Arcobacter butzleri Biofilms: Insights into the Genes Beneath Their Formation

Arcobacter butzleri, the most prevalent species of the genus, has the demonstrated ability to adhere to various surfaces through biofilm production. The biofilm formation capability has been related to the expression of certain genes, which have not been characterized in A. butzleri. In order to increase the knowledge of this foodborne pathogen, the aim of this study was to assess the role of six biofilm-associated genes in campylobacteria (flaA, flaB, fliS, luxS, pta and spoT) in the biofilm formation ability of A. butzleri. Knockout mutants were constructed from different foodborne isolates, and static biofilm assays were conducted on polystyrene (PS), reinforced glass and stainless steel. Additionally, motility and Congo red binding assays were performed. In general, mutants in flaAB, fliS and luxS showed a decrease in the biofilm production irrespective of the surface; mutants in spoT showed an increase on stainless steel, and mutants in pta and spoT showed a decrease on reinforced glass but an increase on PS. Our work sheds light on the biofilm-related pathogenesis of A. butzleri, although future studies are necessary to achieve a satisfactory objective.This research was funded by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness, grant number AGL2014-56179-P (co-financed with FEDER funds), the University of the Basque Country UPV/EHU, grant number PPG17/27, and by the Basque Government, grant number PA20/03. A.S.-S. received a Ph.D. fellowship from the University of the Basque Country UPV/EHU, and I.B from the Basque Government

Prevalence of Salmonella in Free-Range Pigs: Risk Factors and Intestinal Microbiota Composition

Extensive pig systems are gaining importance as quality production systems and as the standard for sustainable rural development and animal welfare. However, the effects of natural foods on Salmonella epidemiology remain unknown. Herein, we assessed the presence of Salmonella and the composition of the gut microbiota in pigs from both Salmonella-free and high Salmonella prevalence farms. In addition, risk factors associated with the presence of Salmonella were investigated. The pathogen was found in 32.2% of animals and 83.3% of farms, showing large differences in prevalence between farms. Most isolates were serovars Typhimurium monophasic (79.3%) and Bovismorbificans (10.3%), and exhibited a multi-drug resistance profile (58.6%). Risk factor analysis identified feed composition, type/variety of vegetation available, and silos’ cleaning/disinfection as the main factors associated with Salmonella prevalence. Clear differences in the intestinal microbiota were found between Salmonella-positive and Salmonella-negative populations, showing the former with increasing Proteobacteria and decreasing Bacteroides populations. Butyrate and propionate producers including Clostridium, Turicibacter, Bacteroidaceae_uc, and Lactobacillus were more abundant in the Salmonella-negative group, whereas acetate producers like Sporobacter, Escherichia or Enterobacter were more abundant in the Salmonella-positive group. Overall, our results suggest that the presence of Salmonella in free-range pigs is directly related to the natural vegetation accessible, determining the composition of the intestinal microbiota.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Genetic characterization and biofilm formation of potentially pathogenic foodborne Arcobacter isolates

Various species of the genus Arcobacter are regarded as emerging food pathogens and can be cause of human gastroenteric illness, among others. In order to gain knowledge on the risk associated with the presence of arcobacters in retail foods, this study aimed to determine their presence in a variety of products; to evaluate the genetic diversity and the occurrence of virulence and biofilm-associated genes in the isolated strains; and to assess their biofilm activity on polystyrene, borosilicate and stainless steel. Arcobacters were detected in the 22.3% of the analysed samples and the 83 recovered isolates were identified as A. butzleri (n = 53), A. cryaerophilus (n = 24), A. skirrowii (n = 2), A. thereius (n = 3) and A. vitoriensis (n = 1). They were isolated from virtually all tested food types, but mostly from squids and turkey meat (contamination levels of 60% and 40%, respectively). MLST differentiated 68 STs, most of which were novel (89.7%) and represented by a single strain (86.9%). Five novel STs were detected in various isolates derived from seafood, and the statistical analysis revealed their potential association with that type of food product (p < 0,001). All the isolates except one harboured virulence-associated genes and the highest incidence was noted for A. butzleri. Nineteen isolates (23.5%) were able to form biofilms on the different surfaces tested and, of note; glass enhanced the adhesion ability of the majority of them (84.2%). The results highlight the role that common food products can have in the transmission of Arcobacter spp., the pathogenic potential of the different species, and the survival and growth ability of several of them on different food contact surfaces. Therefore, the study provides interesting information regarding the risk arcoThis work was supported by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness [project number AGL2014-56179-P, co-financed with FEDER funds]; the University of the Basque Country [grant number PPG17/27]; and by the Basque Government [Project number PA20/03]

Anianabacter salinae gen. nov., sp. nov. ASV31T, a Facultative Alkaliphilic and Extremely Halotolerant Bacterium Isolated from Brine of a Millennial Continental Saltern

During a prokaryotic diversity study in Añana Salt Valley, a new Rhodobacteraceae member, designated ASV31T, was isolated from Santa Engracia spring water. It was extremely halotolerant, tolerating up to 23% NaCl, and facultatively alkaliphilic, growing at pH 6.5–9.5 (optimum at 7.0–9.5). The isolate was a Gram-negative, rod-shaped, aerobic and non-motile bacterium that formed beige-to-pink colonies on marine agar. According to a 16S rRNA gene-based phylogenetic analysis, strain ASV31T forms a distinct branch of the family Rhodobacteraceae, with Thioclava pacifica DSM 10166T being its closest type strain (95.3%). This was confirmed with a phylogenomic tree and the values of ANI (73.9%), dDDH (19.3%), AAI (63.5%) and POCP (56.0%), which were below the genus/species level boundary. Additionally, an ability to degrade aromatic compounds and biosynthesise secondary metabolites was suggested by the genome of strain ASV31T. Distinguishing fatty acid profiles and polar lipid content were also observed. The genome size was 3.6 Mbp, with a DNA G+C content of 65.7%. Based on the data obtained, it was considered that strain ASV31T (=CECT 30309T = LMG 32242T) represents a new species of a new genus in the family Rhodobacteraceae, for which the name Anianabacter salinae gen. nov., sp. nov. is proposed.This research was funded by the University of the Basque Country UPV/EHU (grant number US19/01) and the Añana Salt Valley Foundation (specific agreement between the Añana Salt Valley Foundation and the University of the Basque Country UPV/EHU)

Intestinal microbiota composition in free-range pigs is associated with the presence of Salmonella

Extensive pig systems are gaining importance as quality production systems and as stand ard for sustainable rural development and animal welfare. However, the effect of natural food on Salmonella epidemiology remains unknown. Here we assessed the presence of Salmonella in the in testinal content, the risks factors associated, and the gut microbiota composition in pigs selected from Salmonella-free and high prevalence farms. The pathogen was found in 32.2% of animals and 83.3% of farms, showing large differences in prevalence between farms. Most isolates were serovars Typhimurium monophasic (79.3%) and Bovismorbificans (10.3%), exhibiting multi-drug resistance (58.6%). Risk factor analysis identified feed composition, type/variety of vegetation available, and silos' cleaning/disinfection, as main factors associated with Salmonella prevalence. Clear differences in the intestinal microbiota were found between Salmonella-positive and Salmonella-negative popu- lations, showing the former increasing Proteobacteria and decreasing Bacteroides populations. Butyr ate and propionate producers, including Clostridium, Turicibacter, Bacteroidaceae_uc, and Lactoba- cillus were enriched in the Salmonella-negative group whereas acetate producers like Sporobacter, Escherichia or Enterobacter were more abundant in the Salmonella-positive group. Overall, our results suggest that the presence of Salmonella in free-range pigs' gut is directly related to the natural veg- etation accessible, determining the composition of the intestinal microbiota.This work was funded by the Caja Navarra Foundation (project reference 70628)

Molecular Epidemiology, Antimicrobial Surveillance, and PK/PD Analysis to Guide the Treatment of Neisseria gonorrhoeae Infections

The aim of this study was to apply molecular epidemiology, antimicrobial surveillance, and PK/PD analysis to guide the antimicrobial treatment of gonococci infections in a region of the north of Spain. Antibiotic susceptibility testing was performed on all isolates (2017 to 2019, n = 202). A subset of 35 isolates intermediate or resistant to at least two antimicrobials were selected to search for resistance genes and genotyping through WGS. By Monte Carlo simulation, we estimated the probability of target attainment (PTA) and the cumulative fraction of response (CFR) of the antimicrobials used to treat gonorrhea, both indicative of the probability of treatment success. In total, 2.0%, 6.4%, 5.4%, and 48.2% of the isolates were resistant to ceftriaxone, cefixime, azithromycin, and ciprofloxacin, respectively. Twenty sequence types were identified. Detected mutations were related to antibiotic resistance. PK/PD analysis showed high probability of treatment success of the cephalosporins. In conclusion, multiple populations of N. gonorrhoeae were identified. We can confirm that ceftriaxone (even at the lowest dose: 250 mg) and oral cefixime are good candidates to treat gonorrhea. For patients allergic to cephalosporins, ciprofloxacin should be only used if the MIC is known and ≤0.125 mg/L; this antimicrobial is not recommended for empirical treatment.This research was funded by the University of the Basque Country UPV/EHU (GIU20/048; PA20/03), Spain

Fungal Diversity and Composition of the Continental Solar Saltern in Añana Salt Valley (Spain)

The Añana Salt Valley in Spain is an active continental solar saltern formed 220 million years ago. To date, no fungal genomic studies of continental salterns have been published, although DNA metabarcoding has recently expanded researchers’ ability to study microbial community structures. Accordingly, the aim of this present study was to evaluate fungal diversity using the internal transcribed spacer (ITS) metabarcoding at different locations along the saltern (springs, ponds, and groundwater) to describe the fungal community of this saline environment. A total of 380 fungal genera were detected. The ubiquity of Saccharomyces was observed in the saltern, although other halotolerant and halophilic fungi like Wallemia, Cladosporium, and Trimmatostroma were also detected. Most of the fungi observed in the saltern were saprotrophs. The fungal distribution appeared to be influenced by surrounding conditions, such as the plant and soil contact, cereal fields, and vineyards of this agricultural region.This research was funded by the University of the Basque Country UPV/EHU grant number US19/01 and the Añana Salt Valley Foundation (Specific Agreement between the Añana Salt Valley Foundation and the University of the Basque Country UPV/EHU)

Development of polymerase chain reaction based meth ods for Salmonella detection and their validation in food samples

224 p.[ES] Salmonella es uno de los patógenos alimentarios más importantes a nivel mundial y causante de enfermedades gastroentéricas en humanos y animales. La presencia de Salmonella en un alimento, sea en la cantidad que sea, se considera peligroso y por lo tanto no será apto para el consumo humano. Por ello, los controles microbiológicos rutinarios en la cadena alimentaria son de vital importancia para no comprometer la salud del consumidor. Los controles se deben realizar a lo largo de todo el proceso de elaboración del alimento, es decir, controlando desde las condiciones implantadas en la granja hasta la calidad del producto final que llegará al consumidor. Tradicionalmente los métodos microbiológicos empleados para detectar patógenos en los alimentos han sido métodos basados en el cultivo. El método tradicional de detección de Salmonella comprende cuatro fases: una primera fase de preenriquecimiento no selectivo, una segunda fase de enriquecimiento selectivo, un paso adicional de aislamiento en medios sólidos selectivos, y una última fase de confirmación mediante pruebas bioquímicas y serológicas. Estos procesos tradicionales de cultivo son laboriosos y alargan la obtención de los resultados hasta una semana. Las técnicas moleculares han sido un gran avance de las cuales la microbiología se ha beneficiado para desarrollar métodos nuevos de detección de patógenos. Entre ellas, las técnicas basadas en la amplificación de los ácidos nucleicos como la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) proporcionan una estrategia rápida y sensible para la detección de patógenos. Además, la mejora que ha supuesto la PCR a tiempo real permite obtener los resultados incluso en menos tiempo y evitar el procesado post-PCR que puede provocar contaminación cruzada debido a la manipulación de las muestras. En todo caso, para el desarrollo de métodos basados en PCR es esencial la elección de una diana genética adecuada a cada patógeno que permita diseñar técnicas totalmente específicas de la bacteria que se quiera detectar en cada caso. El objetivo principal de este trabajo fue crear métodos de detección de Salmonella basados en la PCR que facilitasen y disminuyesen el tiempo requerido para la obtención de los resultados. Para ello se cumplieron las siguientes etapas: i) elección de una diana genética específica de Salmonella, ii) desarrollo de una PCR para el diagnóstico de Salmonella, iii) desarrollo de sistemas de PCR a tiempo real para detección de Salmonella, iv) validación de los métodos de PCR a tiempo real diseñados frente al método tradicional de detección de Salmonella en muestras de alimentos. En primer lugar se estudiaron diferentes genes propuestos por diversos autores como dianas genéticas de Salmonella. Tras realizar diversas reacciones de PCR con las parejas de iniciadores correspondientes, se estableció que el gen más adecuado para utilizar como diana genética de Salmonella en métodos de PCR era el gen invA. La proteína codificada por este gen pertenece a un sistema de secreción totalmente necesario para causar la invasión bacteriana de las células epiteliales del intestino. Al ser un gen involucrado con la virulencia de Salmonella, presuntivamente estará en todos los aislamientos de Salmonella, o por lo menos, en todas las cepas virulentas. Una vez elegido el gen invA como diana genética específica de Salmonella se diseñó una PCR, utilizando los mismos iniciadores descritos anteriormente por Rahn K y colaboradores (1992), a la cual se añadió un control interno de amplificación diseñado específicamente en este trabajo. La incorporación de controles internos de amplificación a los métodos de PCR es esencial para detectar posibles inhibiciones en las reacciones de PCR, causadas principalmente por componentes presentes en los alimentos. Las 40 cepas de Salmonella analizadas mediante esta PCR mostraron un resultado positivo para la amplificación del gen invA, mientras que todos los aislamientos analizados de microorganismos relacionados con esa bacteria fueron negativos. Con la intención de disminuir aun más los tiempos de obtención de resultados, se decidió adaptar esa PCR a un formato de PCR a tiempo real. Existen diferentes sistemas de detección utilizados en PCR a tiempo real. En este trabajo se eligió diseñar por un lado una PCR utilizando sondas TaqMan® como sistema detección, y por otro lado una PCR a tiempo real utilizando SYBR Green I. En la PCR a tiempo real con SYBR Green I los iniciadores utilizados fueron los mismos que para la PCR convencional, pero se diseñó un nuevo control interno adecuado para la PCR a tiempo real. Sin embargo, para la PCR a tiempo real con sonda se diseñaron unos nuevos iniciadores y una sonda que hibridase específicamente con el fragmento amplificado por esos iniciadores, además de un nuevo control interno que fuese detectado mediante otra sonda adicional marcada con un fluoróforo diferente. La especificidad de ambas reacciones de PCR a tiempo real fue probada tanto de forma teórica mediante programas informáticos como de manera experimental. La tecnología con sondas TaqMan® resultó ser más sensible que la tecnología SYBR Green I en este estudio, aunque por otro lado, la ausencia de reacción de la sonda con una de las cepas de Salmonella analizadas indicó que esa tecnología era a su vez menos específica que el SYBR Green I. Los métodos de PCR a tiempo real fueron comparados frente al método tradicional de detección de Salmonella en diferentes muestras de alimentos. Para realizar esta validación se siguió lo descrito en la norma ISO 16140:2003. Se calcularon tanto la inclusividad y exclusividad de los métodos, así como la eficacia relativa, especificidad relativa y sensibilidad relativa de los métodos moleculares, y también el nivel de detección relativa de éstos. En la PCR a tiempo real con sonda TaqMan® se utilizaron dos master mix comerciales diferentes (una master mix de Takara y otra de Applied Biosystems) con el fin de analizar también la influencia que ejerce la master mix empleada en los resultados. Para el cálculo de la inclusividad se utilizaron 50 aislamientos diferentes de Salmonella según lo indicado en la citada norma ISO, obteniendo para todos ellos un resultado positivo para la detección del gen invA. Para el test de exclusividad se analizaron 30 cepas de microorganismos relacionados con Salmonella, los cuales mostraron un resultado negativo en las reacciones de amplificación. Para el cálculo de la eficacia, especificidad y sensibilidad relativas se utilizaron 309 muestras de alimentos diferentes según las categorías alimentarias descrita en la norma ISO. Para obtener una amplia variedad de resultados positivos y negativos, aproximadamente la mitad de esas 309 muestras de alimentos fueron contaminadas artificialmente con Salmonella. Se obtuvieron unos valores comprendidos entre 80%-100%, excepto en la sensibilidad relativa de la PCR a tiempo real con sonda utilizando la master mix de Applied Biosystems que fue del 62,4%. Los niveles de detección relativa se calcularon según lo descrito en la norma ISO para cinco alimentos diferentes (uno de cada categoría alimentaria), utilizando para cada alimento 5 o 6 niveles de contaminación. Los resultados obtenidos abarcaron un rango de 0,1-10 células/25gr de alimento. Excepto en la PCR a tiempo real con sonda en la cual el límite de detección en muestras de pescado fue de alrededor de 100 células/25gr. A lo largo de todo el análisis realizado en alimentos se identificaron diferentes etapas que se consideraron críticas a la hora de emplear métodos moleculares para la detección de patógenos en alimentos. Uno de los principales problemas surgidos fue la influencia que ejercía la composición del alimento a lo largo de todo el proceso. Los mayores problemas se detectaron en los alimentos con un alto contenido en grasa, dado que la grasa influye notablemente en la capacidad de detección de los métodos moleculares. Otro de los puntos críticos fue el método de extracción de ADN, que puede influir en la concentración del ADN recuperado y en su calidad. Por todo ello, y al no existir un protocolo universal de procesamiento de las muestras previo a las reacciones de PCR, se debe optimizar cada método de análisis teniendo en cuenta el alimento que se debe analizar y el patógeno que se quiere detectar, y amoldarlo a las circunstancias especiales de cada laboratorio.La presente Tesis Doctoral ha sido realizada gracias a la financiación recibida de los siguientes Proyectos de Investigación: 1.Microbiología molecular: desarrollo de metodologías diagnósticas para bacterias y hongos basadas en el uso de herramienta s bioinformáticas y técnicas moleculares. Grupos de Investigación Consolidados del SistemaUniversitario Vasco financiado por el Gobierno Vasco: IT-343-10 (2010-2012). 2.Nuevas aproximaciones a la detección de patógenos mediante el uso de la genómica microbiana, la microbiología molecular y la inmunología. Convocatoria Saiotek 2009. Proyectos de Incubación Científico-Tecnológicos. UPV/EHU: S-PC09UN04 (2009-2011). 3.Subvención General a Grupo de Investigación de la UPV/EHU: GIU05/42(2006-2008) y GIU08/20 (2009-2011). 4. Detección de Salmonella en alimentos de forma rápida y específica mediante técnicas genéticas. Acciones Destinadas a la Investigación, el Desarrollo y la Innovación Tecnológica de productos industriales en Álava. UPV/EHU-Dpto. de Educación, Universidades e Investigación de Gobierno Vasco: PFA07/07 (2008). 5. Contratos de I+D en Empresas: Contratos de I+D con Laboratorios Bromatológicos Araba S.A. para la realización de un método de detección de Salmonella en alimentos. (2002-2007).--- Becas: 1. Ayuda para la Formación de Personal Investigador en la Universidad de País Vasco. (Junio 2007-Mayo 2011. 2. Ayudas para fomentar la realización de tesis en eus kara en la Universidad del País Vasco. (Octubre 2006-Mayo 2007)

Development of polymerase chain reaction based meth ods for Salmonella detection and their validation in food samples

224 p.[ES] Salmonella es uno de los patógenos alimentarios más importantes a nivel mundial y causante de enfermedades gastroentéricas en humanos y animales. La presencia de Salmonella en un alimento, sea en la cantidad que sea, se considera peligroso y por lo tanto no será apto para el consumo humano. Por ello, los controles microbiológicos rutinarios en la cadena alimentaria son de vital importancia para no comprometer la salud del consumidor. Los controles se deben realizar a lo largo de todo el proceso de elaboración del alimento, es decir, controlando desde las condiciones implantadas en la granja hasta la calidad del producto final que llegará al consumidor. Tradicionalmente los métodos microbiológicos empleados para detectar patógenos en los alimentos han sido métodos basados en el cultivo. El método tradicional de detección de Salmonella comprende cuatro fases: una primera fase de preenriquecimiento no selectivo, una segunda fase de enriquecimiento selectivo, un paso adicional de aislamiento en medios sólidos selectivos, y una última fase de confirmación mediante pruebas bioquímicas y serológicas. Estos procesos tradicionales de cultivo son laboriosos y alargan la obtención de los resultados hasta una semana. Las técnicas moleculares han sido un gran avance de las cuales la microbiología se ha beneficiado para desarrollar métodos nuevos de detección de patógenos. Entre ellas, las técnicas basadas en la amplificación de los ácidos nucleicos como la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) proporcionan una estrategia rápida y sensible para la detección de patógenos. Además, la mejora que ha supuesto la PCR a tiempo real permite obtener los resultados incluso en menos tiempo y evitar el procesado post-PCR que puede provocar contaminación cruzada debido a la manipulación de las muestras. En todo caso, para el desarrollo de métodos basados en PCR es esencial la elección de una diana genética adecuada a cada patógeno que permita diseñar técnicas totalmente específicas de la bacteria que se quiera detectar en cada caso. El objetivo principal de este trabajo fue crear métodos de detección de Salmonella basados en la PCR que facilitasen y disminuyesen el tiempo requerido para la obtención de los resultados. Para ello se cumplieron las siguientes etapas: i) elección de una diana genética específica de Salmonella, ii) desarrollo de una PCR para el diagnóstico de Salmonella, iii) desarrollo de sistemas de PCR a tiempo real para detección de Salmonella, iv) validación de los métodos de PCR a tiempo real diseñados frente al método tradicional de detección de Salmonella en muestras de alimentos. En primer lugar se estudiaron diferentes genes propuestos por diversos autores como dianas genéticas de Salmonella. Tras realizar diversas reacciones de PCR con las parejas de iniciadores correspondientes, se estableció que el gen más adecuado para utilizar como diana genética de Salmonella en métodos de PCR era el gen invA. La proteína codificada por este gen pertenece a un sistema de secreción totalmente necesario para causar la invasión bacteriana de las células epiteliales del intestino. Al ser un gen involucrado con la virulencia de Salmonella, presuntivamente estará en todos los aislamientos de Salmonella, o por lo menos, en todas las cepas virulentas. Una vez elegido el gen invA como diana genética específica de Salmonella se diseñó una PCR, utilizando los mismos iniciadores descritos anteriormente por Rahn K y colaboradores (1992), a la cual se añadió un control interno de amplificación diseñado específicamente en este trabajo. La incorporación de controles internos de amplificación a los métodos de PCR es esencial para detectar posibles inhibiciones en las reacciones de PCR, causadas principalmente por componentes presentes en los alimentos. Las 40 cepas de Salmonella analizadas mediante esta PCR mostraron un resultado positivo para la amplificación del gen invA, mientras que todos los aislamientos analizados de microorganismos relacionados con esa bacteria fueron negativos. Con la intención de disminuir aun más los tiempos de obtención de resultados, se decidió adaptar esa PCR a un formato de PCR a tiempo real. Existen diferentes sistemas de detección utilizados en PCR a tiempo real. En este trabajo se eligió diseñar por un lado una PCR utilizando sondas TaqMan® como sistema detección, y por otro lado una PCR a tiempo real utilizando SYBR Green I. En la PCR a tiempo real con SYBR Green I los iniciadores utilizados fueron los mismos que para la PCR convencional, pero se diseñó un nuevo control interno adecuado para la PCR a tiempo real. Sin embargo, para la PCR a tiempo real con sonda se diseñaron unos nuevos iniciadores y una sonda que hibridase específicamente con el fragmento amplificado por esos iniciadores, además de un nuevo control interno que fuese detectado mediante otra sonda adicional marcada con un fluoróforo diferente. La especificidad de ambas reacciones de PCR a tiempo real fue probada tanto de forma teórica mediante programas informáticos como de manera experimental. La tecnología con sondas TaqMan® resultó ser más sensible que la tecnología SYBR Green I en este estudio, aunque por otro lado, la ausencia de reacción de la sonda con una de las cepas de Salmonella analizadas indicó que esa tecnología era a su vez menos específica que el SYBR Green I. Los métodos de PCR a tiempo real fueron comparados frente al método tradicional de detección de Salmonella en diferentes muestras de alimentos. Para realizar esta validación se siguió lo descrito en la norma ISO 16140:2003. Se calcularon tanto la inclusividad y exclusividad de los métodos, así como la eficacia relativa, especificidad relativa y sensibilidad relativa de los métodos moleculares, y también el nivel de detección relativa de éstos. En la PCR a tiempo real con sonda TaqMan® se utilizaron dos master mix comerciales diferentes (una master mix de Takara y otra de Applied Biosystems) con el fin de analizar también la influencia que ejerce la master mix empleada en los resultados. Para el cálculo de la inclusividad se utilizaron 50 aislamientos diferentes de Salmonella según lo indicado en la citada norma ISO, obteniendo para todos ellos un resultado positivo para la detección del gen invA. Para el test de exclusividad se analizaron 30 cepas de microorganismos relacionados con Salmonella, los cuales mostraron un resultado negativo en las reacciones de amplificación. Para el cálculo de la eficacia, especificidad y sensibilidad relativas se utilizaron 309 muestras de alimentos diferentes según las categorías alimentarias descrita en la norma ISO. Para obtener una amplia variedad de resultados positivos y negativos, aproximadamente la mitad de esas 309 muestras de alimentos fueron contaminadas artificialmente con Salmonella. Se obtuvieron unos valores comprendidos entre 80%-100%, excepto en la sensibilidad relativa de la PCR a tiempo real con sonda utilizando la master mix de Applied Biosystems que fue del 62,4%. Los niveles de detección relativa se calcularon según lo descrito en la norma ISO para cinco alimentos diferentes (uno de cada categoría alimentaria), utilizando para cada alimento 5 o 6 niveles de contaminación. Los resultados obtenidos abarcaron un rango de 0,1-10 células/25gr de alimento. Excepto en la PCR a tiempo real con sonda en la cual el límite de detección en muestras de pescado fue de alrededor de 100 células/25gr. A lo largo de todo el análisis realizado en alimentos se identificaron diferentes etapas que se consideraron críticas a la hora de emplear métodos moleculares para la detección de patógenos en alimentos. Uno de los principales problemas surgidos fue la influencia que ejercía la composición del alimento a lo largo de todo el proceso. Los mayores problemas se detectaron en los alimentos con un alto contenido en grasa, dado que la grasa influye notablemente en la capacidad de detección de los métodos moleculares. Otro de los puntos críticos fue el método de extracción de ADN, que puede influir en la concentración del ADN recuperado y en su calidad. Por todo ello, y al no existir un protocolo universal de procesamiento de las muestras previo a las reacciones de PCR, se debe optimizar cada método de análisis teniendo en cuenta el alimento que se debe analizar y el patógeno que se quiere detectar, y amoldarlo a las circunstancias especiales de cada laboratorio.La presente Tesis Doctoral ha sido realizada gracias a la financiación recibida de los siguientes Proyectos de Investigación: 1.Microbiología molecular: desarrollo de metodologías diagnósticas para bacterias y hongos basadas en el uso de herramienta s bioinformáticas y técnicas moleculares. Grupos de Investigación Consolidados del SistemaUniversitario Vasco financiado por el Gobierno Vasco: IT-343-10 (2010-2012). 2.Nuevas aproximaciones a la detección de patógenos mediante el uso de la genómica microbiana, la microbiología molecular y la inmunología. Convocatoria Saiotek 2009. Proyectos de Incubación Científico-Tecnológicos. UPV/EHU: S-PC09UN04 (2009-2011). 3.Subvención General a Grupo de Investigación de la UPV/EHU: GIU05/42(2006-2008) y GIU08/20 (2009-2011). 4. Detección de Salmonella en alimentos de forma rápida y específica mediante técnicas genéticas. Acciones Destinadas a la Investigación, el Desarrollo y la Innovación Tecnológica de productos industriales en Álava. UPV/EHU-Dpto. de Educación, Universidades e Investigación de Gobierno Vasco: PFA07/07 (2008). 5. Contratos de I+D en Empresas: Contratos de I+D con Laboratorios Bromatológicos Araba S.A. para la realización de un método de detección de Salmonella en alimentos. (2002-2007).--- Becas: 1. Ayuda para la Formación de Personal Investigador en la Universidad de País Vasco. (Junio 2007-Mayo 2011. 2. Ayudas para fomentar la realización de tesis en eus kara en la Universidad del País Vasco. (Octubre 2006-Mayo 2007)

Online exercise for the design and simulation of PCR and PCR-RFLP experiments

[EN] Background: Polymerase Chain Reaction (PCR) and Restriction Fragment Length Polymorphism of PCR products (PCR-RFLP) are extensively used molecular biology techniques. An exercise for the design and simulation of PCR and PCR-RFLP experiments will be a useful educational tool. Findings: An online PCR and PCR-RFLP exercise has been create that requires users to find the target genes,compare them, design primers, search for restriction endonucleases, and finally to simulate the experiment. Each user of the service is randomly assigned a gene from Escherichia coli; to complete the exercise, users must design an experiment capable of distinguishing among E. coli strains. By applying the experimental procedure to all completely sequenced E. coli, a basic understanding of strain comparison and clustering can also be acquired. Comparison of results obtained in different experiments is also very instructive. Conclusions: The exercise is freely available at http://insilico.ehu.es/edu