native condition. The ends of all samples were plastinated to minimize material slippage. Their water content was adjusted to 69%, using the osmotic stress technique to exclude water content-related alterations of the mechanical properties. Uniaxial tensile testing was performed to obtain the elastic modulus, ultimate stress and maximum strain. The effectiveness of the acellularization procedure was histologically verified by means of a DNA assay.</p><p>Results</p><p>The histology samples showed a complete removal of the cells, an extensive, yet incomplete removal of the DNA content and alterations to the extracellular collagen. Tensile properties of the tract samples such as elastic modulus and ultimate stress were unaffected by acellularization with the exception of maximum strain.</p><p>Discussion</p><p>The data indicate that cells influence the mechanical properties of ligaments and tendons in vitro to a negligible extent. Moreover, acellularization with SDS alters material properties to a minor extent, indicating that this method provides a biomechanical match in ligament and tendon reconstruction. However, the given protocol insufficiently removes DNA. This may increase the potential for transplant rejection when acellular tract scaffolds are used in soft tissue repair. Further research will help optimize the SDS-protocol for clinical application.</p></div
Safranin-o staining of native (8a) and acellular (8b) iliotibial tract samples.
<p>Scale bar â=â1000 ”m.</p
Summary of the study protocol and the amount of specimens that were used for the respective experiments.
<p>Summary of the study protocol and the amount of specimens that were used for the respective experiments.</p
Stress-strain curves of native and acellular iliotibial tract samples obtained from the same donors and anatomical site.
<p>Stress-strain curves of native and acellular iliotibial tract samples obtained from the same donors and anatomical site.</p
Time-dependent decrease of the water content as a function of the polyethylene glycol (PEG) concentrations (2a, top) and correlation between polyethylene glycol (PEG) concentration and iliotbial tract water content after submersion for 24 h (2b, bottom) are shown.
<p>Applying the osmotic stress technique to iliotibial tract specimens caused a PEG- dependent decrease of their water content. PEG concentrations of 2.5 wt% (grey arrow) were most suitable for osmotically adjusting the water content of iliotibial tract samples and their corresponding acellular scaffolds.</p