Mouse model for Charcot Marie-Tooth as a tool to better understand the disease

Introducción La enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT) es uno de los trastornos neurológicos hereditarios más comunes que afecta a 17-40 de cada 100.000 personas según poblaciones; concretamente esta cifra se sitúa en 28 personas de cada 100.000 en España. La enfermedad recibe el nombre de los tres médicos que la identificaron por primera vez en 1886; Jean-Marie Charcot y Pierre Marie en París, Francia y Howard Henry Tooth en Cambridge, Inglaterra. La enfermedad de CMT, también conocida como neuropatía hereditaria motora y sensitiva o atrofia muscular del peroneo, abarca un grupo de trastornos que afectan los nervios periféricos. El fenotipo clásico incluye problemas en la marcha, déficit sensorial distal y atrofia distal inferior dando un aspecto de "jambes de coq" o botella de champagne invertida. Otras características completan el deterioro de patrón distal típico de CMT. Por ejemplo, disminución o ausencia de reflejos y equilibrio debido a la pérdida propioceptiva y deformidades esqueléticas como "pes cavus" y dedos en martillo. La escoliosis moderada puede formar parte de este fenotipo clínico. La severidad de la neuropatía puede evaluarse por un marcador de la neuropatía de CMT, un examen clínico de nueve ítems que mide síntomas sensoriales, síntomas motores, velocidades de conducción nerviosa y fuerza en brazos y piernas. De hecho, clínicamente, la examinación electrofisiológica es el primer paso importante de la división de CMT en subtipos. Los estudios de conducción nerviosa permiten una clasificación preliminar en formas desmielinizantes, axonales o intermedias. En la mayoría de los casos, la velocidad de conducción de los nervios motores (MNCV) y las amplitudes del potencial de acción compuesto del músculo (CMAP) en las extremidades superiores son necesarias ya que los nervios de la extremidades inferiores a menudo muestran ausencia de respuesta. Se diagnostica CMT1 o desmielinizante si esta velocidad de conducción motora es menor de 38 m/s. Si esta velocidad motora es normal (mayor de 45 m/s), se observa disminución de la amplitud de CMAP y disminución del potencial de acción del nervio sensitivo (SNAP), se diagnostica CMT2 o axonal. CMT Intermedia (CMTI) se diagnostica si MNCV entra en el rango de 25 – 45 m/s. Otra clasificación, según el tipo de herencia, también es posible. La variante de disfunción de la mielina -CMT1- y la variante axonal -CMT2- presentan herencia autosómico dominante (AD), mientras que CMTX es un desorden ligado al cromosoma X. En cambio, variantes con herencia autosómica recesiva (AR CMT) se clasifican como CMT4 si tienen características desmielinizantes y CMT2B o CMT2 AR si tienen resultados axonales (Tazir et al. 2014). Hasta la fecha, 80 genes causantes de CMT han sido identificados (Timmerman et al. 2014). Algunos de ellos son causantes de diversos subtipos de CMT. Ya en el año 2002 dos grupos asociaron un mismo gen -GDAP1 (MIM# 606598)- a dos subtipos de CMT, desmielinizante autosómica recesiva (Baxter et al. 2002) y axonal autosómica recesiva (Cuesta et al. 2002). En la actualidad se sabe que GDAP1 (Ganglioside-induced Differentiation Associated Protein 1) causa tanto CMT4A (MIM# 214400) desmielinizante autosómica recesiva, AR-CMT2K (MIM# 607706) axonal autosómica recesiva, CMT2K (MIM# 607831) axonal autosómica dominante, como CMTRIA (MIM# 608340) intermedia autosómica recesiva (www.omim.org). Es importante remarcar que en el área Mediterránea gran parte de los casos de CMT son debidos a mutaciones en GDAP1 (Sivera et al. 2013).   GDAP1 se había identificado con anterioridad como uno de los 10 cDNAs expresados en una línea celular de neuroblastoma ratón diferenciada (Neuro2), en la que la diferenciación colinérgica había sido inducida por transfección de GD3 sintasa (a2,8-sialiltransferasa). Este gen, con una longitud de 23,728 pares de bases (pb), contiene seis exones y cinco intrones. Dos variantes transcripcionales han sido descritas, siendo la isoforma "a" la más larga, con 358 aminoácidos. La isoforma "b" es exactamente igual que la "a" pero tiene 68 aminoácidos menos en la parte N-terminal, resultando en una proteína de 290 aminoácidos (Cassereau et al. 2011). GDAP1 pertenece a la familia de enzimas glutatión S-transferasas, presentando dos dominios de unión para GSH (de los aminoácidos 26 al 119 y del 210 al 287). La proteína presenta también dos hélices -α4 y α5- (entre los aminoácidos 152-164 y 169-195), un único dominio transmembrana (TMD) en el extremo de la C-terminal y un dominio hidrófobo (HD) (Marco et al. 2004). A la misma familia pertenece su gen parálogo, GDAP1L1 (Marco et al. 2004), del que poco se ha estudiado. Estudios de expresión han detectado su mensajero predominantemente en sistema nervioso (Cuesta et al. 2002; Pedrola et al. 2005). La proteína ha sido detectada tanto en neuronas sensitivas y motoneuronas (Pedrola et al. 2008), como en células de Schwann (Pedrola et al. 2005; Niemann et al. 2005). A nivel celular, se localiza en la membrana mitocondrial externa (Pedrola et al. 2005; Niemann et al. 2005). La función de GDAP1 ha sido profundamente estudiada en modelos celulares. Aunque no se ha conseguido detectar actividad glutatión S-transferasa (Pedrola et al. 2005), algunos autores relacionan esta proteína con el estrés oxidativo (Noack et al. 2012). Lo que sí ha sido ampliamente demostrado es el rol de GDAP1 como regulador de la dinámica mitocondrial; actuando como factor de fisión mitocondrial independiente de FIS1 y DRP1 (Niemann et al. 2005; Niemann et al. 2009). Otros autores también relacionan a GDAP1 con el movimiento mitocondrial (Pla-Martín et al. 2013). Además, también ha sido relacionado con la fisión de lo peroxisomas (Huber et al. 2013) y la homeóstasis del calcio (Pla-Martín et al. 2013). Hipótesis y objetivos Basándonos en estudios previos hechos en cultivo celular y en la patofisiología de los pacientes de CMT, nuestra hipótesis es que GDAP1 está implicado en el transporte mitocondrial y en el posicionamiento de dicho orgánulo dentro de las neuronas y sus axones. Así, la patología de la enfermedad se debe a la disfunción en el transporte y/o localización de las mitocondrias, lo cual puede estar relacionado con la longitud del nervio. Así, el objetivo principal de esta tesis es investigar la función de GDAP1 y comprender su implicación en la enfermedad de CMT. Para ello hemos generado un ratón nulo para el ortólogo murino de GDAP1 como herramienta para investigar cómo la falta de función del gen causa la neuropatía. Avances en este tema pueden llegar a prevenir o reparar la axonopatía. Como primer punto de la tesis, es necesario caracterizar nuestro modelo de ratón y asegurarnos que es adecuado como modelo de CMT. Una vez este objetivo se ha conseguido, ya podremos utilizarlo como herramienta para entender en profundidad en proceso patogénico.   Resultados y Discusión El ratón nulo para Gdap1 (Gdap1-/-) se generó suprimiendo el exón 1 del Gdap1 murino mediante el sistema de recombinación Cre/loxP (genOway, Lyon, Francia; véase Materiales y Métodos para más detalles). Los ratones Gdap1 -/- se obtuvieron mediante cruces entre heterocigotos (Gdap1+/-). Los tres genotipos obtenidos en la descendencia cumplían las proporciones mendelianas y no se observaron diferencias en longevidad o fertilidad entre ellos. Los genotipos se comprobaron al tatuar los ratones, mediante biopsias de la cola que fueron utilizadas para obtener ADN genómico. Mediante diversas estrategias de PCR, y usando como molde el ADN genómico; se detectó la deleción del exón 1 en homocigosis en los ratones Gdap1-/- y en heterocigosis en los Gdap1 +/-. Los ratones Gdap1+/+ no presentaban alteración alguna en su genoma. La ausencia de expresión en los ratones Gdap1 -/- se comprobó mediante la detección de la proteína endógena en los controles (Gdap1+/+) y la carencia en los Gdap1 -/-. La falta de Gdap1 se comprobó también a nivel de mensajero, concluyéndose que la deleción del primero de los seis exones de Gdap1 es suficiente para abolir su expresión en el modelo de ratón. Además, comprobamos la expresión de su gen parálogo, GDAP1L1, (Marco et al. 2004); detectando el mensajero en solamente en sistema nervioso central (SNC). Este hecho contrasta con la hipótesis de que GDAP1L1 pueda asumir la función de GDAP1 cuando este último está mutado o delecionado (Niemann et al. 2014). Aprovechando el hecho de tener un anticuerpo para la detección de GDAP1, nos planteamos estudiar su expresión en todos los tejidos del ratón. La proteína GDAP1 fue detectada solo en tejido nervioso, corroborándose así los datos previos (Pedrola et al. 2005; Pedrola et al. 2008). La ausencia de Gdap1 en el ratón provocó defectos en el caminar, como una posición anormalmente baja del cuerpo, y una pérdida de reflejos al ser sostenidos por la cola. Además, a partir de los 6 meses algunos ratones presentaban deformidades en las patas similares al pes cavus. Esto concuerda con el fenotipo clásico de los pacientes de CMT: andar equino y las deformidades en los pies conocidas como pes planus o cavus (Brennan et al. 2015). Estos defectos no se observaron en el modelo murino de Niemann et al. 2014. Datos más cuantitativos obtenidos mediante rota-rod test revelaron defectos en la actividad motora debidos a la pérdida de Gdap1 a partir de los 3 meses. Además, mediante el estudio de la pisada, se determinó que los ratones deficientes presentaban defectos en el posicionamiento de los dedos y en la forma de apoyar en pie, lo que les obliga a dar pasos más cortos. Estas alteraciones en la pisada concuerdan con mal funcionamiento de los pequeños músculos del pie inervados por el nervio ciático y la parálisis de los músculos flexores del tobillo (Wiethölter et al. 1990). A diferencia de los pacientes (Brennan et al. 2015), no se pudo detectar pérdida de masa muscular en los músculos de la pierna. La falta de Gdap1 en el ratón también provocaba defectos en las uniones neuromusculares (NMJ); encontrando desconexión entre el axón motor y la fibra muscular a los 12 meses de edad. No se observó la típica fragmentación de la degeneración Wallerian (Coleman & Freeman 2010); sin embargo sí se detectaron anomalías en la parte más distal del axón tipo lazos y engrosamientos. Este tipo de estructuras se han relacionado con axones en retraimiento (Bishop et al. 2004). Defectos en estas sinapsis producen debilidad o parálisis muscular (Tintignac et al. 2015). Para finalizar la caracterización del modelo, se observó también daño en la médula espinal de ratones Gdap1-/-. Produciéndose una pérdida progresiva de motoneuronas en el asta ventral. Por el contrario, no se observaron alteraciones en los ganglios de la raíz dorsal, al menos a nivel histológico.   GDAP1-CMT se ha relacionado con CMT tanto axonal como desmielinizante, por ello también se estudió la Velocidad de Conducción Nerviosa (MNCV), rasgo diferencial entre ambos tipos de CMT. A los 5 meses de edad se observó un moderado descenso en la MNCV de los ratones Gdap1-/- en comparación con los controles; hecho que también ocurre en las neuropatías axonales (Sevilla et al. 2003). En las neuropatías desmielinizantes las reducciones son mayores (Tazir et al. 2014). Estudiando el Potencial de Acción Muscular Compuesto (CMAP), también observamos reducción de en área y en la amplitud; lo que puede reflejar pérdida de motoneuronas o un desorden de las uniones neuromusculares (Murray et al. 2014). Otra forma de clasificar CMT en axonal o desmielinizante es realizando una biopsia de algún nervio periférico, normalmente del sural (Sevilla et al. 2003). En nuestro modelo de ratón, nosotros optamos por el nervio ciático, al ser este el más largo (Krinke et al. 2014). Los ratones Gdap1-/- presentaban una menor densidad de fibras nerviosas a los 5 meses de manera similar a los pacientes (Sevilla et al. 2003). Por el contrario no se encontró alteración alguna en el g-ratio o presencia de los bulbos de cebolla característicos de los tipos desmielinizantes. Una vez caracterizado el modelo, nuestro objetivo era entender mejor la patofisiología a nivel celular de la enfermedad. Para ello hicimos uso del cultivo de neuronas sensitivas del ganglio dorsal (DRG) de ratones adultos (Valdés-Sánchez et al. 2010). Los cultivos de DRG ratones Gdap1-/- eran capaces de crecer; sin embargo, presentaron neuronas con somas más pequeños y neuritas más cortas en comparación con los controles. Además, se detectaron problemas en las modificaciones post-traduccionales que sufre el citoesqueleto de microtúbulos en ratones de 5 meses. El menor nivel de acetilación y mayor nivel de tirosinación encontrados, se corresponden con una desestabilización de los microtúbulos; pudiendo desencadenar problemas a nivel del trasporte de vesículas y mitocondrias (Zala et al. 2013). Además del estudio de muestras fijadas de neuronas en cultivo de DRG de ratones adultos, se estudiaron las mitocondrias en movimiento mediante la microinyección de cultivos postnatales. La microinyección nos permitió seguir las mitocondrias dentro una neurita desde su zona más proximal hasta la más distal (Gilley et al. 2011). Estudios en cultivos de DRG revelaron defectos en el movimiento retrogrado (de la zona distal a la proximal) de las mitocondrias. Concretamente se observó una tendencia al aumento del número de mitocondrias en movimiento y un aumento de su tamaño. Estos datos contrastaron con lo encontrado en cultivo de ganglio cervical superior (SCG), tejido no afectado en pacientes de CMT, donde se detectaron unas mitocondrias más lentas y con tendencia a más cortas; siendo las estáticas las que aumentaban su tamaño. El estudio se completó con el rescate de la neuronas nulas para Gdap1. En DRG se observó un descenso del número de mitocondrias en sentido retrógrado así como un descenso de la velocidad en sentido anterógrado debido a la expresión de GDAP1. En SCG solo se observó el descenso en el número de mitocondrias en sentido retrógrado. Aprovechando esta técnica, se analizó el efecto de las mutaciones más frecuentes de GDAP1 en los cultivos de DRG. Mutaciones dominantes no fueron capaces de alterar los parámetros estudiados en neuronas control. Sin embargo, mutaciones dominantes y recesivas, alteraron dichos parámetros en neuronas Gdap1-/-, siendo el efecto de la mutaciones en posición 157 y 161 más agresivo que el de las albergadas en posición 120. Esta relación con el sitio mutado en vez de con el tipo de herencia contrasta con la patología en pacientes donde las formas recesivas de GDAP1-CMT suelen ser más agresivas (Sevilla et al. 2008).   Para finalizar, se estudiaron también estos parámetros de movilidad mitocondrial en el nervio ciático del ratón gracias al uso de explantes de ratones que poseían sus mitocondrias marcadas. Ratones nulos para Gdap1 de 1 mes de edad presentaron defectos en velocidad y tamaño de sus mitocondrias al compararlos con los controles. Concretamente, se observó un descenso en la velocidad anterógrada (del soma en la médula al terminal nervioso en el músculo) y un aumento del tamaño de las mitocondrias que se movían en sentido retrógrado (del terminal nervioso en el músculo al soma en la médula). Estos datos corroboran y explican más en profundidad las alteraciones en el movimiento mitocondrial descritas en líneas de neuroblastoma debidas a la interferencia de GDAP1 (Pla-Martín 2012). Si repasamos todos los defectos producidos por la falta de GDAP1 en el movimiento mitocondrial y en el crecimiento de las neuronas, las proteínas MIRO/MILTON vienen a nuestra mente. MIRO es una GTPasa pequeña asociada a la mitocondria que regula el transporte de mitocondrias y la organización en las prolongaciones celulares (Tang 2015). De hecho, el ratón nulo para Miro1 exhibe reducción en la velocidad retrógrada (Nguyen et al. 2014). De manera similar a MIRO, GDAP1 también tiene proteínas a las que se une (Pla-Martín 2012) que pueden explicar con detalle las alteraciones observadas en el ratón nulo. La hipótesis es que GDAP1 interacciona con los transportadores SUMO4 e EIF2B5, entre otros. La pérdida de GDAP1 afecta a diversos procesos en los que estos transportadores están implicados. La ausencia de GDAP1 hace que, de alguna manera SUMO no pueda activar DRP1 (Ong et al. 2015). Como consecuencia la fisión se bloquea produciendo mitocondrias elongadas. Además, como GDAP1 no puede unirse a EIF2B5, EIF2 no puede tener la conformación apropiada y no puede bloquear Bcl-xL mediante CHOP (Iurlaro & Muñoz Pinedo 2015). Bcl-xL bloquea DRP1 (Saez-Atienzar et al. 2016) y como consecuencia la fisión se bloquea de nuevo. Bcl-xL también bloquea la acetilación de la tubulina (Saez-Atienzar et al. 2016) y, como consecuencia, el movimiento mitocondrial se ve afectado. Finalmente, como GDAP1 también interacciona con Caytaxina, el ratón nulo para Gdap1 presenta una velocidad anterógrada más lenta. Como consecuencia de la menor velocidad anterógrada, los axones distales se denervan a nivel de las NMJs. Mitocondrias más lentas también provocan la posición incorrecta de las mitocondrias en relación con el retículo endoplasmático, así como estrés de retículo.   Conclusiones 1º: Gdap1 murino se expresa en el sistema nervioso central y en el periférico. Tejidos no neuronales no expresan GDAP1. 2º: Otros miembros de la familia Gdap1, como Gdap1L1, también se expresan en el sistema nervioso central del ratón. 3º: La eliminación del primer exón de Gdap1 es suficiente para generar un modelo de ratón para Charcot-Marie-Tooth (CMT) debido a mutaciones en GDAP1. La pérdida de expresión ubicua en el ratón no afecta a su viabilidad y fertilidad. Como modelo, el ratón Gdap1-/- presenta las principales características de la enfermedad: pie cavo, déficits motores, velocidad de conducción nerviosa ligeramente reducida y alteraciones en el potencial de acción compuesto. 4º: El uso de este modelo nos ha permitido determinar que CMT debido a GDAP1 es una neuropatía de tipo axonal. 5º: El nervio ciático, el cual tiene axones sensitivos y motores, está alterado en ratones de 5 meses de edad. Se ha detectado pérdida del número de fibras y un cambio en el tamaño de las mismas. No se observaron signos desmielinizantes. 6º: En el músculo, la pérdida de Gdap1 produce denervación. Las placas neuromusculares no se encuentran totalmente ocupadas por los terminales nerviosos a los 12 meses de edad. Además, detectamos estructuras anormales en dichos terminales. Las uniones neuromusculares de ratones de 5 meses de edad, son indistinguibles entre controles y animales nulos para Gdap1. 7º: En la parte ventral de la médula espinal, la pérdida de Gdap1 produce una pérdida progresiva de neuronas sanas. Señales de daño han sido detectadas en lisados de la médula espinal completa. 8º: En los ganglios de la raíz dorsal (DRG), la ausencia de GDAP1 parece no alterar las neuronas sensitivas al menos a nivel histológico hasta los 12 meses de edad. 9º: Cultivos de DRG de animales adultos se ven comprometidos por la pérdida de GDAP1. Se han observado somas más pequeños y neuritas más cortas. Desestabilización del citoesqueleto de microtúbulos puede explicar estos defectos. 10º: La pérdida de GDAP1 afecta principalmente al transporte y la dinámica mitocondrial. Tejidos afectados en CMT de los ratones Gdap1-/- , como DRG en cultivo y nervio ciático, presentaron mitocondrias en movimiento retrógrado más largas. Además, la velocidad anterógrada estaba reducida. Tejidos no afectados en CMT, como ganglio superior cervical en cultivo, presentó mitocondrias más cortas y lentas en movimiento retrógrado. 11º: Mutaciones en GDAP1 presentes en pacientes de CMT produjeron efectos diversos en neuronas sensitivas en cultivo. Esta variedad de efectos concuerda con al amplio rango de fenotipos presentado en los pacientes.   Material y Métodos Para llevar a cabo todo este estudio profundo del ratón nulo para Gdap1 se han utilizado técnicas frecuentemente realizadas en laboratorios de genética molecular. Otras son de uso rutinario en ámbitos donde se trabaja con el ratón como animal modelo. Sin embargo también se han puesto a punto algunas técnicas novedosas en nuestro laboratorio como el estudio de las uniones neuromusculares (NMJ). Para ello elegimos el Gastrocnemius (en la pantorrilla) como músculo de estudio por presentar unas sinapsis retrasadas (DeSyn, Delayed Synapsis), cuyo mantenimiento depende exclusivamente de los factores provenientes del nervio (Pun et al. 2002), y por ser un músculo grande de fácil acceso (Murray et al. 2014). La técnica de marcaje de las NMJ consistió en diseccionar el musculo y fijarlo en paraformaldehído. Posteriormente se marcó la parte muscular de la NMJ, el receptor de la Acetilcolina (AChR) con bungarotoxina conjugada con rodamina. Para marcar la parte del terminal nervioso se realizó una inmunohistoquímica normal con un anticuerpo primario frente a la Beta Tubulina III y un secundario conjugado con Alexa-488. Una vez realizado el marcaje, se procedió a cortar el músculo longitudinalmente para su posterior montaje en portaobjetos. Fue necesario el uso de un microscopio confocal potente para poder obtener imágenes confocales de series contiguas en z (cada 0.5µM). Con todas esas imágenes confocales ser realizó una reconstrucción en 3D con la que estudiar si las NMJ estaban correctamente inervadas. Una NMJ se contabilizó como completamente ocupada si había evidencia de una continuidad entre el terminal nervioso (Beta tubulina III) y la placa neuromuscular (AChR) (Wong et al. 2009). Otra técnica interesante fue el uso de microinyecciones para marcar mitocondrias selectivamente en un subconjunto de neuritas de neuronas sensitivas en cultivo (Gilley & Colema

Mouse model for Charcot-Marie-Tooth as a tool to better understand the disease

Tesis doctoral en inglés con resumen de todos los apartados en español : 153 p.This thesis has been possible thanks to a Formación Personal Investigador fellowship (BES-2010-040234) as part of Plan Nacional Poject named "Papel de la mitocondria en la neurodegeneración de las neuropatías periféricas hereditarias" (SAF2009-07063). Dr Coleman's laboratory stay was possible thanks to Estancias Breves Program (EEBBI-14-00467) named "Estudio del movimiento mitocondrial un el modelo murino para la enfermedad de Charcot-Maire-Tooth deficiente en Gdap1".Peer reviewe

SARS-CoV-2 Prevalence in Laparoscopic Surgery Filters. Analysis in Patients with Negative Oropharyngeal RT-qPCR in a Pandemic Context: A Cross-Sectional Study

Objective: Surgical societies of different specialties have lately demonstrated a growing concern regarding the potential risk of SARS-CoV-2 transmission during surgery, mainly via aerosols carrying SARS-CoV-2 particles during laparoscopy smoke evacuation. Since there is not sufficient scientific evidence to rule out this hypothesis, our study aimed to evaluate the prevalence of the appearance of SARS-CoV-2 genetic material in the in-filter membrane of the smoke filter systems, used in laparoscopic surgery, in a tertiary referral hospital during the peak phases of the pandemic. Methods: During the highest incidence of the pandemic outbreak, 180 laparoscopic smoke evacuation systems were collected from laparoscopies performed between April 2020 and May 2021 in University General Hospital of Castellón. As part of the safety protocol established as a result of the pandemic, an oropharyngeal reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed before surgery. We performed RT-qPCR tests for the detection and quantification of SARS-CoV-2 genetic material in the in-filter membranes extracted from the smoke evacuation systems. Results: We found two RT-qPCR positive in-filters from a sample of 128 patients with SARS-CoV-2-negative results in their oropharyngeal RT-qPCR, i.e., 1.6% (95% CI: 0.5–5.5%). From this estimation, the predictive posterior probabilities of finding n cases of negative oropharyngeal COVID-19 patients with positive filters increases with the increasing number of surgeries performed. Conclusions: This cross-sectional study provides evidence suggesting that airborne transmission of SARS-CoV-2 particles from smoke evacuation of aerosols carrying viral particles during laparoscopy should not be ruled out

Proposal of 5-methoxy-N-methyl-N-isopropyltryptamine consumption biomarkers through identification of in vivo metabolites from mice

New psychoactive substances (NPS) are a new breed of synthetically produced substances designed to mimic the effects of traditional illegal drugs. Synthetic cannabinoids and synthetic cathinones are the two most common groups, which try to mimic the effects of the natural compounds 9Δ-tetrahydrocannabinol and cathinone, respectively. Similarly, synthetic tryptamines are designer compounds which are based on the compounds psilocin, N,N-dimethyltryptamine and 5-methoxy-N,N-dimethyltryptamine found in some mushrooms. One of the most important tryptamine compounds found in seizures is 5-methoxy-N,N-diisopropyltryptamine, which has been placed as controlled substance in USA and some European countries. The control of this compound has promoted the rising of another tryptamine, the 5-methoxy-N-methyl-N-isopropyltryptamine, which at the time of writing this article has not been banned yet. So, it is undeniable that this new substance should be monitored. 5-methoxy-N-methyl-N-isopropyltryptamine has been reported by the Spanish Early Warning System and detected in our laboratory in two pill samples purchased in a local smart shop. This has promoted the need of stablishing consumption markers for this compound in consumers’ urine. In the present work, the metabolism and pharmacokinetic of 5-methoxy-N-methyl-N-isopropyltryptamine has been studied by an in vivo approach, using adult male mice of the inbred strain C57BLJ/6. The use of ultra-high performance liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry allowed the identification of four metabolites. After the pharmacokinetic study in serum and urine, the O-demethylated metabolite and the non-metabolised parent compound are proposed as consumption markers in hydrolysed urine. Data reported in this work will help hospitals and forensic laboratories to monitor the consumption and potential intoxication cases related to this tryptamine

Motherhood-induced gene expression in the mouse medial amygdala: Changes induced by pregnancy and lactation but not by pup stimuli

During lactation, adult female mice display aggressive responses toward male intrud-ers, triggered by male- derived chemosensory signals. This aggressive behavior is not shown by pup- sensitized virgin females sharing pup care with dams. The genetic mechanisms underlying the switch from attraction to aggression are unknown. In this work, we investigate the differential gene expression in lactating females ex-pressing maternal aggression compared to pup- sensitized virgin females in the me-dial amygdala (Me), a key neural structure integrating chemosensory and hormonal information. The results showed 197 genes upregulated in dams, including genes encoding hormones such as prolactin, growth hormone, or follicle- stimulating hor-mone, neuropeptides such as galanin, oxytocin, and pro- opiomelanocortin, and genes related to catecholaminergic and cholinergic neurotransmission. In contrast, 99 genes were downregulated in dams, among which we find those encoding for inhibins and transcription factors of the Fos and early growth response families. The gene set analysis revealed numerous Gene Ontology functional groups with higher expres-sion in dams than in pup- sensitized virgin females, including those related with the regulation of the Jak/Stat cascade. Of note, a number of olfactory and vomeronasal receptor genes was expressed in the Me, although without differences between dams and virgins. For prolactin and growth hormone, a qPCR experiment comparing dams, pup- sensitized, and pup- naïve virgin females showed that dams expressed higher lev-els of both hormones than pup- naïve virgins, with pup- sensitized virgins showing intermediate levels. Altogether, the results show important gene expression changes in the Me, which may underlie some of the behavioral responses characterizing ma-ternal behavior

Olor a Nenuco. Estímulos químicos de cría y su impacto en la madre

Una correcta conducta maternal es fundamental para la supervivencia de la descendencia y la maduración de su sistema nervioso. Esta investigación analiza el sustrato neuroendocrino de la conducta maternal en ratones, para ayudar a comprender la etiología de sus posibles alteraciones. El objetivo es entender por qué las madres muestran mayor motivación hacia las crías que las hembras vírgenes. Nuestra hipótesis plantea que, durante la gestación, factores endocrinos podrían estimular determinados centros del cerebro de las madres haciéndolos más sensibles a las feromonas de crías. Para poner a prueba esta hipótesis hemos expuesto a madres y a hembras vírgenes a dos tipos de estímulo, crías y botones. Mediante la detección inmunohistoquímica de c-Fos medimos la actividad neuronal de sus centros quimiosensoriales (bulbos olfativos principal y accesorio, córtex piriforme, amígdala medial y cortical). El análisis estadístico (anova de dos factores, hembra y estímulo) no mostró diferencias significativas entre madres y comadres en la activación de los centros quimiosensoriales al exponerlas a crías o botones, aunque sí una tendencia a una mayor actividad en la amígdala medial posterodorsal en madres, independiente del estímulo. Finalmente, observamos una correlación significativa entre conducta maternal y actividad neuronal en centros quimiosensoriales en el grupo de hembras expuestas a crías, que sugieren el uso de circuitos neuronales diferentes entre madres y vírgenes durante su interacción con las crías.Appropriate maternal behaviour is essential for offspring survival and for its neurodevelopment. This research analyses the neuroendocrine substrate of maternal behaviour in mice, to help understanding the aetiology of their possible disorders. Our goal is to understand why mothers show higher motivation towards offspring than virgin females. Our hypothesis postulates that changes induced by gestational hormones could sensitize specific mothers’ brain centres to pup pheromones. For this purpose, we exposed dams and virgin females to two different stimuli, pups and buttons. Through immunohistochemical detention of c-Fos, we assessed the neuronal activity in their chemosensory centres (main and accessory olfactory bulbs, piriform cortex, medial and cortical amygdala). A twoway ANOVA, with female and stimulus as factors, did not show differences between dams or virgins in the activation of chemosensory centres when exposed to pups or buttons, although it showed a nearly significant trend towards higher activation of the medial amygdala in dams, irrespective of the stimulus. Finally, we observed significant correlations between maternal behaviour and the activity of chemosensory centres in the group of females exposed to pups, which suggest the use of different neuronal circuits by dams and virgin females during their interaction with pups

Becoming a mother shifts the activity of the social and motivation brain networks in mice

During pregnancy hormones increase motivated pup-directed behaviors. We here analyze hormone-induced changes in brain activity, by comparing cFos-immunoreactivity in the sociosexual (SBN) and motivation brain networks (including medial preoptic area, MPO) of virgin versus late-pregnant pup-naïve female mice exposed to pups or buttons (control). Pups activate more the SBN than buttons in both late-pregnant and virgin females. By contrast, pregnancy increases pup-elicited activity in the motivation circuitry (e.g. accumbens core) but reduces button-induced activity and, consequently, button investigation. Principal components analysis supports the identity of the social and motivation brain circuits, placing the periaqueductal gray between both systems. Linear discriminant analysis of cFos-immunoreactivity in the socio-motivational brain network predicts the kind of female and stimulus better than the activity of the MPO alone; this suggests that the neuroendocrinological basis of social (e.g. maternal) behaviors conforms to a neural network model, rather than to distinct hierarchical linear pathways for different behaviors

Influencia del estrés en la conducta maternal en hembras de ratón

El comportamiento maternal asegura la supervivencia de la descendencia hasta alcanzar la madurez sexual. Se trata de una conducta regulada por el cerebro socio-sexual y diferentes factores (como el estrés) pueden alterar los núcleos neuronales que rigen su funcionamiento. Así, el objetivo del presente trabajo será revisar la bibliografía existente hasta la fecha sobre el efecto que producen diferentes tipos de estrés en la posterior conducta maternal en hembras de ratón, seleccionando principalmente por su importancia dos tipos de conductas: la motivación maternal y la agresión maternal (es decir, tanto conductas dirigidas como no dirigidas a las crías). Para ello, primero describiremos las diferentes metodologías utilizadas para estudiar ambos tipos de conductas y, después, mostraremos los principales estudios que muestran el efecto de diferentes tipos de estrés en dicha conducta. Los resultados observados indican que el estrés modifica la conducta maternal ya que se han observado cambios en motivación y agresión. Sin embargo, algunos datos son ambiguos y varían en función del tipo de estrés o período gestacional/postparto en el que se sufre. A pesar de que más estudios son necesarios en este campo, este trabajo contribuirá al avance del concomiendo en patologías asociadas al estrés y la maternidad.Maternal behaviour ensures offspring’s survival, until the progeny arrives to sexual maturity. This behavior is regulated by the socio-sexual brain and different factors (such as stress) can alter the neural cores that control its performance. The objective of the present study is to revise the existing bibliography till the date about the effect that different types of stress produce in the future maternal behavior on female mice, selecting by the relevance two types of behaviour: maternal motivation and maternal aggression (behavior directed and non-directed towards pups). First, we will describe the different methodologies used to study both kind of behavior, then we will present the principal studies that shows the effect of different types of stress on behavior. The observed results suggest that stress modifies maternal behavior, because stress changes maternal motivation and maternal aggression. However, some data are ambiguous and vary according to the type of stress or gestational/postpartum period. Although more studies are needed in this field, this work will contribute to the advancement of knowledge in pathologies associated with stress and motherhood

Understanding the pharmacokinetics of synthetic cathinones: Evaluation of the blood–brain barrier permeability of 13 related compounds in rats

This is the pre-peer reviewed version of the following article:Understanding the pharmacokinetics of synthetic cathinones: Evaluation of the blood–brain barrier permeability of 13 related compounds in rats, which has been published in final form at https://doi.org/10.1111/adb.12979. This article may be used for non-commercial purposes in accordance with Wiley Terms and Conditions for Use of Self-Archived Versions.Synthetic cathinones are the second most commonly seized new psychoactive substance family in Europe. These compounds have been related to several intoxication cases, including fatalities. Although the pharmacological effects, metabolism, and pharmacokinetics of cathinones have been studied, there is little information about the permeability of these compounds through the blood–brain barrier (BBB). This is an important parameter to understand the behavior and potency of cathinones. In this work, 13 selected cathinones have been analyzed in telencephalon tissue from Sprague–Dawley rats intraperitoneally dosed at 3 mg/kg. Our results revealed a direct relationship between compound polarity and BBB permeability, with higher permeability for the more polar cathinones. The chemical moieties present in the cathinone had an important impact on the BBB permeability, with lengthening of the α‐alkyl chain or functionalization of the aromatic ring with alkyl moieties resulting in lower concentration in telencephalon tissue. Our data suggest that transport of cathinones is a carrier‐mediated process, similar to cocaine transport across the BBB

In-depth comparison of the metabolic and pharmacokinetic behaviour of the structurally related synthetic cannabinoids AMB-FUBINACA and AMB-CHMICA in rats

Synthetic cannabinoids receptor agonists (SCRAs) are often almost completely metabolised, and hence their pharmacokinetics should be carefully evaluated for determining the most adequate biomarker in toxicological analysis. Two structurally related SCRAs, AMB-FUBINACA and AMB-CHMICA, were selected to evaluate their in vivo metabolism and pharmacokinetics using male Sprague-Dawley rats. Brain, liver, kidney, blood (serum) and urine samples were collected at different times to assess the differences in metabolism, metabolic reactions, tissue distribution and excretion. Both compounds experimented O-demethyl reaction, which occurred more rapidly for AMB-FUBINACA. The parent compounds and O-demethyl metabolites were highly bioaccumulated in liver, and were still detected in this tissue 48 h after injection. The different indazole/indole N-functionalisation produced diverse metabolic reactions in this moiety and thus, different urinary metabolites were formed. Out of the two compounds, AMB-FUBINACA seemed to easily cross the blood-brain barrier, presenting higher brain/serum concentrations ratio than AMB-CHMICA