¿Puede la FIV de co-incubación corta reemplazar la FIV convencional? Una perspectiva morfocinética

[ES] Varios estudios apuntan que la reducción del tiempo de co-incubación de los gametos en fecundación in vitro (1-4h) puede igualar, o incluso mejorar, las tasas de implantación respecto a la fecundación in vitro convencional (16-18h). Esto puede deberse a que, al estar los gametos en contacto menos tiempo, disminuye la exposición del oocito a los productos tóxicos del metabolismo del espermatozoide. El objetivo de este trabajo es determinar el efecto de la reducción en el tiempo de coincubación de los gametos en fecundación in vitro (FIV) sobre el desarrollo embrionario. Para ello, se comparan los parámetros morfocinéticos de embriones procedentes de FIV de co-incubación corta frente a los de FIV convencional. Además, se plantea la medida relativa de radicales libres mediante la cuantificación del potencial de oxidoreducción en los medios co-incubados. Aunque las tasas de fecundación resultantes de FIVc y FIV no parecen verse alteradas, se encuentran diferencias tanto en los patrones morfocinéticos de los embriones como en los medios de cultivo. En su forma actual, la fecundación in vitro de co-incubación corta no parece mejorar los resultados, si bien nuevos ensayos con variaciones en el protocolo son necesarios.[EN] Some studies report reducing the time of sperm-oocyte co-incubation in in vitro fertilization (1-4h) equals, or even improve, the implantation rate compared to conventional in vitro fertilization (16-18h). It is hypothesized that the detrimental effect of toxic products coming from spermatozoa metabolism is decreased when coincubation time is shorted. The aim of this study is to determinate the effects of reducing time of co-incubation in in vitro fertilization (IVF) trough morphokinetic parameters. Moreover, indirect quantification of free radical products secreted by spermatozoa and granulosa cells in fertilization culture medium is presented as an additional assay. Even though fertilization rates are similar between short IVF and conventional IVF, significant differences at both morphokinetic development and fertilization media are found. It seems the current short co-incubation IVF protocol does not improve results, although more assays are needed.[CA] Nombrosos estudis apunten que la reducció del temps de co-incubació dels gàmetes en FIV (1-4h) pot igualar, o fins i tot millorar, les tasses d’implantació respecte a la FIV convencional (16-18h). Açò pot estar degut a que, al estar els gàmetes en contacte menys temps, la exposició dels oocist als productes tòxics del metabolisme del espermatozoide també disminueix. L’objectiu del present estudi es determinar l’efecte de la reducció del temps de co-incubació dels gàemetes en la fecundació in vitro sobre el desenvolupament embrionari. Amb tal propòsit, es comparen els paràmetres morfocinétics de embrions vinents de FIV de co-incubació curta front als de FIV convencional. A més, es planteja la quantificació del potencial d’oxidoreducció dels medis co-incubats s productes tòxics secretats tant per l’espermatozoide com les cèl·lules de la granulosa en el medi de fecundació per a complementar l’estudi. Encara que les tases de fecundació resultants de FIVc y FIV no pareixen ser alterados, s’han trobat diferències tant en els patrons morfocinètics dels embrions com en els medis de cultiu. En la seua forma actual, la fecundació in vitro de co-incubació curta no pareix millorar els resultats, si bé nous assatjos amb variacions en els protocols són necessaris.Martínez Rodero, I. (2016). ¿Puede la FIV de co-incubación corta reemplazar la FIV convencional? Una perspectiva morfocinética. http://hdl.handle.net/10251/67598.TFG

Exopolysaccharide ID1 Improves Post-Warming Outcomes after Vitrification of In Vitro-Produced Bovine Embryos

This study aimed to assess the cryoprotectant role of exopolysaccharide (EPS) ID1, produced by Antarctic Pseudomonas sp., in the vitrification of in vitro-produced (IVP) bovine embryos. IVP day 7 (D7) and day 8 (D8) expanded blastocysts derived from cow or calf oocytes were vitrified without supplementation (EPS0) or supplemented with 10 g/mL (EPS10) or 100 g/mL (EPS100) EPS ID1. The effect of EPS ID1 was assessed in post-warming re-expansion and hatching rates, differential cell count, apoptosis rate, and gene expression. EPS100 re-expansion rates were significantly higher than those observed for the EPS0 and EPS10 treatments, regardless of culture length or oocyte source. EPS100 hatching rate was similar to the one of the fresh blastocysts except for those D7 blastocysts derived from calf oocytes. No differences were observed among EPS ID1 treatments when the inner cell mass, trophectoderm, and total cell number were assessed. Although apoptosis rates were higher (p 0.05) in vitrified groups compared to fresh embryos, EPS100 blastocysts had a lower number (p 0.05) of apoptotic nuclei than the EPS0 or EPS10 groups. No differences in the expression of BCL2, AQP3, CX43, and SOD1 genes between treatments were observed. Vitrification without EPS ID1 supplementation produced blastocysts with significantly higher BAX gene expression, whereas treatment with 100 g/mL EPS ID1 returned BAX levels to those observed in non-vitrified blastocysts. Our results suggest that 100 g/mL EPS ID1 added to the vitrification media is beneficial for embryo cryopreservation because it results in higher re-expansion and hatching ability and it positively modulates apoptosis

Effect of cryoprotectant concentration on bovine oocyte permeability and comparison of two membrane permeability modelling approaches

Generalitat de Catalunya 2019 FI_B2 00055The plasma membrane permeability to water and cryoprotectant (CPA) significantly impacts vitrification efficiency of bovine oocytes. Our study was designed to determine the concentration-dependent permeability characteristics for immature (GV) and mature (MII) bovine oocytes in the presence of ethylene glycol (EG) and dimethyl sulphoxide (MeSO), and to compare two different modeling approaches: the two parameter (2P) model and a nondilute transport model. Membrane permeability parameters were determined by consecutively exposing oocytes to increasing concentrations of MeSO or EG. Higher water permeability was observed for MII oocytes than GV oocytes in the presence of both MeSO and EG, and in all cases the water permeability was observed to decrease as CPA concentration increased. At high CPA concentrations, the CPA permeability was similar for MeSO and EG, for both MII and GV oocytes, but at low concentrations the EG permeability of GV oocytes was substantially higher. Predictions of cell volume changes during CPA addition and removal indicate that accounting for the concentration dependence of permeability only has a modest effect, but there were substantial differences between the 2P model and the nondilute model during CPA removal, which may have implications for design of improved methods for bovine oocyte vitrification

In vitro maturation in the presence of Leukemia Inhibitory Factor modulates gene and miRNA expression in bovine oocytes and embryos

Altres ajuts: OECD Co-operative Research Programme: Biological Resource Management for Sustainable Agricultural Systems ; Natural Sciences and Engineering Research Council of CanadaMembers of the interleukin-6 (IL-6) family of cytokines are important for reproductive function that are mediated through changes in gene and miRNA expression. Herein, we characterized the expression of miR-21, miR-155, miR-34c and miR-146a in bovine oocytes and cumulus cells during in vitro maturation (IVM) with leukemia inhibitory factor (LIF), IL-6 and IL-11 or unsupplemented controls. LIF-exposed COCs showed higher expression of miR-21 and miR-155 in oocytes, whereas miR-146a expression was increased in oocytes matured with IL-6 and IL-11. In cumulus cells, miR-155 expression was elevated by all treatments while only LIF increased miR-21 expression. Based on these results, we next examined how LIF exposure during IVM affected oocyte competence, through IVF and the expression of specific genes in GV- and MII-oocytes, in 2- and 8-cell embryos, and in Day 8-blastocysts. LIF supplementation did not affect cleavage rate, blastocyst yield or several other developmental parameters, but did increase hatching rate. LIF suppressed DPPA3, ZAR1 and NPM2 expression in 2 cell- and/or 8-cell embryos. LIF increased the expression of KAT2A and HSPA1A in MII-oocytes, and that of HDAC1, KAT2A and HSP90AA1 and the BAX:BCL2L1 ratio in 2-cell embryos. In contrast, HDAC1, KAT2A and HSP90AA1 expression and BAX:BCL2L1 ratio was lower in 8-cell embryos derived from LIF oocytes. IVM with LIF also increased the expression of DNMT3A, HSPA1A and HSP90AA1 in blastocysts. In conclusion, supplementation with LIF during IVM was consistently associated with changes in the relative abundance of transcripts in mature bovine oocytes and in specific embryo developmental stages

Cryoprotectant role of exopolysaccharide ID1 in the vitrification/in-straw warming of in vitro-produced bovine embryos

Acord transformatiu CRUE-CSICThe cold-adapted bacterium Pseudomonas sp. ID1 produces the extracellular exopolysaccharide ID1 (EPS ID1) with cryoprotective activity. This study was designed to optimize the vitrification/in-straw warming protocol of in vitro-produced (IVP) blastocysts by adding EPS ID1 to the vitrification media. Day 7-expanded blastocysts were vitrified/warmed using the VitTrans device after the addition of 0 or 100 μg/mL EPS ID1 to the vitrification media. Blastocysts vitrified by the Cryotop method and fresh non-vitrified blastocysts served as controls. Outcomes were assessed in the warmed embryos in terms of survival rates and mRNA relative abundances of BAX, BCL2, GPX1, and CDX2 genes. No differences in survival rates were observed at 3 h post-warming between vitrification treatments. At 24 h post-warming, the addition of EPS prior to vitrification with the VitTrans device produced similar survival rates to Cryotop-vitrified embryos and similar hatching rates to fresh non-vitrified or Cryotop-vitrified embryos. No differences emerged in BCL2 gene expression. Lower BAX (p <.05) and higher GPX1 (p <.05) and CDX2 (p <.1) gene expression were observed in expanded and/or hatched blastocysts derived from VitTrans-EPS-vitrified embryos when compared to those from the non-supplemented group. In conclusion, addition of EPS not only promoted blastocyst survival and hatching after VitTrans vitrification/warming but also modified the expression of genes associated with better embryo quality

Exopolysaccharide ID1 Improves Post-Warming Outcomes after Vitrification of In Vitro-Produced Bovine Embryos

This study aimed to assess the cryoprotectant role of exopolysaccharide (EPS) ID1, produced by Antarctic Pseudomonas sp., in the vitrification of in vitro-produced (IVP) bovine embryos. IVP day 7 (D7) and day 8 (D8) expanded blastocysts derived from cow or calf oocytes were vitrified without supplementation (EPS0) or supplemented with 10 µg/mL (EPS10) or 100 µg/mL (EPS100) EPS ID1. The effect of EPS ID1 was assessed in post-warming re-expansion and hatching rates, differential cell count, apoptosis rate, and gene expression. EPS100 re-expansion rates were significantly higher than those observed for the EPS0 and EPS10 treatments, regardless of culture length or oocyte source. EPS100 hatching rate was similar to the one of the fresh blastocysts except for those D7 blastocysts derived from calf oocytes. No differences were observed among EPS ID1 treatments when the inner cell mass, trophectoderm, and total cell number were assessed. Although apoptosis rates were higher (p ≤ 0.05) in vitrified groups compared to fresh embryos, EPS100 blastocysts had a lower number (p ≤ 0.05) of apoptotic nuclei than the EPS0 or EPS10 groups. No differences in the expression of BCL2, AQP3, CX43, and SOD1 genes between treatments were observed. Vitrification without EPS ID1 supplementation produced blastocysts with significantly higher BAX gene expression, whereas treatment with 100 µg/mL EPS ID1 returned BAX levels to those observed in non-vitrified blastocysts. Our results suggest that 100 µg/mL EPS ID1 added to the vitrification media is beneficial for embryo cryopreservation because it results in higher re-expansion and hatching ability and it positively modulates apoptosis

A Shorter Equilibration Period Improves Post-Warming Outcomes after Vitrification and in Straw Dilution of In Vitro-Produced Bovine Embryos

This study was designed to the optimize vitrification and in-straw warming protocol of in vitro-produced bovine embryos by comparing two different equilibration periods, short equilibrium (SE: 3 min) and long equilibrium (LE: 12 min). Outcomes recorded in vitrified day seven (D7) and day eight (D8) expanded blastocysts were survival and hatching rates, cell counts, apoptosis rate, and gene expression. While survival rates at 3 and 24 h post-warming were reduced (p < 0.05) after vitrification, the hatching rates of D7 embryos vitrified after SE were similar to the rates recorded in fresh non-vitrified blastocysts. The hatching rates of vitrified D8 blastocysts were lower (p < 0.05) than of fresh controls regardless of treatment. Total cell count, and inner cell mass and trophectoderm cell counts were similar in hatched D7 blastocysts vitrified after SE and fresh blastocysts, while vitrified D8 blastocysts yielded lower values regardless of treatment. The apoptosis rate was significantly higher in both treatment groups compared to fresh controls, although rates were lower for SE than LE. No differences emerged in BAX, AQP3, CX43, and IFNτ gene expression between the treatments, whereas a significantly greater abundance of BCL2L1 and SOD1 transcripts was observed in blastocysts vitrified after SE. A shorter equilibration vitrification protocol was found to improve post-warming outcomes and time efficiency after in-straw warming/dilution

In vitro-produced bovine embryos: different approaches to optimise their vitrification

Els programes de cria estan incorporant biotecnologies reproductives per tal de facilitar una activitat ramadera més productiva i sostenible. En concret, la producció in vitro (IVP) d’embrions permet accelerar la millora genètica i eludir problemes dels criadors com la disminució de la fertilitat de les vaques durant els períodes d’estrès per calor. Per a emmagatzemar l’excedent d’embrions de PIV després de la seua transferència a les receptores, així com per a facilitar la difusió de la genètica superior i el comerç mundial garantint al mateix temps el benestar animal i la bioseguretat, la crioconservació d’embrions de PIV s’erigeix com una tècnica clau. Mentre que la congelació lenta tradicional ha demostrat la seua eficàcia per a la crioconservació d’embrions in vivo, les tècniques de vitrificació semblen ser més eficients per als embrions PIV. No obstant això, les seues aplicacions pràctiques en reproducció veterinària són limitades perquè la vitrificació presenta diversos inconvenients. D’una banda, la falta d’un protocol estàndard amb taxes de gestació acceptables després de la transferència d’embrions rescalfats ha restringit l’ús d’aquests en els sistemes de producció ramadera. Per un altra, encara que la vitrificació és més senzilla, ràpida i barata que la congelació lenta, requereix l’ús d’un estereomicroscopi i, quan es treballa en condicions de camp, el procediment és tècnicament exigent. L’objectiu d’aquesta Tesi Doctoral és desenvolupar diferents enfocaments per a optimitzar la vitrificació de blastocists bovins PIV. Consisteixen en modificacions del protocol de vitrificació (1ª i 5ª), dels mitjans de vitrificació (2ª i 3ª) i de l’estructura cel·lular de l’embrió (4ª); i es van desenvolupar utilitzant tant el mètode estàndard (Cryotop) com un mètode adaptat a la granja (VitTrans). En primer lloc, es van comparar dos protocols d’equilibri per a optimitzar la vitrificació i el reescalfament en palleta d’embrions bovins IVP. Per a això, els blastocists expandits de Dia 7 (D7) i Dia 8 (D8) es van assignar aleatòriament a un protocol d’equilibrat llarg (LE; 12 min) i a un altre d’equilibrat curt (SE; 3 min) utilitzant el dispositiu VitTrans per al rescalfament en palleta en un sol pas. Després del rescalfament, els embrions vitrificats amb SE van mostrar una capacitat d’eclosió, un recompte cel·lular total (TCN) i un nombre de cèl·lules de la massa cel·lular interna (ICM) i del trofectoderm (TE) similars als dels blastocists frescos no vitrificats. A més, les taxes d’apoptosis (AR) dels blastocists supervivents del grup SE van ser inferiors a les del grup LE, mentre que es va observar una major abundància del gen antiapoptòtic BCL2 i del gen de la superòxid dismutasa SOD1 en els blastocists SE en comparació amb els de LE. En el segon estudi, es va avaluar el paper crioprotector d’un exopolisacàrid bacterià (EPS) produït pel bacteri antàrtic Pseudomonas sp. ID1 en la vitrificació d’embrions bovins IVP amb Cryotop. Es van vitrificar blastocists expandits de D7 i D8 derivats d’oòcits de vaca o vedella utilitzant un protocol d’equilibri més curt sense suplementació (EPS0) o suplementats amb 10 µg/ml (EPS10) o 100 µg/ml (EPS100) de EPS ID1. Els efectes beneficiosos d’afegir 100 µg/ml de EPS ID1 als mitjans de vitrificació es van observar en les majors taxes de re-expansió i eclosió després de 24 h post-calfament dels blastocists EPS100 en comparació amb els grups EPS0 o EPS10, independentment de la duració del cultiu o de la font d’oòcits. A més, encara que la AR va ser major en tots els grups vitrificats, els blastocists EPS100 de vaca i vedella de D7 i D8 tenien un nombre menor de cèl·lules apoptòtiques que els grups EPS0 o EPS10. El gen proapoptòtic BAX va augmentar en els blastocistos de vaca EPS0, mentre que EPS100 va restablir els nivells de BAX als del grup de control Fresc. En tercer lloc, també es van examinar els efectes beneficiosos d’EPS100, però utilitzant el protocol d’equilibrat curt i el mètode de vitrificació/rescalfament en palleta VitTrans. Per a això, es van vitrificar/rescalfar blastocists expandits de D7 en els grups EPS0 o EPS100, mentre que els blastocists vitrificats pel mètode Cryotop i els blastocists Frescs no vitrificats es van utilitzar com a controls. El tractament EPS100 amb VitTrans va produir taxes de re-expansió similars a les del grup de control Cryotop i una capacitat d’eclosió similar a la dels controls Cryotop i Fresc. A més, es va observar una menor expressió del gen proapoptòtic BAX i majors nivells de la glutatió peroxidasa GPX1 i conexina CDX2 en els blastocists vitrificats/rescalfats amb EPS100 en comparació amb els del grup no suplementat. En quart lloc, es va provar el fluid blastocèlic com a font d’ADN lliure de cèl·lules (cfDNA) i es va comparar amb la biòpsia de TE per microbisturí en termes d’eficàcia/precisió del sexatge. A més, els efectes tant de l’aspiració del fluid del blastocel com de la biòpsia del TE van ser mesurats en la supervivència i la expressió gènica embrionàries. Els blastocists expandits de D7 van ser vitrificats/rescalfats amb el mètode Cryotop d’equilibrat curt en la seua forma intacta (VIT-Control), després del col·lapse del blastocel i l’aspiració del fluid blastocèlic (VIT-Colapsed) i després de la biòpsia del TE (VIT-Biopsied). Aquest estudi va demostrar que existeix cfDNA amplificable i ofereix material genètic fiable per al sexatge, evitant així procediments invasius com la biòpsia de TE per microbisturí. A més, el col·lapse artificial ofereix un potent enfocament per a la criopreservació d’embrions perquè millora la re-expansió post-recalfament i els rendiments d’eclosió i la expressió de gens de qualitat com el gen antiapoptòtic BCL2 en comparació amb la vitrificació/rescalfament d’embrions intactes (VIT-Control) i biopsiats (VIT-Biopsied). Finalment, en el cinquè estudi, es van proposar temps d’equilibri optimitzats basats en prediccions in silico i observacions osmòtiques in vitro a diferents temperatures (25 °C; 38,5 °C) i es van provar utilitzant-los en la vitrificació/rescalfament. Per a això, es van registrar blastòcits del D7 col·lapsats artificialment per a observar els seus canvis volumètrics primer en resposta al dimetilsulfòxid (Me2SO) i etilenglicol (EG), per a modelar la permeabilitat de la membrana, i després a la solució d’equilibri (ES; 7,5% Me2SO i 7,5% EG), per a observacions in vitro. Després de comprovar que les prediccions in silico i les observacions in vitro coincidien, es va utilitzar el protocol d’equilibri per a 25 °C (VIT25; 8 min i 30 s) i per a 38,5 °C (VIT38,5; 3 min i 40 s) per a la vitrificació/calfament dels blastocists col·lapsats del D7. No es van observar diferències estadístiques en la reutilització dels blastocists. No es van observar diferències estadístiques en les taxes de re-expansió a les 24 h post-rescalfament de tots els blastocists vitrificats/escalfats i les del control Fresc, mentre que les taxes d’eclosió van ser significativament superiors en VIT38.5. Els recomptes de cèl·lules TCN i ICM van ser similars en els blastocists del control Fresc i VIT38.5, mentre que el menor recompte de cèl·lules ICM i la major AR es van observar en els blastocists VIT25. En conjunt, els resultats d’aquesta Tesi Doctoral podrien contribuir a l’avanç de la criopreservació d’embrions IVP mitjançant la proposta de diferents estratègies per a millorar els resultats i la factibilitat de la vitrificació. Els resultats aquí presentats podrien contribuir a delimitar un protocol estàndard de vitrificació d’embrions bovins IVP que permetin la seua aplicació a condicions de camp i ofereixin taxes de gestació acceptables.Los programas de cría están incorporando biotecnologías reproductivas para facilitar una actividad ganadera más productiva y sostenible. En concreto, la producción in vitro (IVP) de embriones permite acelerar la mejora genética y eludir problemas de los criadores como la disminución de la fertilidad de las vacas durante los periodos de estrés por calor. Para almacenar el excedente de embriones de IVP después de su transferencia a las receptoras, así como para facilitar la difusión de la genética superior y el comercio mundial garantizando al mismo tiempo el bienestar animal y la bioseguridad, la crioconservación de embriones de IVP se erige como una técnica clave. Mientras que la congelación lenta tradicional ha demostrado su eficacia para la crioconservación de embriones in vivo, las técnicas de vitrificación parecen ser más eficientes para los embriones IVP. Sin embargo, sus aplicaciones prácticas en reproducción veterinaria son limitadas porque la vitrificación presenta varios inconvenientes. Por un lado, la falta de un protocolo estándar con tasas de gestación aceptables después de la transferencia de embriones recalentados ha restringido el uso de estos en los sistemas de producción ganadera. Por otro, aunque la vitrificación es más sencilla, rápida y barata que la congelación lenta, requiere el uso de un estereomicroscopio y, cuando se trabaja en condiciones de campo, el procedimiento es técnicamente exigente. El objetivo de esta Tesis Doctoral es desarrollar diferentes enfoques para optimizar la vitrificación de blastocistos vacunos IVP. Consisten en modificaciones del protocolo de vitrificación (1ª y 5ª), de los medios de vitrificación (2ª y 3ª) y de la estructura celular del embrión (4ª); y se desarrollaron utilizando tanto el método estándar (Cryotop) como un método adaptado a la granja (VitTrans). En primer lugar, se compararon dos protocolos de equilibrio para optimizar la vitrificación y el recalentamiento en pajuela de embriones vacunos IVP. Para ello, los blastocistos expandidos de Día 7 (D7) y Día 8 (D8) se asignaron aleatoriamente a un protocolo de equilibrado largo (LE; 12 min) y a otro de equilibrado corto (SE; 3 min) utilizando el dispositivo VitTrans para el recalentamiento en pajuela en un solo paso. Después del recalentamiento, los embriones vitrificados con SE mostraron una capacidad de eclosión, un recuento celular total (TCN) y un número de células de la masa celular interna (ICM) y del trofectodermo (TE) similares a los de los blastocistos frescos no vitrificados. Además, las tasas de apoptosis (AR) de los blastocistos supervivientes del grupo SE fueron inferiores a las del grupo LE, mientras que se observó una mayor abundancia del gen antiapoptótico BCL2 y del gen de la superóxido dismutasa SOD1 en los blastocistos SE en comparación con los de LE. En el segundo estudio, se evaluó el papel crioprotector de un exopolisacárido bacteriano (EPS) producido por la bacteria antártica Pseudomonas sp. ID1 en la vitrificación de embriones vacunos IVP con Cryotop. Se vitrificaron blastocistos expandidos de D7 y D8 derivados de oocitos de vaca o ternera utilizando un protocolo de equilibrio corto sin suplementación (EPS0) o suplementado con 10 µg/ml (EPS10) o 100 µg/ml (EPS100) de EPS ID1. Los efectos beneficiosos de añadir 100 µg/ml de EPS ID1 a los medios de vitrificación se observaron en las mayores tasas de re-expansión y eclosión después de 24 h post-recalentamiento de los blastocistos EPS100 en comparación con los grupos EPS0 o EPS10, independientemente de la duración del cultivo o de la fuente de oocitos. Además, aunque la AR fue mayor en todos los grupos vitrificados, los blastocistos EPS100 de vaca y ternera de D7 y D8 tenían un número menor de células apoptóticas que los grupos EPS0 o EPS10. El gen proapoptótico BAX aumentó en los blastocistos de vaca EPS0, mientras que EPS100 restableció los niveles de BAX a los del grupo de control Fresco. En tercer lugar, también se examinaron los efectos beneficiosos de EPS100, pero utilizando el protocolo de equilibrado corto y el método de vitrificación/rescalfament en pajita VitTrans. Para lo cual, se vitrificaron/recalentar blastocistos expandidos de D7 en los grupos EPS0 o EPS100, mientras que los blastocistos vitrificados por el método Cryotop y los blastocistos Frescos no vitrificados se utilizaron como controles. El tratamiento EPS100 con VitTrans produjo tasas de re-expansión similares a las del grupo de control Cryotop y una capacidad de eclosión similar a la de los controles Cryotop y Fresco. Además, se observó una menor expresión del gen proapoptótico BAX y mayores niveles de la glutatión peroxidasa GPX1 y conexina CDX2 en los blastocistos vitrificados/recalentados con EPS100 en comparación con los del grupo no suplementado. En cuarto lugar, se probó el fluido blastocélico como fuente de ADN libre de células (cfDNA) y se comparó con la biopsia de TE por microbisturí en términos de eficacia/precisión del sexado. Además, los efectos tanto de la aspiración del fluido blastocélico como de la biopsia del TE fueron medidos en la supervivencia y la expresión génica embrionarias. Los blastocistos expandidos de D7 fueron vitrificados/recalentados con el método Cryotop de equilibrado corto en su forma intacta (VIT-Control), después del colapso del blastocele y la aspiración del fluido blastocélico (VIT-Colapsed) y después de la biopsia del TE (VIT-Biopsied). Este estudio demostró que existe cfDNA amplificable y ofrece material genético fiable para el sexado, evitando así procedimientos invasivos como la biopsia de TE por microbisturí. Además, el colapso artificial ofrece un potente enfoque para la criopreservación de embriones porque mejora la reexpansión post-recalentamiento y los rendimientos de eclosión y la expresión de genes de calidad como el gen antiapoptótico BCL2 en comparación con la vitrificación/recalentamiento de embriones intactos (VIT-Control) y biopsiados (VIT-Biopsied). Finalmente, en el quinto estudio, se propusieron tiempo de equilibrio optimizados basados en predicciones in silico y observaciones osmóticas in vitro a diferentes temperaturas (25 °C; 38,5 °C) y se probaron utilizándolos en la vitrificación/recalentamiento. Para ello, se registraron los cambios volumétricos de blastocitos D7 colapsados artificialmente primero en respuesta al dimetilsulfóxido (Me2SO) y etilenglicol (EG), para modelar la permeabilidad de la membrana, y después a la solución de equilibrio (ES; 7,5% Me2SO y 7,5% EG), para observaciones in vitro. Después de comprobar que las predicciones in silico coincidían con el comportamiento in vitro, se utilizó el protocolo de equilibrio para 25 °C (VIT25; 8 min y 30 s) y para 38,5 °C (VIT38,5; 3 min y 40 s) para la vitrificación/calentamiento de los blastocistos colapsados de D7. No se observaron diferencias estadísticas en la reutilización de los blastocistos. No se observaron diferencias estadísticas en las tasas de re-expansión a las 24 h post-recalentamiento de todos los blastocistos vitrificados/recalentados y las del control Fresco, mientras que las tasas de eclosión fueron significativamente superiores en VIT38.5. Los recuentos de células TCN y ICM fueron similares en los blastocistos del control Fresco y VIT38.5, mientras que el menor recuento de células ICM y la mayor AR se observaron en los blastocistos VIT25. En conjunto, los resultados de esta Tesis Doctoral podrían contribuir al avance de la criopreservación de embriones IVP mediante la propuesta de diferentes estrategias para mejorar los resultados y la factibilidad de la vitrificación. Los resultados aquí presentados podrían contribuir a delimitar un protocolo estándar de vitrificación de embriones vacunos IVP que permitan su aplicación a condiciones de campo y ofrezcan tasas de gestación aceptables.Breeding programs are incorporating reproductive biotechnologies to facilitate more productive and sustainable cattle production. In particular, in vitro production (IVP) of embryos allow to accelerate genetic improvement and circumvent breeders&#8217; problems such as decreased cow fertility during heat stress periods. To store surplus IVP embryos after transfer to the recipients, as well as to facilitate dissemination of superior genetics and global trading while ensuring animal welfare and biosecurity, IVP embryo cryopreservation stands a key technique. Whereas traditional slow freezing has proved successful for the cryopreservation of in vivo-derived, vitrification techniques seem to be more efficient for IVP embryos. However, their practical applications in veterinary reproduction are limited because vitrification presents several drawbacks. On the one hand, the lack of a standard protocol with acceptable pregnancy rates after warmed embryo transfer has restricted the use of these embryos in cattle production systems. On the other, although vitrification is simpler, faster, and cheaper than slow freezing, it requires the use of a stereomicroscope and when working under field conditions, the procedure is technically demanding. The objective of this PhD Dissertation is to develop different approaches to optimize bovine IVP blastocyst vitrification. They consist of modifications to the vitrification protocol (1st and 5th), to the vitrification media (2nd and 3rd) and to the embryo cellular structure (4th); and they were developed using both the standard (Cryotop) and a farm-adapted method (VitTrans). First, two equilibration protocols were compared to optimize the vitrification and in-straw warming of IVP bovine embryos. For that, Day 7 (D7) and Day 8 (D8) expanded blastocysts were randomly allocated to long equilibration (LE; 12 min) and short equilibration (SE; 3 min) using the VitTrans device for one-step in-straw warming. After vitrification, D7 and D8 embryos vitrified after SE produced showed similar hatching ability, total cell count (TCN), and inner cell mass (ICM) and trophectoderm (TE) cell number than fresh non-vitrified blastocysts. Moreover, apoptosis rates (AR) of surviving blastocysts from SE group were lower than LE group, whereas a higher abundance of the antiapoptotic gene BCL2 and the superoxide dismutase gene SOD1 were found in the SE blastocysts compared to LE. In the second study, the cryoprotectant role of a bacterial exopolysaccharide (EPS) produced by the Antarctic bacteria Pseudomonas sp. ID1 was assessed in the vitrification of IVP bovine embryos with Cryotop. D7 and D8 expanded blastocysts derived from cow or calf oocytes were vitrified using shorter equilibration protocol without supplementation (EPS0) or supplemented with 10 µg/mL (EPS10) or 100 µg/mL (EPS100) of EPS ID1. The beneficial effects of adding 100 µg/mL EPS ID1 to the vitrification media was observed at the higher re-expansion and hatching rates after 24 h post-warming of EPS100 blastocysts compared to EPS0 or EPS10 groups, regardless of culture length or oocyte source. In addition, although the AR was higher in all vitrified groups, D7 and D8 EPS100 blastocysts from cow and calf had a lower number of apoptotic cells than EPS0 or EPS10 groups. Proapoptotic gene BAX was increased in EPS0 cow blastocysts while EPS100 restored BAX levels to those of Fresh control group. Third, the beneficial effects of EPS100 were also examined but using the short equilibration protocol and the vitrification/in-straw warming method VitTrans. With that purpose, D7 expanded blastocysts were vitrified/warmed in EPS0 or EPS100 groups, while blastocysts vitrified by the Cryotop method and fresh non-vitrified blastocysts were used as controls. EPS100 treatment using VitTrans produced similar re-expansion rates to Cryotop control group and similar hatching ability to Cryotop and Fresh controls. Also, a lower expression of proapoptotic gene BAX and higher levels of peroxidase GPX1 and connexin CDX2 were observed in blastocysts vitrified/warmed with.Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Medicina i Sanitat Animal

Glutathione Ethyl Ester Protects In Vitro-Maturing Bovine Oocytes against Oxidative Stress Induced by Subsequent Vitrification/Warming

Altres ajuts: GC/2017_FI_00451This study aimed to examine whether the addition of glutathione ethyl ester (GSH-OEt) to the in vitro maturation (IVM) medium would improve the resilience of bovine oocytes to withstand vitrification. The effects of GSH-OEt on spindle morphology, levels of reactive oxygen species (ROS), mitochondrial activity and distribution, and embryo developmental potential were assessed together with the expression of genes with a role in apoptosis (BAX, BCL2), oxidative-stress pathways (GPX1, SOD1), water channels (AQP3), implantation (IFN-τ) and gap junctions (CX43) in oocytes and their derived blastocysts. Vitrification gave rise to abnormal spindle microtubule configurations and elevated ROS levels. Supplementation of IVM medium with GSH-OEt before vitrification preserved mitochondrial distribution pattern and diminished both cytoplasmic and mitochondrial ROS contents and percentages of embryos developing beyond the 8-cell stage were similar to those recorded in fresh non-vitrified oocytes. Although not significantly different from control vitrified oocytes, vitrified oocytes after GSH-OEt treatment gave rise to similar day 8-blastocyst and hatching rates to fresh non-vitrified oocytes. No effects of GSH-OEt supplementation were noted on the targeted gene expression of oocytes and derived blastocysts, with the exception of GPX1, AQP3 and CX43 in derived blastocysts. The addition of GSH-OEt to the IVM medium before vitrification may be beneficial for embryo development presumably as the consequence of additional anti-oxidant protection during IVM

Impact of equilibration duration combined with temperature on the outcome of bovine oocyte vitrification

Acord transformatiu CRUE-CSICThe cryopreservation of mammalian oocytes and embryos has become an integral part of assisted reproduction in both humans and veterinary species. However, the methods used to cryopreserve bovine oocytes still have significant shortcomings. A wide variety of approaches has been used to try to improve and optimize methods of cryopreservation. However, these procedures employed are not always designed to specifically take account of the osmotic tolerance response of the cells according to the temperature and time of cryoprotectant (CPA) addition. When these properties are considered, optimal procedures for the addition of CPAs can be designed proactively. Based on in silico and in vitro osmotic observations, we propose shorter dehydration-based protocols at different temperatures (25°C vs. 38.5°C) towards defining an improved cryopreservation method. In vitro matured oocytes were exposed to equilibration solution (ES) at 25°C and 38.5°C and effects of optimized exposure times for each temperature were determined prior to vitrification/warming on oocyte spindle configuration, DNA fragmentation, and further embryo development. Upon exposure to standard ES (7.5% dimethyl sulfoxide + 7.5% ethylene glycol in TCM199 medium + 20% fetal bovine serum), original oocyte volume was recovered within 2 min 30 s at 38.5°C and 5 min 30 s at 25°C. In vitro matured oocytes were then exposed to the aforementioned cryoprotectants at both temperature/duration conditions and vitrified/warmed. While similar percentages of oocytes exhibiting a normally configured spindle and DNA fragmentation were observed in the fresh control group and oocytes vitrified at 38.5°C, significantly higher apoptosis rate and lower percentages of normal spindle configuration were observed in oocytes vitrified at 25°C when compared to control fresh oocytes. Similar cleavage rates and blastocyst yields were observed in the vitrified/38.5°C and fresh controls, while these rates were lower in vitrified/25°C. These results revealed that the limitation of the exposure time of the oocytes to the ES to the point of osmotic equilibrium volume recovery could be a more efficient approach to prepare them for vitrification. Therefore, exposure time to ES to 2 min 30 s at 38.5 °C appears to improve the quality of vitrified/warmed oocytes by protecting spindle integrity and reducing DNA fragmentation thus improving blastocyst rates and embryo quality