Anomalie cromosomiche strutturali come causa di alterata funzionalit\ue0 genica, piastrinopenia e conseguente suscettibilit\ue0 allo sviluppo di mielodispasie e/o leucemie.

Il presente studio \ue8 stato effettuato su quattro diversi pazienti portatori di anomalie cromosomiche strutturali sia di natura acquisita che costituzionale. Tutti i riarrangiamenti alterano l'espressione di specifici geni e possono essere causativi delle forme di piastrinopenia da cui i nostri pazienti sono affetti. Ciascuna anomalia \ue8 stata indagata con metodi di citogenetica standard, di ibridazione in situ fluorescente (FISH), di comparative genomic hybridization su array (a-CGH) e, laddove necessario, sono state utilizzate tecniche di PCR real-time quantitativa e/o Multipainting. In dettaglio vengono presentati i seguenti casi: CASO 1: paziente maschio affetto da anemia aplastica grave con scarsa presenza a livello midollare della componente granulopoietica e la completa assenza di megacariociti. E\u2019 stata evidenziata nel midollo un\u2019 anomalia cromosomica clonale a carico di un cromosoma n\ub0 21. L'analisi di FISH effettuata con la sonda informativa CTD-2235K24 ha evidenziato la delezione degli esoni 2-8 di RUNX1, mentre le sonde BAC RP11-88N2 e RP11-625E21 hanno mostrato una duplicazione invertita delle bande q22.2 e q22.3, confermata poi anche dall'analisi di a-CGH. \uc8 stato dimostrato con esperimenti di real-time PCR quantitativa che l\u2019evento di delezione a carico degli esoni 2-8 del gene RUNX1 comporta una significativa riduzione nell\u2019espressione del gene stesso. Tale ipoespressione spiega le condizioni ematologiche del paziente, in particolare la completa assenza di megacariociti, vista la nota importanza di RUNX1 nella maturazione degli stessi e nella produzione delle piastrine. In prelievi successivi il paziente \ue8 andato incontro a una riduzione del clone con il cromosoma der(21) ma ha acquisito un secondo clone caratterizzato da una delezione interstiziale delle braccia lunghe di un cromosoma 13: in particolare la regione interessata (13q13.3-q21.31) risulta da letteratura essere spesso associata a sindromi mielodisplastiche (MDS) e pazienti affetti da MDS con del(13q) hanno una prognosi negativa per l\u2019evoluzione in leucemia. Questi due cloni sono stati monitorati nel tempo tramite FISH al fine di mantenere sotto controllo la disfunzione midollare ed eventuali sviluppi mielodisplastici/leucemici. CASO 2: paziente femmina affetta da piastrinopenia cronica. Su prelievi di midollo, sangue periferico e fibroblasti cutanei \ue8 stata riscontrata un\u2019anomalia cromosomica costituzionale a carico di un cromosoma n\ub0 21 caratterizzata da un evento di inversione pericentrica. Analisi di FISH hanno dimostrato rottura del gene RUNX1 tra il 4\ub0 e il 5\ub0 esone. L'analisi di a-CGH ha confermato i risultati di FISH e mostrato anche una duplicazione degli esoni 2-3-4 del medesimo gene, una duplicazione della banda 21q22.2 e una grossa regione di delezione terminale di 2,35 Mb. La FISH effettuata con la sonda fosmidica WI2-1915K14 ha confermato la duplicazione degli esoni 2-3-4 di RUNX1, che sono ritenuti sul braccio lungo del cromosoma invertito, e, con la sonda BAC RP11-88N2, la delezione terminale. La Real-time quantitativa ha mostrato una riduzione nell'espressione relativa del gene RUNX1. Anche in questo caso gli eventi di rottura e duplicazione, di natura costituzionale, spiegano la piastrinopenia di cui la nostra paziente \ue8 affetta. CASO 3: paziente maschio con fenotipo clinico suggestivo per trombocitopenia amegacariocitica congenita (CAMT) in assenza, per\uf2, delle mutazioni del gene MPL riconosciute come causa diretta della patologia. La CAMT, come le altre sindromi da insufficienza midollare, potrebbe essere uno stadio pre-leucemico, anche se i casi riportati in letteratura sono assai rari. E\u2019 stata evidenziata un\u2019anomalia cromosomica acquisita a carico di un cromosoma n\ub0 1, caratterizzata da un evento di inversione paracentrica con punti di rottura in p13 e p36. Le analisi di FISH effettuate con sonde BAC informative hanno confermato l'evento di inversione e la presenza di due regioni di delezione prossime ai punti rottura, evidenziate prima solo con l'a-CGH. La Real-time quantitativa ha evidenziato una ridotta espressione del gene MPL, il quale non risulta rotto dall'evento di inversione ma solo traslocato in una regione pi\uf9 centromerica dello stesso cromosoma: l\u2019ipotesi di un effetto di posizione sul gene MPL potrebbe spiegare il fenotipo simil-CAMT riscontrato nel paziente. CASO 4: paziente femmina con quadro morfologico del midollo e delle piastrine compatibile con Sindrome di Paris-Trousseau: si tratta di una forma costituzionale di piastrinopenia con inclusione di piastrine caratterizzate da granuli \u3b1 giganti e causata da delezione terminale di un cromosoma n\ub0 11, in una regione dove \ue8 mappato il gene FLI1 (11q24), causativo della patologia. Da analisi su midollo \ue8 stato evidenziato un cariotipo complesso caratterizzato dalla presenza di un cromosoma derivativo 11 da traslocazione t(3;11)(q21;q25), di un cromosoma derivativo 2 e da monosomia 3. Analisi di MultiFISH a a-CGH hanno meglio chiarito la natura del riarrangiamento. La regione monosomica del cromosoma 11, confermata con FISH con la sonda BAC RP11-744N12, dimostra la perdita clonale di una copia del gene FLI1: questo spiega il quadro di piastrinopenia della paziente. CONCLUSIONI La rottura del gene RUNX1 (CASO 1 e 2), la perdita di una copia del gene FLI1 (CASO 4) e l'effetto di posizione del gene MPL (CASO 3) comportano disfunzione midollare. Nei casi 1 e 2 la rottura del gene \ue8 causa diretta della piastrinopenia di cui soffrono, poich\ue9 questo gene \ue8 coinvolto nella maturazione dei megacariociti e nella produzione delle piastrine. La Real-time quantitativa ha dimostrato una riduzione nell'espressione relativa di RUNX1. Nel CASO l'effetto di posizione a carico del gene MPL \ue8 probabilmente causa del fenotipo simil-CAMT del paziente: la Real-time quantitativa ha confemato una riduzione nell'espressione del gene. Nel CASO 4 un complesso riarrangiamento cromosomico strutturale comporta la perdita clonale di una copia del gene FLI1, che \ue8 la causa della piastrinopenia della paziente

Comparative genomic hybridization on microarray (a-CGH) in constitutional and acquired mosaicism may detect as low as 8% abnormal cells

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>The results of cytogenetic investigations on unbalanced chromosome anomalies, both constitutional and acquired, were largely improved by comparative genomic hybridization on microarray (a-CGH), but in mosaicism the ability of a-CGH to reliably detect imbalances is not yet well established. This problem of sensitivity is even more relevant in acquired mosaicism in neoplastic diseases, where cells carrying acquired imbalances coexist with normal cells, in particular when the proportion of abnormal cells may be low.</p> <p>We constructed a synthetic mosaicism by mixing the DNA of three patients carrying altogether seven chromosome imbalances with normal sex-matched DNA. Dilutions were prepared mimicking 5%, 6%, 7%, 8%, 10% and 15% levels of mosaicism. Oligomer-based a-CGH (244 K whole-genome system) was applied on the patients' DNA and customized slides designed around the regions of imbalance were used for the synthetic mosaics.</p> <p>Results and conclusions</p> <p>The a-CGH on the synthetic mosaics proved to be able to detect as low as 8% abnormal cells in the tissue examined. Although in our experiment some regions of imbalances escaped to be revealed at this level, and were detected only at 10-15% level, it should be remarked that these ones were the smallest analyzed, and that the imbalances recurrent as clonal anomalies in cancer and leukaemia are similar in size to those revealed at 8% level.</p

Mitochondrial DNA control region variation in Sanfratellano horse and two other Sicilian autochthonous breeds

Mitochondrial D-loop hypervariable region was analysed in 20 Sanfratellano and two other Sicilian autochthonous horse breeds (20 Sicilian Oriental Purebred and 20 Sicilian Indigenous) in order to investigate matrilineal genetic diversity. A total of 20 different haplotypes were identified sequencing a fragment of 397 bp; overall, haplotypes showed 31 polymorphic sites (7.8%). High diversity was detected in Sanfratellano (11 haplotypes) and Sicilian Indigenous (13 haplotypes), whereas only one haplotype was found in Sicilian Oriental Purebred. Sanfratellano sequences were compared with those belonging to the other Sicilian autochthonous horses and 118 sequences selected from the GenBank database in order to calculate the statistics of molecular diversity. Six haplotypes were exclusive of Sanfratellano which shares haplotype C, D, H, and O with the Sicilian Indigenous and haplotype U with the Sicilian Oriental Purebred; not significant differentiation was found between Sanfratellano and Sicilian Indigenous. BLAST search showed Sicilian haplotypes overlap with the database sequences but for three. Phylogenetic analysis did not show monophyletic group for Sanfratellano samples or the other breeds included in this analysis

Chromosome anomalies in bone marrow as primarycause of aplastic or hypoplastic conditions andperipheral cytopenia: disorders due to secondaryimpairment of RUNX1 and MPL genes

Background Chromosome changes in the bone marrow (BM) of patients with persistent cytopenia are often considered diagnostic for a myelodysplastic syndrome (MDS). Comprehensive cytogenetic evaluations may give evidence of the real pathogenetic role of these changes in cases with cytopenia without morphological signs of MDS. Results Chromosome anomalies were found in the BM of three patients, without any morphological evidence of MDS: 1) an acquired complex rearrangement of chromosome 21 in a boy with severe aplastic anaemia (SAA); the rearrangement caused the loss of exons 2-8 of the RUNX1 gene with subsequent hypoexpression. 2) a constitutional complex rearrangement of chromosome 21 in a girl with congenital thrombocytopenia; the rearrangement led to RUNX1 disruption and hypoexpression. 3) an acquired paracentric inversion of chromosome 1, in which two regions at the breakpoints were shown to be lost, in a boy with aplastic anaemia; the MPL gene, localized in chromosome 1 short arms was not mutated neither disrupted, but its expression was severely reduced: we postulate that the aplastic anaemia was due to position effects acting both in cis and in trans, and causing Congenital Amegakaryocytic Thrombocytopenia (CAMT). Conclusions A clonal anomaly in BM does not imply per se a diagnosis of MDS: a subgroup of BM hypoplastic disorders is directly due to chromosome structural anomalies with effects on specific genes, as was the case of RUNX1 and MPL in the patients here reported with diagnosis of SAA, thrombocytopenia, and CAMT. The anomaly may be either acquired or constitutional, and it may act by deletion/disruption of the gene, or by position effects. Full cytogenetic investigations, including a-CGH, should always be part of the diagnostic evaluation of patients with BM aplasia/hypoplasia and peripheral cytopenias

Anomalie cromosomiche strutturali come causa di alterata funzionalità genica, piastrinopenia e conseguente suscettibilità allo sviluppo di mielodispasie e/o leucemie.

Il presente studio è stato effettuato su quattro diversi pazienti portatori di anomalie cromosomiche strutturali sia di natura acquisita che costituzionale. Tutti i riarrangiamenti alterano l'espressione di specifici geni e possono essere causativi delle forme di piastrinopenia da cui i nostri pazienti sono affetti. Ciascuna anomalia è stata indagata con metodi di citogenetica standard, di ibridazione in situ fluorescente (FISH), di comparative genomic hybridization su array (a-CGH) e, laddove necessario, sono state utilizzate tecniche di PCR real-time quantitativa e/o Multipainting. In dettaglio vengono presentati i seguenti casi: CASO 1: paziente maschio affetto da anemia aplastica grave con scarsa presenza a livello midollare della componente granulopoietica e la completa assenza di megacariociti. E’ stata evidenziata nel midollo un’ anomalia cromosomica clonale a carico di un cromosoma n° 21. L'analisi di FISH effettuata con la sonda informativa CTD-2235K24 ha evidenziato la delezione degli esoni 2-8 di RUNX1, mentre le sonde BAC RP11-88N2 e RP11-625E21 hanno mostrato una duplicazione invertita delle bande q22.2 e q22.3, confermata poi anche dall'analisi di a-CGH. È stato dimostrato con esperimenti di real-time PCR quantitativa che l’evento di delezione a carico degli esoni 2-8 del gene RUNX1 comporta una significativa riduzione nell’espressione del gene stesso. Tale ipoespressione spiega le condizioni ematologiche del paziente, in particolare la completa assenza di megacariociti, vista la nota importanza di RUNX1 nella maturazione degli stessi e nella produzione delle piastrine. In prelievi successivi il paziente è andato incontro a una riduzione del clone con il cromosoma der(21) ma ha acquisito un secondo clone caratterizzato da una delezione interstiziale delle braccia lunghe di un cromosoma 13: in particolare la regione interessata (13q13.3-q21.31) risulta da letteratura essere spesso associata a sindromi mielodisplastiche (MDS) e pazienti affetti da MDS con del(13q) hanno una prognosi negativa per l’evoluzione in leucemia. Questi due cloni sono stati monitorati nel tempo tramite FISH al fine di mantenere sotto controllo la disfunzione midollare ed eventuali sviluppi mielodisplastici/leucemici. CASO 2: paziente femmina affetta da piastrinopenia cronica. Su prelievi di midollo, sangue periferico e fibroblasti cutanei è stata riscontrata un’anomalia cromosomica costituzionale a carico di un cromosoma n° 21 caratterizzata da un evento di inversione pericentrica. Analisi di FISH hanno dimostrato rottura del gene RUNX1 tra il 4° e il 5° esone. L'analisi di a-CGH ha confermato i risultati di FISH e mostrato anche una duplicazione degli esoni 2-3-4 del medesimo gene, una duplicazione della banda 21q22.2 e una grossa regione di delezione terminale di 2,35 Mb. La FISH effettuata con la sonda fosmidica WI2-1915K14 ha confermato la duplicazione degli esoni 2-3-4 di RUNX1, che sono ritenuti sul braccio lungo del cromosoma invertito, e, con la sonda BAC RP11-88N2, la delezione terminale. La Real-time quantitativa ha mostrato una riduzione nell'espressione relativa del gene RUNX1. Anche in questo caso gli eventi di rottura e duplicazione, di natura costituzionale, spiegano la piastrinopenia di cui la nostra paziente è affetta. CASO 3: paziente maschio con fenotipo clinico suggestivo per trombocitopenia amegacariocitica congenita (CAMT) in assenza, però, delle mutazioni del gene MPL riconosciute come causa diretta della patologia. La CAMT, come le altre sindromi da insufficienza midollare, potrebbe essere uno stadio pre-leucemico, anche se i casi riportati in letteratura sono assai rari. E’ stata evidenziata un’anomalia cromosomica acquisita a carico di un cromosoma n° 1, caratterizzata da un evento di inversione paracentrica con punti di rottura in p13 e p36. Le analisi di FISH effettuate con sonde BAC informative hanno confermato l'evento di inversione e la presenza di due regioni di delezione prossime ai punti rottura, evidenziate prima solo con l'a-CGH. La Real-time quantitativa ha evidenziato una ridotta espressione del gene MPL, il quale non risulta rotto dall'evento di inversione ma solo traslocato in una regione più centromerica dello stesso cromosoma: l’ipotesi di un effetto di posizione sul gene MPL potrebbe spiegare il fenotipo simil-CAMT riscontrato nel paziente. CASO 4: paziente femmina con quadro morfologico del midollo e delle piastrine compatibile con Sindrome di Paris-Trousseau: si tratta di una forma costituzionale di piastrinopenia con inclusione di piastrine caratterizzate da granuli α giganti e causata da delezione terminale di un cromosoma n° 11, in una regione dove è mappato il gene FLI1 (11q24), causativo della patologia. Da analisi su midollo è stato evidenziato un cariotipo complesso caratterizzato dalla presenza di un cromosoma derivativo 11 da traslocazione t(3;11)(q21;q25), di un cromosoma derivativo 2 e da monosomia 3. Analisi di MultiFISH a a-CGH hanno meglio chiarito la natura del riarrangiamento. La regione monosomica del cromosoma 11, confermata con FISH con la sonda BAC RP11-744N12, dimostra la perdita clonale di una copia del gene FLI1: questo spiega il quadro di piastrinopenia della paziente. CONCLUSIONI La rottura del gene RUNX1 (CASO 1 e 2), la perdita di una copia del gene FLI1 (CASO 4) e l'effetto di posizione del gene MPL (CASO 3) comportano disfunzione midollare. Nei casi 1 e 2 la rottura del gene è causa diretta della piastrinopenia di cui soffrono, poiché questo gene è coinvolto nella maturazione dei megacariociti e nella produzione delle piastrine. La Real-time quantitativa ha dimostrato una riduzione nell'espressione relativa di RUNX1. Nel CASO l'effetto di posizione a carico del gene MPL è probabilmente causa del fenotipo simil-CAMT del paziente: la Real-time quantitativa ha confemato una riduzione nell'espressione del gene. Nel CASO 4 un complesso riarrangiamento cromosomico strutturale comporta la perdita clonale di una copia del gene FLI1, che è la causa della piastrinopenia della paziente

Evaluation of L929 fibroblast attachment and proliferation on Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS)-Immobilized chitosan in serum-containing/serum-free cultures

In this study, chitosan membranes prepared by the solvent casting method were modified with the Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS) sequence of fibronectin using the photochemical immobilization technique. The results obtained from attenuated total reflection-Fourier transform infrared spectra and X-ray photoelectron spectroscopy studies confirmed the successful immobilization of RGDS on chitosan membranes. The immobilized peptide concentration was determined by ninhydrin analysis on the order of 10(-7) mol/cm(2). In vitro cell culture studies were performed with L929 mouse fibroblasts to investigate the effect of biomodification on fibroblast cell behaviour in serum-free and 10% serum-containing media. The results obtained from cell culture studies pointed out the specific interactions between biosignal RGDS molecules and fibroblast cells. A triggered cell attachment and proliferation were observed on RGDS-modified chitosan membranes that were more distinguishable in serum-free medium. In addition, the photochemical immobilization technique was realized in the presence of a photomask that was used to immobilize the RGDS molecules in a defined micropattern. L929 mouse fibroblasts attached on the RGDS-micropatterned areas indicating integrin-mediated interactions