Mecanismes involucrats en la regulació de la resistència vascular intrahepàtica en la cirrosi: paper dels anticoagulants i antioxidants

En el primer estudi confirmem que el tractament amb enoxaparina es capaç de disminuir la pressió portal en rates amb cirrosi establerta i hipertensió portal. A més, la millora en la pressió portal es va produir sense efectes en el flux sanguini portal, suggerint una disminució en la resistència vascular intrahepàtica. La falta d’efectes de l’administració aguda d’enoxaparina en la pressió portal, en els paràmetres hemodinàmics sistèmics, i en el contingut de superòxid o GMPc, suggereix que l’enoxaparina no té un efecte directe sobre el component dinàmic de la resistència vascular intrahepàtica. Per acabar de confirmar aquests resultats, es va examinar la resposta dependent d’endoteli al vasodilatador acetilcolina i no es van observar diferències entre les rates tractades amb enoxaparina i les rates tractades amb vehicle en cap dels dos models de cirrosi.. A més a més, tot i que en els tractaments de més llarga durada amb enoxaparina es van observar sobretot millores en les alteracions arquitecturals, es van observar també canvis en el to vascular. Es van disminuir els nivells d’estrès oxidatiu, de proteïnes nitrotirosinades i es va augmentar en el contingut de GMPc. A més a més, es va observar una disminució de la ratio p-Moesina/Moesina en les rates tractades amb enoxaparina, suggerint que el tractament amb enoxaparina pot modular el to vascular mitjançant la relaxació de les CHE, almenys a llarg termini. Tot i això, s’ha de tenir en compte que aquest canvis en el to vascular poden ser deguts a la millora de l’alteració estructural observada. És cert que el tractament amb enoxaparina ja es va descriure com a un bon tractament per a millorar la fibrosi hepàtica en models de dany hepàtic lleu. El nostre estudi amplia aquestes observacions a models amb cirrosi establerta. El tractament amb enoxaparina va ser iniciat en el moment on es va aturar l’administració del tòxic (tant CCl4 com TAA) com a model de regressió de malaltia avançada, o es va administrar alhora amb el tòxic, com a model de prevenció de la progressió de la cirrosi, en el model de TAA. Això ens va permetre analitzar els efectes del tractament amb enoxaparina en dos escenaris diferents. En el model de regressió amb CCl4, les rates que van rebre durant 3 setmanes el tractament van tenir més temps de regressió espontània de la fibrosi que les rates que van rebre només una setmana de tractament. Tot i això, tant les d’una setmana de tractament com les de 3 setmanes de tractament van tenir una disminució del 25% del contingut de col·lagen analitzat per tinció de Sirius Red. Això també es va observar en el model de cirrosi de TAA tant en regressió com en prevenció. Tot els resultats van cap a la mateixa direcció i suggereixen el paper de l’enoxaparina en disminució de la fibrosi hepàtica. A més, es va observar una disminució dels nivells d’activació de les CHE en les rates tractades amb enoxaparina, tant a nivell de teixit com en cèl·lula aïllada de rata tractada. A part de l’efecte de l’enoxaparina en la fibrosi hepàtica, es va observar la influència de del tractament en la prevenció d’esdeveniments trombòtics en la microcirculació hepàtica. De fet, s’ha suggerit que aquests podrien jugar un paper important en la progressió de la fibrosi hepàtica. Per explorar aquest efecte hem avaluat el contingut de fibrina en el parènquima hepàtic com a marcador de la formació de microtrombes. Els fetges de rates tractades amb enoxaparina van tenir una menor deposició de fibrina. Aquest fet ja es va observar en les rates tractades durant una setmana, però l’efecte va ser més gran i significatiu en les rates tractades durant 3 setmanes. Aquestes troballes confirmen la connexió que hi ha entre trombosi i fibrosi hepàtica i consolida el concepte de l’ús dels anticoagulants per a la prevenció/dissolució dels microtrombes per a millorar la fibrosi hepàtica. Per contra, no es van observar canvis a nivell d’inflamació. Per tant, encara que no podem descartar completament el potencial efecte del tractament amb enoxaparina en la reducció de la inflamació, no sembla que aquests sigui el principal mecanisme responsable de la millora les alteracions arquitecturals en la cirrosi hepàtica. És important remarcar que els efectes beneficiosos del tractament amb enoxaparina en la reducció de la pressió portal, resistència vascular intrahepàtica i fibrosi hepàtica no es van associar a efectes deleteris en els animals. No es van observar diferencies en els enzims hepàtics, ni es va observar sagnats durant el tractament o durant l’estudi hemodinàmic. En el segon estudi es va avaluar l’efecte de l’anticoagulant oral, Rivaroxaban, en la cirrosi hepàtica. Com ja es va veure en el primer estudi, la teràpia anticoagulant pot ser una bona estratègia terapèutica per al tractament de la hipertensió portal en la cirrosi. Tot i això, les heparines de baix pes molecular són dependents dels nivells sanguinis d’antitrombina, que de fet poden estar disminuïts en els pacients cirròtics. Es per això que vam estudiar els efectes de Rivaroxaban, que és un inhibidor directe del factor Xa (tant el Factor Xa lliure com el que es troba unit al complex de protrombinasa) i és independent dels nivells d’antitrombina. A més a més, Rivaroxaban té l’avantatge de ser biodisponible via oral i té una acció ràpida. Tot això, fa de rivaroxaban un anticoagulant més previsible i potencialment més eficient comparat amb altres heparines. En aquest estudi hem confirmat els efectes beneficiosos de l’ús d’anticoagulants per a millora la hipertensió portal en la cirrosi. Hem demostrat que l’administració oral de rivaroxaban disminueix els nivells d’estrès oxidatiu, millora la biodisponibilitat de NO, desactiva les CHE i millora la hipertensió portal en dos models de cirrosi en rata. La disminució de la pressió portal observada en les rates tractades amb rivaroxaban no es va associar a canvis en el flux sanguini portal en cap dels dos models, suggerint que el principal efecte ve de la disminució en la resistència vascular intrahepàtica. De fet, es va observar una disminució de la resistència vascular intrahepàtica en fetges de rates tractades amb rivaroxaban quan es va avaluar en un sistema de perfusió ex vivo amb el flux controlat. L’estudi dels mecanismes de la millora en la funció microcirculatòria hepàtica van mostrar que rivaroxaban disminuïa els nivells d’estrès oxidatiu, probablement pel menor reclutament de cèl·lules inflamatòries. També augmentava els nivells de GMPc, millorava la resposta a dosis creixents d’acetilcolina i disminuïa l’expressió del marcador d’activació de CES, el factor von Willebrand. Tot això indicava que el tractament amb rivaroxaban té un efecte important en la millora de la disfunció endotelial en el fetge cirròtic. D’altra banda també es va estudiar l’efecte de rivaroxaban sobre les CHE. Es va observar que el tractament amb rivaroxaban disminuïa els marcadors d’activació i proliferació de les CHE que correlacionen amb la seva capacitat de síntesi de matriu extracel·lular. Aquest efecte no es va associar a canvis importants en el contingut de fibra en el fetge. Degut als canvis observats en els nivells d’activació de les CHE, es temptador especular que un tractament més llarg amb rivaroxaban s’associaria a una disminució en els nivells de fibrosi hepàtica. Això està recolzat pels efectes beneficiosos observats a sobre les alteracions del parènquima: estudis ultraestructurals realitzats mitjançant microscopia electrònica van confirmar que les rates tractades amb rivaroxaban tenien una menor formació de membrana basal en els sinusoides hepàtics i que els hepatòcits tenen més projeccions, suggerint una millor estructura del sinusoid hepàtic. Finalment, es va confirmar una disminució del contingut de fibrina en les rates tractades amb rivaroxaban, suggerint una disminució de la microtrombosi hepàtica. Els efectes beneficiosos deguts al tractament amb rivaroxaban no es van associar a efectes deleteris en l’hemodinàmica sistèmica ni en un augment de sagnats durant el tractament. El tercer estudi aporta nova informació, fins ara no coneguda, sobre el potencial dany de l’estès oxidatiu mitocondrial en les cèl·lules hepàtiques durant la cirrosi i sobre l’ús dels antioxidants dirigits a mitocondri com a estratègia terapèutica per a la hipertensió portal i la cirrosi. Tal i com s’ha explicat anteriorment, les CHE són les principals cèl·lules implicades en la síntesi de matriu extracel·lular que contribueix en l’augment de la resistència vascular intrahepàtica en la cirrosi. Tenint en compte que l’augment de l’estrès oxidatiu en la cirrosi és un dels principals mecanismes que activen les CHE i que els mitocondris són un dels principals productors d’espècies reactives d’oxigen, aquest estudi es va centrar en avaluar els efectes de l’antioxidant dirigit a mitocondri, mitoquinona en l’estrès oxidatiu, fenotip de les CHE, la fibrosi hepàtica i la hipertensió portal en models pre-clínics de cirrosi. Els resultats del present estudi mostren que el tractament amb mitoquinona disminueix l’estrès oxidatiu hepàtic, desactiva les CHE i disminueix la fibrosi hepàtica i la hipertensió portal en les rates cirròtiques. Estudis anteriors van demostrar el rol de l’estrès oxidatiu en la fisiopatologia de la cirrosi i la hipertensió portal. En el present estudi demostrem que el tractament amb mitoquinona va aconseguir disminuir els nivells d’estrès oxidatiu, com altres teràpies utilitzades com ara el tempol o el resveratrol, però amb la diferència que la mitoquinona té l’avantatge de ser administrada oralment. A més a més, les altres teràpies antioxidants no poden dirigir-se a l’interior del mitocondri i, per tant, no poden contrarestar l’estrès oxidatiu mitocondrial que pot resultar en dany i disfunció mitocondrial i endegar una cascada de conseqüències deletèries per a la cèl·lula com ara la inflamació o la mort cel·lular. El nostre estudi demostra que part de l’estrès oxidatiu observat en els fetges cirròtics prové del mitocondris dels hepatòcits i de les CHE. A més, demostrem que la mitoquinona es capaç de disminuir l’estrès oxidatiu mitocondrial en els principals tipus cel·lulars hepàtics. Aquest augment de l’estrès oxidatiu mitocondrial en la cirrosi pot ser causat, almenys en part, per la disminució en l’expressió i l’activitat de la isoforma mitocondrial de la superòxid dismutasa, que s’ha vist disminuïda en la cirrosi. És important destacar que el tractament amb mitoquinona és capaç de disminuir l’activació de les CHE de rata tant in vitro com in vivo. A més, la desactivació de les CHE es va confirmar tant en CHE aïllades de biòpsies humanes, en la línia cel·lular humana de CHE, LX2, i en el model ex vivo per a l’estudi de mostres de fetge humanes, els talls de precisió de fetges humans (hPCLS). Aquests efectes es van evidenciar quan es va veure que la proliferació de les CHE estava disminuïda però no la seva viabilitat. Per confirmar la capacitat terapèutica de la mitoquinona, es va avaluar els seus efectes en dos models de cirrosi. Les observacions in vivo van demostrar que el tractament amb mitoquinona disminuïa la pressió portal, sense canvis en el flux sanguini portal, suggerint una disminució en la resistència vascular intrahepàtica. A més, els animals tractats amb mitoquinona van tenir una disminució del contingut de fibra hepàtica en ambdós models. Suggerint que la disminució de la fibrosi hepàtica és el principal mecanisme amb el que la mitoquinona disminueix la pressió portal, ja que no es van trobar efectes importants de la mitoquinona sobre el to vascular hepàtic almenys durant el temps de tractament estudiat, i que altres antioxidants sí que han demostrat una millora de la disfunció endotelial. A més, es sap que els nivells de les espècies reactives d’oxigen estan directament lligades a la inflamació. Per això vam analitzar l’expressió dels marcadors CD68 i CD163 com a marcadors d’inflamació. En aquest estudi vam observar una disminució del nombre de cèl·lules positives per CD68, suggerint un efecte de la mitoquinona en la reducció de la inflamació hepàtica. Aquests resultats només es van observar en el model de CCl4 i no en el de TAA, suggerint que la reducció de la inflamació pot contribuir a la millora de la fibrosi hepàtica però no és el principal mecanisme. Les diferències observades entre els dos models de cirrosi, pot ser degut a les diferències intrínseques dels dos models. De fet, s’ha descrit que el model induït per CCl4 acumula més estrès oxidatiu que el model per TAA, fent així el model per CCl4 més susceptible per a una teràpia antioxidant que no el model de TAA. Tot i això, cal destacar que tots els beneficis observats pel tractament amb mitoquinona no es van associar a efectes deleteris en els animals cirròtics en cap dels dos models.The present doctoral thesis is focused in the development of new therapeutical strategies for the treatment of portal hypertension, one of the main complications of cirrhosis. Increase in portal pressure is directly related to the increased intrahepatic vascular resistance, mainly due to increased vascular tone and increased hepatic fibrosis. Therefore, the main objective of the present doctoral thesis was to study the use of the anticoagulants enoxaparin and rivaroxaban, and the mitochondrial-directed antioxidant mitoquinone and to evaluate their effects on intrahepatic vascular resistance and portal pressure in preclinical models of cirrhosis with portal hypertension. On the one hand, the results of the present doctoral thesis concluded that the anticoagulants, both the anti-thrombin like enoxaparin and the anti-factor Xa (thrombin-independent) rivaroxaban significantly improve portal pressure of animals with cirrhosis and portal hypertension mainly due to improved vascular tone and hepatic fibrosis. On the other hand, we observed that mitochondrial oxidative stress was increased in cirrhotic livers and hepatocytes and hepatic stellate cells were the main cells producing mitochondrial oxidative stress. Furthermore, we confirmed the beneficial effects of antioxidants on cirrhosis. The results concluded that the mitochondrial-directed antioxidant mitoquinone decreased significantly portal pressure and intrahepatic vascular resistance. Moreover, an important deactivation of the main cells producing collagen was observed both in rat and in human cells. These results suggest that anticoagulant and antioxidant treatment may be a potential therapeutical strategy for the treatment of portal hypertension in cirrhotic patients.Esta tesis estudia el efecto de diferentes estrategias terapéuticas para el tratamiento de la hipertensión portal en models preclínicos de cirrosis. Se han estudiado los efectos de dos anticoagulantes (enoxaparina y rivaroxaban) y el efecto de un antioxidante dirigido a mitocondria (mitoquinona). En el primer estudio, se evaluó el efecto del anticoagulante enoxaparina en modelos preclínicos de cirrosis. Se observó que el tratamiento agudo con enoxaparina no afectó los parámetros sistémicos ni hemodinámicos evaluados. Tampoco modificó los niveles de GMPc o el contenido de estrés oxidativo hepático. El tratamiento a corto plazo (1 semana) disminuyó de manera significativa la presión portal en ratas cirróticas sin modificar el flujo. También disminuyó de manera significativa los niveles de estrés oxidativo y aumentó la biodisponibilidad de óxido nítrico (NO). Además, el tratamiento disminuyó un 26% la fibra hepática. Estos cambios se asociaron a una mejora del fenotipo de las células estrelladas hepáticas (CEH). También se observó una mejor en la microtrombosis hepática. El tratamiento a largo plazo (3 semanas) también disminuyó de manera significativa la presión portal en los dos modelos de cirrosis preclínica, sin cambios en los otros parámetros hemodinámicos. En este caso, también se observó una disminución del estrés oxidativo, pero sin mejora en la biodisponibilidad de NO. El tratamiento con enoxaparina redujo un 35% el área de fibrosis, cambios también asociados a una mejora del fenotipo de las CHE. También disminuyó el contenido de fibrina, mejorando así la microtrombosis hepática. Finalmente, también se observaron efectos beneficiosos en el modelo de prevención en ratas cirróticas por tioacetamida. La presión portal fue menor, en las ratas tratadas con enoxaparina, aunque los cambios no fueron tan marcados como en el modelo de regresión. También se redujo el área de fibrosis hepática, se mejoró el fenotipo de las CHE y hubo una menor microtrombosis hepática. En el segundo estudio, el anticoagulante oral anti factor Xa Rivaroxaban, disminuyó significativamente la presión portal en los dos modelos de cirrosis preclínica. La disminución de la presión portal no se asoció a cambios ni en el flujo sanguíneo portal ni en la presión arterial media, sugiriendo una disminución en la resistencia vascular intrahepática. Este hecho se confirmó ex vivo, donde se observó una disminución significativa de la resistencia vascular intrahepática del 35% en un sistema de perfusión con el flujo controlado. El tratamiento durante dos semanas disminuyó los niveles de estrés oxidativo, el número de células de Kupffer y aumentó la biodisponibilidad del NO. Las ratas tratadas con rivaroxaban tuvieron una mejor respuesta, aunque no significativa, al vasodilatador acetilcolina. Para confirmar el efecto beneficioso de rivaroxaban sobre el endotelio sinusoidal hepático, se evaluó el fenotipo de las células endoteliales sinusoidales y se observó una disminución en el marcador de activación, el factor von Willebrand, y una menor presencia de membrana basal. El tratamiento con rivaroxaban disminuyó el número y la activación de las CHE tanto a nivel de tejido como a nivel de célula aislada. No se observaron cambios en la apoptosis sugiriendo que el menor número de CHE vendría de una menor proliferación y no de un aumento en la muerte celular. Finalmente se observó que el tratamiento disminuía el contenido de fibrina sugiriendo una disminución de la microtrombosis hepática y se confirmó que los efectos de rivaroxaban sobre las CHE no era directos sino a través de la inhibición de la cascada de coagulación e inhibiendo la activación de los receptores PAR. En el tercer y último estudio se evaluó el efecto del tratamiento con un antioxidante dirigido a mitocondria. En un inicio se confirmó que en la cirrosis existe un aumento significativo de estrés oxidativo mitocondrial y que las principales células productores de éste estrés eran las CHE y los hepatocitos. El tratamiento con mitoquinona in vitro disminuyó significativamente el nivel de estrés oxidativo en todas las estirpes celulares hepáticas estudiadas. Además, disminuyó el nivel de activación de las CHE tanto de rata como humanas. Esto se confirmó en cortes ultrafinos de biopsias humanas y en líneas celulares. A nivel in vivo se observó que mitoquinona produjo un descenso significativo del nivel de estrés oxidativo hepático, tanto a nivel mitocondrial como total. A demás se disminuyó el contenido de proteínas nitrotirosinadas y la expresión génica de un factor inducido por el estrés oxidativo, Hif1a. Las ratas tratadas con mitoquinona tuvieron una disminución significativa de la presión portal y no se asoció a cambios ni en el flujo sanguíneo portal ni en la presión arterial media, sugiriendo una disminución en la resistencia vascular intrahepática. Mitoquinona también disminuyó el grado de fibrosis hepática y el nivel de activación de las CHE. Finalmente, se observó que el tratamiento con mitoquinona disminuyó significativamente el nivel de inflamación hepática. Para finalizar, esta tesis doctoral concluye que tanto el tratamiento con anticoagulantes, como el tratamiento con antioxidantes dirigidos a mitocondria pueden ser una potencial vía de tratamiento para la hipertensión portal en pacientes cirróticos

Definició de les estratègies de desenvolupament rural integrat i sostenible per a la comarca del Solsonès : 2007-2013

L'objectiu del present projecte és establir i recomanar un seguit d'estratègies de desenvolupament rural integrat i sostenible per a la comarca del Solsonès. Per damunt de tot pretén ser una eina útil, fent coincidir les propostes amb l'àmbit temporal del nou PDR (2007-2013) i presentant el projecte a diferents institucions. Amb aquest objectiu s'han estudiat els aspectes socioeconòmics més rellevants dels diferents municipis, així com altres factors clau com els recursos naturals , els elements dinamitzadors del territori i el context global de l'agricultura i polítiques sectorials europees. A partir de l'avaluació estratègica, i el posterior debat en grups de discussió, es conclou que el Solsonès és una comarca amb la població envellida, especialment a les zones rurals, on els ocupats agraris cada dia són menys. Amb tot, es configura un escenari on el despoblament rural és constant, amb les conseqüències socioembientals implícites a aquest fenomen. Posteriorment a l'avaluació es discuteix l'estratègia global de desenvolupament rural, i, en base a aquesta, es proposen diferents línies estratègiques agrupades en tres grans eixos: la vertebració social, la vertebració territorial i el manteniment, millora i coneixement del paisatge cultural

Gastrin treatment stimulates beta cell regeneration and improves glucose tolerance in 95% pancreatectomized rats

β-Cell mass reduction is a central aspect in the development of type 1 and type 2 diabetes, and substitution or regeneration of the lost β-cells is a potentially curative treatment of diabetes. To study the effects of gastrin on β-cell mass in rats with 95% pancreatectomy (95%-Px), a model of pancreatic regeneration, rats underwent 95% Px or sham Px and were treated with [15 leu] gastrin-17 (Px+G and S+G) or vehicle (Px+V and S+V) for 15 d. In 95% Px rats, gastrin treatment reduced hyperglycemia (280 ± 52 mg vs. 436 ± 51 mg/dl, P < 0.05), and increased β-cell mass (1.15 ± 0.15 mg)) compared with vehicle-treated rats (0.67 ± 0.15 mg, P < 0.05). Gastrin treatment induced β-cell regeneration by enhancing β-cell neogenesis (increased number of extraislet β-cells in Px+G: 0.42 ± 0.05 cells/mm(2) vs. Px+V: 0.27 ± 0.07 cells/mm(2), P < 0.05, and pancreatic and duodenal homeobox 1 expression in ductal cells of Px+G: 1.21 ± 0.38% vs. Px+V: 0.23 ± 0.10%, P < 0.05) and replication (Px+G: 1.65 ± 0.26% vs. S+V: 0.64 ± 0.14%; P < 0.05). In addition, reduced β-cell apoptosis contributed to the increased β-cell mass in gastrin-treated rats (Px+G: 0.07 ± 0.02%, Px+V: 0.23 ± 0.05%; P < 0.05). Gastrin action on β-cell regeneration and survival increased β-cell mass and improved glucose tolerance in 95% Px rats, supporting a potential role of gastrin in the treatment of diabetes

Characterization of p38α signaling networks in cancer cells using quantitative proteomics and phosphoproteomics

p38α (encoded by MAPK14) is a protein kinase that regulates cellular responses to almost all types of environmental and intracellular stresses. Upon activation, p38α phosphorylates many substrates both in the cytoplasm and nucleus, allowing this pathway to regulate a wide variety of cellular processes. While the role of p38α in the stress response has been widely investigated, its implication in cell homeostasis is less understood. To investigate the signaling networks regulated by p38α in proliferating cancer cells, we performed quantitative proteomic and phosphoproteomic analyses in breast cancer cells in which this pathway had been either genetically targeted or chemically inhibited. Our study identified with high confidence 35 proteins and 82 phosphoproteins (114 phosphosites) that are modulated by p38α, and highlighted the implication of various protein kinases, including MK2 and mTOR, in the p38α-regulated signaling networks. Moreover, functional analyses revealed an important contribution of p38α to the regulation of cell adhesion, DNA replication and RNA metabolism. Indeed, we provide experimental evidence supporting that p38α facilitates cancer cell adhesion, and showed that this p38α function is likely mediated by the modulation of the adaptor protein ArgBP2. Collectively, our results illustrate the complexity of the p38α regulated signaling networks, provide valuable information on p38α-dependent phosphorylation events in cancer cells, and document a mechanism by which p38α can regulate cell adhesion.Copyright © 2023 The Authors. Published by Elsevier Inc. All rights reserved

Direct evidence of the presence of cross-linked Aβ dimers in the brains of Alzheimer's disease patients

Brain-derived amyloid-β (Aβ) dimers are associated with Alzheimer´s disease (AD). However, their covalent nature remains controversial. This feature is relevant, as a covalent cross-link would make brain-derived dimers (brain dimers) more synaptotoxic than Aβ monomers and would make them suitable candidates for biomarker development. To resolve this controversy, we here present a three-step approach. First, we validated a type of synthetic cross-linked Aβ (CL Aβ) dimers, obtained by means of the photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) reaction, as well-defined mimics of putative brain CL Aβ dimers. Second, we used these PICUP CL Aβ dimers as standards to improve the isolation of brain Aβ dimers and to develop state-of-the-art mass spectrometry (MS) strategies to allow their characterization. Third, we applied these MS methods to the analysis of brain Aβ dimer samples allowing the detection of the CL [Aβ(6-16)]2 peptide comprising a dityrosine cross-link. This result demonstrates the presence of CL Aβ dimers in the brains of patients with AD and opens up avenues for establishing new therapeutic targets and developing novel biomarkers for this disease

Structure of the Homodimeric androgen receptor ligand-binding domain

The androgen receptor (AR) plays a crucial role in normal physiology, development and metabolism as well as in the aetiology and treatment of diverse pathologies such as androgen insensitivity syndromes (AIS), male infertility and prostate cancer (PCa). Here we show that dimerization of AR ligand-binding domain (LBD) is induced by receptor agonists but not by antagonists. The 2.15-Å crystal structure of homodimeric, agonist- and coactivator peptide-bound AR-LBD unveils a 1,000-Å2 large dimerization surface, which harbours over 40 previously unexplained AIS- and PCa-associated point mutations. An AIS mutation in the self-association interface (P767A) disrupts dimer formation in vivo, and has a detrimental effect on the transactivating properties of full-length AR, despite retained hormone-binding capacity. The conservation of essential residues suggests that the unveiled dimerization mechanism might be shared by other nuclear receptors. Our work defines AR-LBD homodimerization as an essential step in the proper functioning of this important transcription factor

Multi-phosphorylation of the intrinsically disordered unique domain of c-Src studied by in-cell and real-time NMR

Intrinsically disordered regions (IDRs) are preferred sites for post-translational modifications essential for regulating protein function. The enhanced local mobility of IDRs facilitates their observation by NMR spectroscopy in vivo. Phosphorylation events can occur at multiple sites and respond dynamically to changes in kinase-phosphatase networks. Here we used real-time NMR spectroscopy to study the effect of kinases and phosphatases present in Xenopus oocytes and egg extracts on the phosphorylation state of the 'unique domain' of c-Src. We followed the phosphorylation of S17 in oocytes, and of S17, S69, and S75 in egg extracts by NMR spectroscopy, MS, and western blotting. Addition of specific kinase inhibitors showed that S75 and S69 are phosphorylated by CDKs (cyclin-dependent kinases) differently from Cdk1. Moreover, although PKA (cAMP-dependent protein kinase) can phosphorylate S17 in vitro, this was not the major S17 kinase in egg extracts. Changes in PKA activity affected the phosphorylation levels of CDK-dependent sites, thus suggesting indirect effects of kinase-phosphatase networks. This study provides a proof-of-concept of the use of real-time in vivo NMR spectroscopy to characterize kinase/phosphatase effects on intrinsically disordered regulatory domains

Succinate Pathway in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma: Potential as a Diagnostic and Prognostic Marker

Simple Summary: Emerging evidence points to succinate as an important oncometabolite in cancer development; however, the contribution of the succinate-SUCNR1 axis to cancer progression remains unclear. Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is associated with disease and treatmentrelated morbidity so there is an urgent need for innovation in treatment and diagnosis practices. Our aim was to evaluate the potential of the succinate-related pathway as a diagnostic and prognostic biomarker in HNSCC. The circulating succinate levels are increased in HNSCC, being a potential noninvasive biomarker for HNSCC diagnosis. Moreover, the succinate receptor (SUCNR1) and genes related to succinate metabolism, which are predominantly expressed in the tumoral mucosa as compared with healthy tissue, are positively associated with plasma succinate. Remarkably, we found that SUCNR1 and SDHA expression levels predict prognosis

Biomarker candidates for progression and clinical management of COVID-19 associated pneumonia at time of admission

COVID-19 pathophysiology is currently not fully understood, reliable prognostic factors remain elusive, and few specific therapeutic strategies have been proposed. In this scenario, availability of biomarkers is a priority. MS-based Proteomics techniques were used to profile the proteome of 81 plasma samples extracted in four consecutive days from 23 hospitalized COVID-19 associated pneumonia patients. Samples from 10 subjects that reached a critical condition during their hospital stay and 10 matched non-severe controls were drawn before the administration of any COVID-19 specific treatment and used to identify potential biomarkers of COVID-19 prognosis. Additionally, we compared the proteome of five patients before and after glucocorticoids and tocilizumab treatment, to assess the changes induced by the therapy on our selected candidates. Forty-two proteins were differentially expressed between patients' evolution groups at 10% FDR. Twelve proteins showed lower levels in critical patients (fold-changes 1.20-3.58), of which OAS3 and COG5 found their expression increased after COVID-19 specific therapy. Most of the 30 proteins over-expressed in critical patients (fold-changes 1.17-4.43) were linked to inflammation, coagulation, lipids metabolism, complement or immunoglobulins, and a third of them decreased their expression after treatment. We propose a set of candidate proteins for biomarkers of COVID-19 prognosis at the time of hospital admission. The study design employed is distinctive from previous works and aimed to optimize the chances of the candidates to be validated in confirmatory studies and, eventually, to play a useful role in the clinical practice