Dynamic Control of Dendritic mRNA Expression by CNOT7 Regulates Synaptic Efficacy and Higher Cognitive Function

Translation of mRNAs in dendrites mediates synaptic plasticity, the probable cellular basis of learning and memory. Coordination of translational inhibitory and stimulatory mechanisms, as well as dendritic transport of mRNA, is necessary to ensure proper control of this local translation. Here, we find that the deadenylase CNOT7 dynamically regulates dendritic mRNA translation and transport, as well as synaptic plasticity and higher cognitive function. In cultured hippocampal neurons, synaptic stimulation induces a rapid decrease in CNOT7, which, in the short-term, results in poly(A) tail lengthening of target mRNAs. However, at later times following stimulation, decreased poly(A) and dendritic localization of mRNA take place, similar to what is observed when CNOT7 is depleted over several days. In mice, CNOT7 is essential for hippocampal-dependent learning and memory. This study identifies CNOT7 as an important regulator of RNA transport and translation in dendrites, as well as higher cognitive function

Caracterização funcional de proteínas Poli-Q em Trypanosoma cruzi : envolvimento na regulação da expressão gênica

Orientador : Prof. Dr. Samuel GoldenbergTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 18/12/2012Bibliografia: fls.130-153Resumo: Em tripanossomatídeos, a regulação da expressão gênica ocorre principalmente em nível pós-transcricional. A associação entre mRNAs e determinadas proteínas determinam o destino de um mRNA, direcionando-o à tradução, repressão ou degradação. Para caracterizar complexos proteicos associados a mRNAs traduzidos ou não-traduzidos, um trabalho prévio isolou mRNPs de epimastigotas e epimastigotas sob estresse nutricional utilizando microesferas poli-(T) e os complexos proteicos ligados a mRNAs poli-(A+) foram analisados por espectrometria de massas. Dentre estas proteínas, uma proteína poli-Q com função desconhecida, ortóloga à TbGAP2 em T. brucei, foi identificada, presente nas frações polissomal e pós-polissomal de epimastigotas e epimastigotas sob estresse nutricional. O objetivo deste estudo é caracterizar esta proteína e determinar se esta está envolvida com a regulação da expressão gênica. O gene codificador desta proteína foi clonado e expresso para produzir anti-soro policlonal. O anti-soro contra a proteína TcGAP2 mostrou especificidade e identificou uma proteína de tamanho esperado em extratos de T. cruzi. TcGAP2 está presente no cinetoplasto e no citoplasma. Além disso, análises por Western blotting mostraram que TcGAP2 está diminuída nas formas metacíclicas, corroborando a marcação de imunofluorescência mais fraca nestas formas. Quando lisados de epimastigotas e epimastigotas sob estresse nutricional foram aplicados em gradiente de sacarose 15-55% e as frações foram analisados por imunoblotting, a proteína foi detectada em polissomos apenas nas últimas formas. Marcação in situ de nicks e gaps nas redes de minicírculos com a terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) e dUTP fluorescente seguida de imunofluorescência mostrou co-localização parcial indicando certo envolvimento com replicação de minicírculo. Para identificar mRNAs e proteínas associadas a complexos mRNPs contendo TcGAP2, foram realizados ensaios de imunoprecipitação com o soro contra TcGAP2 usando lisados de epimastigotas e epimastigotas sob estresse nutricional. Os RNAs alvo de TcGAP2 foram identificados por sequenciamento de RNA em larga escala e as proteínas, por espectrometria de massas. Os transcritos dos complexos contendo TcGAP2 mudam entre as duas formas, entretanto eles são funcionalmente relacionados, estando enriquecidos em ligação a ATP, fosforilação de proteínas, processo metabólico, dentre outros. Análises utilizando o algoritmo MEME foram realizadas para identificar motivos de sequência comuns dentre os alvos identificados. Nenhum motivo aparente foi encontrado nas regiões 3' não-traduzidas nem nas regiões codificadoras. Entretanto, dois motivos foram encontrados na região 5' nãotraduzida. Assim como os RNAs alvo mudam entre os dois estágios, as proteínas parceiras também. Algumas das proteínas identificadas em epimastigotas como parte dos complexos contendo TcGAP2 incluem proteínas ribossomais e proteínas de ligação a RNA e em epimastigotas sob estresse nutricional, várias proteínas hipotéticas. Já GAP1 foi identificada em ambas formas e, juntamente com GAP2, está envolvida com estabilização de gRNA em T. brucei. O duplo nocaute do gene de TcGAP2 não se mostrou viável sugerindo que este gene seja essencial. Estes dados sugerem que esta proteína pode ter diferentes funções dependendo de sua localização e que TcGAP2 é um componente de complexos ribonucleoprotéicos no citoplasma que podem estar regulando o processamento de mRNAs específicos.Abstract: In trypanosomatids, regulation of gene expression occurs mainly at the posttranscriptional level. The association between mRNAs and certain proteins determine mRNA fate, directing them to translation, repression or degradation. To characterize protein complexes associated with non-translated or translated mRNAs, previous work isolated mRNPs from epimastigotes and epimastigotes under nutritional stress using poly-(T) beads and the protein complexes bound to poly-(A+) mRNAs were analysed by mass spectrometry. Among these proteins, one hypothetical poly-Q rich protein, ortholog of TbGAP2 in T. brucei, were identified, present in the polysomal and post-polysomal fractions of epimastigotes and epimastigotes under nutritional stress. The aim of this study is to characterize this protein and to determine if it is involved in gene expression regulation. The gene encoding this protein was cloned and expressed to produce polyclonal antisera. TcGAP2 antisera showed specificity and identified a protein with an expected weight using T. cruzi extracts. TcGAP2 was shown to localize in the kinetoplast and in the cytoplasm. Moreover western blot analysis was performed and showed that TcGAP2 is downregulated in metacyclic forms, corroborating the weak immunofluorescence staining in these forms. When epimastigotes and nutritionally stressed epimastigotes lysates were loaded onto a 15-55% sucrose gradient and the fractions were analysed by immunoblot, we observed that the protein was detected in polysome complexes only in the latter. In situ labeling of the nicks and gaps in network minicircles with terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) and fluorescent dUTP followed by immunofluorescence showed partial colocalization indicating some involvement with minicircle replication. To identify mRNAs and proteins associated to TcGAP2 mRNP complexes, we carried out immunoprecipitation assays with anti-GAP2 serum using epimastigotes and epimastigotes under nutritional stress lysates. The RNA targets of TcGAP2 were identified by RNA deep sequencing technology and proteins were identified by mass spectrometry. The transcripts in TcGAP2 complexes change between these two forms however they are functionally related, being enriched for ATP binding, protein phosphorylation, metabolic process, among others. MEME algorithm analysis was used to identify commonly occurring sequence motifs among the identified RNAs. No apparent motifs were found in the 3' untranslated region nor in the coding sequence. However, two motifs were found in the 5' untranslated region. As TcGAP2 RNA targets change between the two stages, protein partners also do. Some of the proteins identified in epimastigotes as part of TcGAP2 complexes include ribosomal proteins and RNA-binding proteins and in epimastigotes under nutritional stress, many hypothetical proteins. GAP1 was identified in both forms and together with GAP2 are involved in gRNA stabilization in T. brucei. Double-knockout of TcGAP2 gene was not successfully achieved suggesting that this gene is essential. These data suggest that this protein can have different roles depending on its localization and that TcGAP2 is a component of ribonucleoprotein complexes in the cytoplasm that might be regulating the processing of specific mRNAs

Estudos comparativos de técnicas de isolamento de polissomos em Trypanosoma cruzi

Orientador: Samuel GoldenbergCoorientador: Marco Antonio Ferreira RandiMonografia (Bacharelado) - Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciencias Biológicas. Curso de Graduaçao em Ciencias BiológicasResumo : Sabe-se que tripanosomatídeos regulam a expressão gênica essencialmente em nível póstranscricional. Dados sugerem que a estabilidade dos mRNAs e o acesso deles aos polissomos devem ser os mecanismos envolvidos na regulação pós-transcricional. Estudos de expressão gênica em Trypanosoma cruzi realizados em nosso laboratório, em nível de genes individuais e genômica, têm demonstrado a importância de usar mRNAs contidos na fração polissomal. Entretanto, estudos de genômica funcional com T brucei, recentemente realizados por BREMS et aI. (2005), concluíram que não há diferenças significantes entre RNA total e polissomal quando comparados diferentes estágios de desenvolvimento. Estas observações divergentes podem ser devido a diferenças nos protocolos de obtenção de polissomos ou na confecção do microarranjo, entre outras causas. O objetivo desse trabalho é comparar os protocolos de Brems e Goldenberg usados para extração de polissomos de Trypanosoma cruzi. As comparações foram feitas por análises dos perfis de sedimentação dos polissomos em gradientes de sacarose e por análises de microarranjo dos mRNAs polissomais. Epimastigotas foram processados de acordo com cada protocolo para obtenção dos polissomos. As comparações dos perfis polissomais utilizando gradientes de sacarose mostraram mais semelhanças do que diferenças entre os procedimentos. Entretanto, alguns picos extras foram observados quando utilizado o protocolo de BREMS et ai (2005) na porção não-polissomal. Análises de microarranjo mostraram que 88% dos spots refletiram um padrão similar de expressão gênica entre os protocolos. As diferenças observadas devem estar contribuindo minimamente para os resultados divergentes observados nos dois laboratórios, mas não poderiam explicá-los. As similaridades observadas por BREMS et aI. (2005) entre as duas populações de RNA podem ser devido, principalmente, a diferenças no tipo e confecção do microarranjo

Hydrogels Applied for Conformance-Improvement Treatment of Oil Reservoirs

This chapter aims at presenting a review of gelling polymer systems that are commercially available or under academic development with potential to control the anisotropic permeability profile of heterogeneous oil reservoirs. In these reservoirs, the oil recovery and sweep efficiency tend to be low, even after applying secondary and enhanced oil recovery methods, because the injected fluid flows preferably through the matrix’s most permeable regions leaving behind part of the displaceable oil retained at the nonswept volume. For that, cross-linked polymers can be used to plug the high-permeability main paths by means of: (i) the formation of an in situ hydrogel or (ii) the adsorption or swelling of pre–cross-linked hydrogel within the reservoir pores, thus causing the diversion of the subsequently injected fluid to low-permeability zones and/or preventing the channeling and early breakthrough of the injected fluid (water or gas) in production wells. The selection of the most suitable hydrogel for the reservoir conformance-improvement treatment should take into account the nature of the conformance problem, the reservoir’s lithology, mineralogy, temperature, pH value, salinity, and hardness of the formation water, as well as the gelling system toxicity and cost

Antifungal activity against Cryptococcus neoformans strains and genotoxicity assessment in human leukocyte cells of Euphorbia tirucalli L.

In the last times, focus on plant research has increased all over the world. Euphorbia tirucalli L., a plant known popularly as Aveloz, and originally used in Africa, has been drawing attention for its use in the United States and Latin America, both for use as an ornamental plant and as a medicinal plant. E. tirucalli L. is a member of the family Euphorbiaceae and contains many diterpenoids and triterpenoids, in particular phorbol esters, apparently the main constituent of this plant, which are assumed to be responsible for their activities in vivo and in vitro. The in vitro antifungal activities of Euphorbia tirucalli (L.) against opportunistic yeasts were studied using microbroth dilution assay. The results showed that aqueous extract and latex preparation were effective against ten clinical strains of Cryptococcus neoformans in vitro (Latex and extract MIC range of 3.2 - > 411 g/mL). Aiming the safe use in humans, the genotoxic effects of E. tirucalli were evaluated in human leukocytes cells. Our data show that both aqueous extract and latex preparation have no genotoxic effect in human leukocytes cells in vitro. Although the results cannot be extrapolated by itself for use in vivo, they suggest a good perspective for a therapeutic application in future. In conclusion, our results show that the aqueous extract and latex preparation from E. tirucalli L. are antifungal agents effectives against several strains of C. neoformans and do not provoke DNA damage in human leukocyte cells, considering the concentrations tested

PREVENÇÃO DA CÁRIE EM ESCOLARES ATRAVÉS DE TESTES DE AVALIAÇÃO AO RISCO BIOLÓGICO DE DESENVOLVIMENTO DA DOENÇA

A ação visa identificar as condições de saúde bucal dos escolares da Rede de Ensino de Campo Largo e Região Metropolitana de Curitiba por meio de anamnese, exame clínico, avaliação de determinantes sócio-econômicas e análise de risco à cárie dental a partir da incidência de Streptococcus mutans, fornecendo dados biológicos para o controle da doença. Estudos realizados demonstraram que grupos de indivíduos com alta contagem de S. mutans na saliva apresentam significativamente maior atividade de cárie. Múltiplos testes de avaliação do risco biológico ao desenvolvimento da cárie têm sido descritos (Brathall & Carlson, 1988) com a finalidade de prever uma susceptibilidade individual identificando indivíduos que precisam de medidas específicas de prevenção, ou ainda, reduzir a velocidade de progressão da doença. O número de S. mutans na saliva é diretamente proporcional à manifestação clínica da doença. Além disso, existem biosorotipos da bactéria circulando na população, sendo assim, a investigação microbiológica através da identificação das colônias de S. mutans permite uma análise quantitativa e qualitativa do agente etiológico em cada individuo e ainda, estudos de variabilidade e distribuição dos diversos biosorotipos isolados. A prevenção baseada no risco biológico é possível e de fundamental importância

Ambiente Virtual de Ensino em Laboratórios de Química (AQuí): Expandindo o Ensino no YouTube:

Digital information and communication technology tools have been used as allies in teaching. Chemistry teaching sometimes requires practical activities in laboratories to elucidate the content better, and using videos aimed at this approach can help in the teaching-learning process. This descriptive, qualitative and quantitative study aims to describe the production of manual videos to handle equipment in chemistry laboratories and analyze the scope of the material produced and made available on the "Projeto AQuí" channel on YouTube. Undergraduate students' teaching material was prepared, following the pre-production, production, and post-production steps described in this work. Through the indicators obtained by Google Analytics, it was possible to verify the impact of the material produced. Through the comments left voluntarily on the page, it was possible to perceive viewers' satisfaction with the material. Based on the metrics analyzed, the "Projeto AQuí" channel on YouTube fulfills its proposal to disseminate material on laboratory operations, with a national and international reach.   Keywords: DICT. Technology in education.Video. Laboratory equipment.As ferramentas de tecnologia digitais da informação e comunicação vem sendo utilizadas como aliadas no ensino. O ensino de química por vezes necessita de atividades práticas em laboratórios para melhor elucidar o conteúdo, e utilizar vídeos voltados para esta abordagem podem auxiliar no processo de ensino aprendizagem. Este estudo, de caráter descritivo, qualitativo e quantitativo, tem por objetivo descrever a confecção de vídeos-manuais voltados ao manuseio de equipamentos em laboratórios de química, e analisar o alcance e a satisfação do material produzido e disponibilizado no canal “Projeto AQuí” no YouTube. O material didático foi elaborado por alunos de graduação, seguindo os passos de pré-produção, produção e pós produção descritos neste trabalho. Através dos indicadores obtidos pelo YouTube Analytics, foi possível verificar o alcance do material produzido, e através dos comentários deixados voluntariamente na página foi possível perceber a satisfação dos espectadores com o material. Com base nas métricas analisadas, o canal “Projeto AQuí” no YouTube cumpre sua proposta de divulgação de material sobre operações laboratoriais, com um alcance nacional e internacional, sendo utilizado por instituições de ensino técnico e de ensino superior.   Palavras-chave: TDIC. Material didático. Tecnologia na educação. Vídeo. Equipamentos de laboratório