708. Process Development of Lentiviral Vectors for Large Scale Production Using a HEK293 Producer Cell Line

Lentiviral vectors (LVs) are promising vectors for gene therapy. Most often, they are used to deliver a functional copy of a gene to sustainably replace a defective or missing gene. However, processes for LVs must be improved to increase the yield, facilitate the scale up and satisfy Health regulatory agencies. For these reasons, we have developed and optimized a LVs production process in serum-free medium using an inducible HEK293 producer cell line which possesses the capacity to grow in suspension culture. By adding two inducing molecules, (cumate and doxycycline) this cell line produces LVs pseudotyped with the protein G of the vesicular stomatitis virus without the need of any transfection. Our tested LV carried an expression cassette for GFP to facilitate LV quantification. To optimize the process, a design of experiment (DoE) was prepared which included the study of different culture media, high cell density production using six cell boosts commercially available and the addition of sodium butyrate, caffeine and valproic acid. We found that two cell boosts were outperforming the other cell boosts tested. At the present time, two commercial media (Hycell TransFx-H and SFM4TransFx-293 media) were our best candidates to maximize viral titer by achieving high cell density culture. In parallel, a LV carrying the cDNA for a shorter version of dystrophin (mini-dystrophin) was constructed. The truncated version of the dystrophin was produced by transient transfection in 293A cells and its presence was confirmed by western blot. We are planning to evaluate if the optimal conditions for the production of LV-GFP will be also applicable to LV-mini-dystrophin, a LV encoding a much longer transgene than GFP (0.7 kb vs 5.8 kb). This LV could be first evaluated for cell therapy in animal models and later, in patients suffering from Duchenne muscular dystrophy, where the dystrophin gene is defective and the protein is absent

Vers une consolidation de l’encadrement des professionnels et de la protection du public au Québec

On a pu craindre durant quelques années que la mondialisation allait ébranler l’édifice normatif québécois, en particulier les institutions de son système professionnel chargées de la protection du public. Cependant, l’adoption en 2002 du projet de loi 90, qui prévoit des actes réservés à certaines professions, pour des activités préjudiciables à la santé physique, et le débat actuel sur le projet de loi 50, qui propose une semblable réserve dans le domaine de la santé mentale et des relations humaines, montrent que, loin de s’affaiblir, le souci de protéger le public, de maintenir les institutions chargées de la discipline en matière de déontologie, de former les professionnels, de traiter et de prévenir les plaintes, s’est au contraire renforcé. Dans un contexte marqué par de nombreux cas de scandales financiers ou de malgouvernance, on aura sans doute compris, chez les élus et dans le public, que la confiance ne peut être maintenue hors d’un cadre garantissant une saine articulation des ordres sociaux. Cette analyse se veut une contribution au développement de la conscience collective à cet égard. On constatera que le législateur a commencé à resserrer les balises de gouvernance de l’État-employeur, en clarifiant les nomenclatures d’emploi, et en supprimant des zones de confusion affectant l’encadrement des salariés professionnels du secteur public

Le triple statut des professionnels salariés et son impact sur l’encadrement des praticiens réflexifs

Les travailleurs sociaux salariés sont soumis à des normes et des obligations diverses, voire contradictoires : code de déontologie professionnelle, obligations à l’égard de l’employeur, obligations comme citoyen. Salaried social workers are subject to various standards and obligations, which are sometimes contradictory : code of ethics, obligations to the employer, obligations as a citizen

L'Office du film du Québec : vitrine de l'État dans la Cité : la communication des services de l'administration publique québécoise par le cinéma, 1961-1976

Entre 1961 et 1976, l’Office du film du Québec (OFQ) est l’organisme d’État responsable de la production, de l’achat et de la distribution des moyens cinématographiques de l’ensemble des ministères et services de l’administration publique québécoise. Nouvelle incarnation du Service de Ciné-photographie fondé en 1940, l’OFQ s’inscrit alors en continuité et en rupture avec les premières initiatives en la matière, lesquelles remontent aussi loin que les années 1920. Ces films, des courts-métrages à mi-chemin entre le documentaire et le film pédagogique, servent à la communication des activités et services de l’État envers ses citoyens, et à préserver une trace visuelle des actualités gouvernementales du Québec. La présente thèse vise à analyser les contextes politique et administratif ayant motivé le développement d’une telle stratégie de communication des services de l’administration publique québécoise de façon à comprendre comment et à quelles fins furent gérés et administrés ces activités cinématographiques. Elle révèle l’importance et la nécessité du rôle occupé par l’Office du film du Québec en pleine Révolution tranquille, rôle soutenu et défendu par des fonctionnaires, et bien souvent en dépit d’un soutien politique : celui d’agent de liaison entre l’appareil administratif de l’État québécois et la société civile.Between 1961 and 1976, the Quebec Film Board (OFQ) was the government agency responsible for the production, purchase and distribution of cinematographic resources for all departments and services of the Québec administration. A new incarnation of the Cine-Photography Service founded in 1940, the OFQ is then in continuity and in rupture with the first initiatives in the field, which go back as far as the 1920s. These films, short films halfway between the documentary and the educational film, are used for communication of the activities and services of the state towards its citizens, and to preserve a visual trace of the governmental news of Quebec. The purpose of this thesis is to analyze the political and administrative contexts that motivated the development of such a communication strategy for Québec government services in order to understand how and for what purposes these cinematographic activities were managed and administered. It reveals the importance and necessity of the role played by the Quebec Film Board in the midst of the Quiet Revolution, arole supported and defended by public servants, and often in spite of political support: that of a liaison officer between the administrative apparatus of the Quebec State and the entire civil society

Optimisation du vecteur adénoviral pour la thérapie génique de la dystrophie musculaire de Duchenne

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie très sévère, progressive et sans traitement vraiment efficace. Elle est caractérisée par l’absence fonctionnelle de la dystrophine, une protéine essentielle au maintien des muscles squelettiques. La thérapie génique est actuellement envisagée comme approche thérapeutique pour livrer la dystrophine dans les muscles. Les vecteurs adénoviraux de troisième génération (Helper-dependent adenoviral vector, HD) sont des véhicules de transfert génique très prometteurs pour traiter la DMD. Puisque les gènes adénoviraux ont été enlevés complètement du HD, ils sont peu toxiques, faiblement immunogéniques et ils possèdent un espace cargo suffisant pour transporter l’ADN codant complet de la dystrophine. Bien que le HD puisse fournir la dystrophine de façon thérapeutique chez des souris dystrophiques (mdx), l’expression du gène thérapeutique est progressivement perdue plusieurs mois suivant l’injection intramusculaire. Deux stratégies innovantes furent explorées dans cette thèse dans le but de stabiliser l’expression de la dystrophine. La première stratégie vise à l’intégration de l’ADN du HD dans les chromosomes cellulaires, ce qui pourrait le protéger contre son élimination progressive des muscles. Une intégrase site-spécifique issue du phage ΦC31 a été utilisée pour catalyser l’intégration d’un HD transportant un marqueur de sélection. Dans les cellules humaines et les myoblastes murins, l’activité de l’intégrase a été évaluée d’après son efficacité d’intégration (après sélection) et sa spécificité (dans les clones résistants). L’efficacité atteint jusqu’à 0,5 % par cellule et jusqu’à 76 % des événements d’intégration ont été réalisés de façon site-spécifique. Bien que des délétions aient été trouvées aux extrémités du vecteur, 70 % des clones analysés montraient une seule copie du vecteur intégré (le nombre attendu). Seulement une petite augmentation du nombre de brisures double-brin a été mesurée dans les myoblastes exprimant l’intégrase. En conclusion, l’intégration du HD est relativement efficace, spécifique et sécuritaire. Cette méthode est très prometteuse, car la dystrophine peut être livrée dans le muscle avec l’aide du HD et l’intégration de l’ADN du HD pourrait stabiliser son expression in vivo. La deuxième stratégie implique l’utilisation d’un nouveau promoteur musculospécifique (ΔUSEx3) pour réduire la toxicité induite liée à une expression trop étendue de la dystrophine. Dans cette étude, nous avons investigué l’effet du contexte viral sur l’activité du promoteur. Un HD et un vecteur lentiviral (LV) ont été construits avec le promoteur ΔUSEx3 pour contrôler l’expression d’un gène rapporteur. Les résultats démontrent que ΔUSEx3 confère une expression puissante, musculospécifique et stable (via le LV) in vitro. L’injection intramusculaire du HD a conduit à une expression puissante du transgène. Ces résultats contrastent avec ceux du LV, car après l’injection de ce dernier, l’expression était faible. La livraison du HD dans le muscle, mais aussi dans plusieurs organes démontre la musculospécificité de ΔUSEx3. Par conséquent, le contexte du vecteur et l’environnement musculaire modulent tous les deux l’activité de ΔUSEx3. Bien que ΔUSEx3 soit musculospécifique, d’autres études sont requises pour déterminer si le promoteur peut stabiliser l’expression de la dystrophine in vivo.Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe, progressive and orphan disease that is characterized by the absence of the functional muscle protein dystrophin. Gene therapy is currently investigated as a therapeutic approach to deliver dystrophin into muscles. Helper-dependent adenoviral vectors (HD) are promising gene transfer vehicles for gene therapy of DMD. Because HD are devoid of all adenoviral genes, they are weakly toxic, poorly immunogenic and possess sufficient cargo capacity to carry the full-length dystrophin cDNA. Although HD can provide dystrophin therapeutically in dystrophic mice, gene expression decays months after intramuscular injection. Two strategies that both aimed to stabilize dystrophin expression were explored here. The first strategy involved the integration of HD DNA into cellular chromosomes. Stabilizing HD DNA could prevent its elimination from muscles. A site-specific integrase from phage ΦC31 was used to integrate an HD carrying a selection marker in human cells and murine myoblasts. Efficacy of integration (obtained after selection) reached up to 0.5% per cell, and up to 76% of integration events (in clones) were mediated site-specifically. Although some deletions in HD extremities occurred, 70% of clones analyzed showed one integrated copy of HD (as expected). Only a small increase in the number of double-strand breaks was found in myoblasts expressing the integrase. In conclusion, HD integration was relatively efficient, specific and safe. This method could be used to stabilize dystrophin expression in vivo. The second strategy involved using a muscle-specific promoter (ΔUSEx3) to reduce potential toxicity induced by widespread expression of dystrophin. Because ΔUSEx3 would be delivered by HD, we investigated whether or not the viral context could affect ΔUSEx3 activity. We constructed an HD and a lentiviral vector (LV) carrying a reporter gene under its control. Strong, muscle-specific and stable (with LV) expression was obtained in vitro. Intramuscular injection of HD resulted into a powerful transgene expression contrasting with LV, where expression was relatively weak. Delivery of ΔUSEx3 in multiple tissues by HD demonstrated its muscle-specificity. Therefore, both the viral context and the muscular environments modulate ΔUSEx3 activity. Further studies are required to determine whether or not ΔUSEx3 can stabilize dystrophin expression in vivo

Une société pragmatique le Québec agricole et rural de l'après-guerre dans le cinéma documentaire de l'abbé Maurice Proulx, 1946-1959

La société agricole et rurale québécoise de l'après-guerre a longtemps été mise de côté par les historien(ne)s et chercheur(e)s en sciences humaines et sociales. Victime de préjugés, subissant les contrecoups d'une historiographie modernisante qui émerge à partir des années 1960 et qui compte faire table rase d'un certain passé « noirci », qualifiée souvent de traditionnaliste et de conservatrice, puis de normale, voire moderne, cette société n'est pourtant pas si dichotomique. Elle évolue, ni plus ni moins, dans un monde qui se transforme et qui laisse présager les grands bouleversements de la Révolution tranquille.La décrire en l'associant à l'un ou l'autre des antagonistes du couple tradition/modernité ne permet pas d'en saisir toute la complexité. Au surplus, dire qu'elle incarne à la fois les vestiges de la tradition et les élans de la modernité revient à ne rien dire du tout. C'est pourtant ce que l'historiographie des vingt dernières années nous apprend. Le modèle tradition/modernité ne convient plus à l'analyse de la société agricole et rurale québécoise de l'après-guerre. C'est ce que l'étude du cinéma documentaire de l'abbé Maurice Proulx (1902-1988) nous porte à croire. Les représentations du monde rural extraites de son oeuvre parue entre 1946 et 1959 témoignent plutôt de la pertinence du paradigme pragmatisme/idéalisme comme cadre conceptuel. Nos recherches sur les films de Maurice Proulx montrent une société rurale québécoise d'après-guerre fondamentalement pragmatique. Tant sur les plans social que culturel, cette société, bien ancrée sur le réel, comprend la nécessité de s'adapter aux transformations économiques qui viennent ébranler son monde tout au long de la période. Et dans les faits, elle s'adapte. L'heure n'est pas aux réflexions idéologiques, ni aux grandes remises en question. L'heure est à l'actualisation; l'heure est à l'action. Le cinéma de l'abbé Maurice Proulx, prêtre-agronome pionnier du film documentaire québécois, permet une telle lecture de l'après-guerre rural au Québec. L'oeuvre cinématographique de Proulx, patrimoine culturel national depuis 1977, est une des seules fenêtres visuelles et sonores donnant sur cette époque. Méconnue, mais surtout peu étudiée, elle constitue un témoignage unique sur la société rurale qui traverse alors une période de profonds bouleversements

301. Efficient Delivery of Nuclear and Cytoplasmic Proteins Fused to HIV-1 Gag Polypeptide By Means of Virus-Like Particles

The expression of the retroviral polypeptide Gag can induce the formation of virus-like particles (VLP). Upon expression, the polypeptide is targeted to the cell membrane and incorporated in the VLP during membrane budding. Chimeric proteins consisting of Gag polypeptide fused to different proteins were engineered and the VLP produced were used as vehicles for protein delivery. One major advantage of this approach is the low mutation risk due to the absence of DNA transfer and genomic integration. In this study, the C-Terminus of Gag from HIV-1 was fused to the green fluorescent protein (GFP), a chimeric transactivator (cTA) and a reprogamming factor (KLF4). VLP were produced by transfection using a stable cell line (293SF-pacLV) that expresses VSVg and Gag-pol. Analysis of the supernatants from producing cells by western blot confirmed the presence of Gag-GFP, -cTA and -KLF4. Confocal microscopy showed that the vast majority of the cells (> 90%) treated with VLP-GFP/polybrene complexes was successfully transduced. The cells also displayed a GFP signal almost exclusively localized inside the cytoplasm. Additional VSVg expression during the production facilitated the endosomal escape of VLP-GFP in transduced cells. The insertion of a nuclear localisation signal (NLS) shifted the localization of the GFP to the cell nucleus demonstrating that a nuclear protein could be successfully delivered by VLP. The experiment was thus repeated using two transcription factors. Lentiviral vectors were used to make two stable pools of HEK293 cells each containing a specific GFP reporter cassette. The GFP gene was regulated either by the CR5 promoter (specifically activated by the cTA) or by a minimal promoter fused to KLF4 transcription response elements (TRE). Transduction of the CR5-GFP pool with VLP-cTA/polybrene complexes showed a powerful activation of the reporter (365-fold compared to the negative control) as measured by flow cell cytometry two days post-transduction. Surprisingly, no activation was observed in the TRE-GFP pool three days after transduction by VLP-KLF4/polybrene complexes. Evidence obtained by transfection suggested that the Gag fusion inhibits KLF4 activity. To augment activity, the activation domain of VP16 was fused to KLF4. Transfection of a plasmid encoding Gag-VP16KLF4 strongly activated the reporter by a factor of 126-fold (6-fold higher than wild type KLF4). The ability of VLP produced with Gag-VP16KLF4 to activate transcription is currently under investigation. In summary, VLP based on HIV-1 Gag can deliver nuclear and cytoplasmic proteins directly into cells with a low mutation risk. Therefore, our platform for VLP production could be useful for several applications including cell reprogramming and genome editing oriented toward cell therapies of diseases like Duchenne muscular dystrophy

Epitaxial ternary RexMo1-xSi2 thin films on Si(100)

Includes bibliographical references (page 3927).Reactive deposition epitaxy was used to synthesize thin layers of RexMo1-xSi2 on Si(100). In the case of x>=1, ReSi2 layers of excellent crystalline quality have been reported previously [J.E. Mahan, K. M. Geib, G. Y. Robinson, R. G. Long, Y. Xinghua, G. Bai, and M.-A. Nicolet, Appl. Phys. Lett. 56, 2439 (1990)]. In the case of x=0, however, virtually no alignment of theMoSi2 and the substrate is found, although this silicide is nearly isomorphic to ReSi2. For intermediate values of x, highly epitaxial ternary silicides are obtained, at least for a Mo fraction up to 1/3