MHC genes copy number and TCR repertoire size in the bank vole: diversity, selection and the optimality hypothesis

Wydział BiologiiGłówny układu zgodności tkankowej (MHC) inicjuje swoistą odpowiedzi immunologiczną poprzez prezentację obcych antygenów limfocytom T. Wysoki polimorfizm genów MHC, promowany i utrzymywany przez presję patogenów, kontrastuje z ograniczoną liczbą loci MHC występujących w genomach większości kręgowców. Hipoteza optymalności, starająca się wyjaśnić tę obserwację, zakłada, że zwiększona możliwość rozpoznawania patogenów (zapewniana dodatkowymi genami MHC) byłaby niwelowana przez tolerogenną (tj. zapobiegającą autoimmunizacji) deplecję repertuaru receptorów limfocytów T (TCR). Głównym celem tej rozprawy doktorskiej było bezpośrednie testowanie przewidywań hipotezy optymalności: czy osobniki podsiadające dużą liczbę genów MHC rzeczywiście mają mniejszy repertuaru TCR. Badania wykazały, że wysoka, osobnicza różnorodność w obrębie MHC klasy I, ale nie klasy II, wiązała się ze zmniejszeniem repertuaru TCR. Płeć także wpływała na repertuar TCR, i był on niższy u samców, w porównaniu do samic. Badania prowadzono na nornicy rudej (Myodes glareolus), gatunku gryzonia charakteryzującego się duża, między-osobniczą zmiennością w licznie ulegających ekspresji genów MHC. Jest to gatunek niemodelowy, nieposiadający rozbudowanych zasobów immunogenetycznych. Dlatego też, w pierwszych częściach rozprawy scharakteryzowano geny białek zaangażowanych w prezentację i rozpoznawanie antygenu (różnorodność MHC i repertuaru TCR). Podsumowując, praca ta jest ważnym krokiem w kierunku zrozumienia ewolucyjnych kompromisów kształtujących układ odpornościowy kręgowców

MHC genes copy number and TCR repertoire size in the bank vole: diversity, selection and the optimality hypothesis

Wydział BiologiiGłówny układu zgodności tkankowej (MHC) inicjuje swoistą odpowiedzi immunologiczną poprzez prezentację obcych antygenów limfocytom T. Wysoki polimorfizm genów MHC, promowany i utrzymywany przez presję patogenów, kontrastuje z ograniczoną liczbą loci MHC występujących w genomach większości kręgowców. Hipoteza optymalności, starająca się wyjaśnić tę obserwację, zakłada, że zwiększona możliwość rozpoznawania patogenów (zapewniana dodatkowymi genami MHC) byłaby niwelowana przez tolerogenną (tj. zapobiegającą autoimmunizacji) deplecję repertuaru receptorów limfocytów T (TCR). Głównym celem tej rozprawy doktorskiej było bezpośrednie testowanie przewidywań hipotezy optymalności: czy osobniki podsiadające dużą liczbę genów MHC rzeczywiście mają mniejszy repertuaru TCR. Badania wykazały, że wysoka, osobnicza różnorodność w obrębie MHC klasy I, ale nie klasy II, wiązała się ze zmniejszeniem repertuaru TCR. Płeć także wpływała na repertuar TCR, i był on niższy u samców, w porównaniu do samic. Badania prowadzono na nornicy rudej (Myodes glareolus), gatunku gryzonia charakteryzującego się duża, między-osobniczą zmiennością w licznie ulegających ekspresji genów MHC. Jest to gatunek niemodelowy, nieposiadający rozbudowanych zasobów immunogenetycznych. Dlatego też, w pierwszych częściach rozprawy scharakteryzowano geny białek zaangażowanych w prezentację i rozpoznawanie antygenu (różnorodność MHC i repertuaru TCR). Podsumowując, praca ta jest ważnym krokiem w kierunku zrozumienia ewolucyjnych kompromisów kształtujących układ odpornościowy kręgowców

A comparative analysis of microscopy and PCR-based methods in detection of avian malaria parasites

Ptasie pasożyty krwi, w tym krwinkowce wywołujące tzw. “ptasią malarię”, to powszechny model w badaniach z zakresu biologii ewolucyjnej i ekologii, oraz użyteczny predykator w analizie dynamiki naturalnie występujących infekcji malarycznych u ludzi, szczególnie, w obliczu globalnych zmian klimatu. Współczesne badania coraz częściej zastępują tradycyjne, mikroskopowe techniki wykrywania pasożytów metodami molekularnymi, w większości opartymi o łańcuchową reakcję polimerazy (PCR). Czułość i dokładność obu metod jest przedmiotem ożywionej dyskusji, tym bardziej, że dotychczasowe porównania nie doprowadziły do jednoznacznych konkluzji.Celem niniejszej pracy było określenie czułości metody molekularnej w porównaniu z tradycyjną obserwacją rozmazów krwi pod mikroskopem, oraz oszacowanie stopnia zapasożycenia i identyfikacja szczepów pasożytów z rzędu Haemosporida w materiale zebranym w populacji rokitniczki (Acrocephalus schoenobaenus) z Doliny Nidy (południowo-wschodnia Polska). Analizowano 442 próbki krwi pozyskane w latach 2004-2008. Wyniki analizy molekularnej porównano z rezultatami wcześniej przeprowadzonych obserwacji mikroskopowych.Wykazano, że zastosowana metoda molekularna charakteryzuję się wyższą czułością niż metoda mikroskopowa. W badanej populacji wykryto 7 szczepów pasożytów z rodzaju Haemoproteus i Plasmodium. Najczęściej występujące należą do gatunku Haemoproteus belopolskyi (niemal 95% zainfekowanych ptaków – szczepy SW1 (59,2% osobników) i SW3 (34,1% osobników). Jednocześnie, metoda molekularna zaniża częstość występowania infekcji powodowanych pasożytami z rodzaju Plasmodium, co może wynikać z ogólnych problemów występujących przy wykrywaniu infekcji mieszanych (pasożyty z rodzaju Plasmodium rzadko występowały w monorodzajowych infekcjach). Wykazano istotnie wyższe zapasożycenie samców, co może być powiązane ze zwiększonymi nakładami energetycznymi samców na początku sezonu lęgowego, kiedy pobierano materiał do badań.Avian blood parasites, mainly haemosporidians causing avian malaria, are broadly used in evolutionary and ecological surveys. They also gain interest because of predictive value for dynamics of naturally occurring, human malarial infections, especially with regard to global climat change. Nowadays, molecular parasites detection techniques (almost entirely based on PCR), replace traditional blood films screening with light microscopy. As the metodology is crutial for every research, sensitivity and accuracy of both methods is still debated. So far, some comparisons between them have been made, but yet no conclusion was achieved. The aim of this study was to assess sensitivity and informative value of PCR based techniques in comparison to the microscopy, based on samples collected from intensively studied sedge warbler (Acrocephalus schoenobaenus) population from Nida valley, SE Poland. Blood samples used in this study were collected between 2004-2008 from 442 birds. Results were compared to previously performed microscopy screening.Applied molecular method proved to be more sensitive compared to microscopy. Molecular analysis revealed presence of 7 mitochondrial lineages of Plasmodium and Haemoproteus genera. The most prevalent species was Haemoproteus belopolskyi (almost 95% of infeceted individuals, lineages: SW1 - 59,2% of individuals, and SW3 - 34,1% of individuals). However, PCR underestimate prevalence of Plasmodium spp., which is most probably the result of general underestimation of mixed infections, as Plasmodium spp. was usually found as co-infecting species with Haemoproteus sp. There was a significant difference in parasites prevalence between sexes, males being more parasitised than females. This might have been caused by incerased investment of males in relation to mating, in the beginning of the breeding season, when the blood samples were collected

MHC class I diversity limits the repertoire of TCRs

Data deposited in this repository support results reported in the article: "Major histocompatibility complex class I diversity limits the repertoire of T cell receptors" [www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1807864116], by Magdalena Migalska, Alvaro Sebastian and Jacek Radwan. Files contain intermediate and final bank vole major histocompatibility complex (MHC) genotyping files for four gene fragments: exon 3 of MHC class I (henceforth referred to as ‘EX3’ or ‘MHC1_EX3’) and exons 2 of MHC class II DQA, DQB and DRB genes (henceforth referred to as ‘DQA’, ‘DQB’, ‘DRB’, respectively). Files were generated with tools from AmpliSAT suite (http://evobiolab.biol.amu.edu.pl/amplisat/index.php), including published web server AmpliSAS (Sebastian et al. 2016, DOI: 10.1111/1755-0998.12453). Intermediate genotyping files are designated with R1-R4 abbreviations, corresponding to PCR replicates numbers

sedge_warbler_genotyping_results

sedge_warbler_genotyping_result

Testing genotyping strategies for ultra-deep sequencing of a co-amplifying gene family : MHC class I in a passerine bird

Characterization of highly duplicated genes, such as genes of the major histocompatibility complex (MHC), where multiple loci often co-amplify, has until recently been hindered by insufficient read depths per amplicon. Here, we used ultra-deep Illumina sequencing to resolve genotypes at exon 3 of MHC class I genes in the sedge warbler (Acrocephalus schoenobaenus). We sequenced 24 individuals in two replicates and used this data, as well as a simulated data set, to test the effect of amplicon coverage (range: 500-20 000 reads per amplicon) on the repeatability of genotyping using four different genotyping approaches. A third replicate employed unique barcoding to assess the extent of tag jumping, that is swapping of individual tag identifiers, which may confound genotyping. The reliability of MHC genotyping increased with coverage and approached or exceeded 90% within-method repeatability of allele calling at coverages of >5000 reads per amplicon. We found generally high agreement between genotyping methods, especially at high coverages. High reliability of the tested genotyping approaches was further supported by our analysis of the simulated data set, although the genotyping approach relying primarily on replication of variants in independent amplicons proved sensitive to repeatable errors. According to the most repeatable genotyping method, the number of co-amplifying variants per individual ranged from 19 to 42. Tag jumping was detectable, but at such low frequencies that it did not affect the reliability of genotyping. We thus demonstrate that gene families with many co-amplifying genes can be reliably genotyped using HTS, provided that there is sufficient per amplicon coverage