Ocorrência, diversidade e efeitos evolutivos do endossimbionte Wolbachia (ANAPLASMATACEAE) em espécies neotropicais de Drosophila do subgrupo willistoni

Wolbachia é uma α-proteobactérias da família Anaplasmataceae que vive em simbiose no interior de células de invertebrados, a maioria deles espécies de insetos. Em espécies de Drosophila, Wolbachia pode causar dois fenótipos de parasitismo reprodutivo, incompatibilidade citoplamsmática e a morte do macho, além de outros fenótipos que afetam o fitness do hospedeiro. São estratégias usadas pelo endossimbionte para aumentar sua frequência na população da espécie hospedeira as quais podem ter consequências evolutivas para a mitocôndria, que com ela é co-herdada e para o fluxo gênico. O subgrupo willistoni, pertencente ao subgênero Sophophora, é um conjunto de espécies crípticas, neotropicais e filogeneticamente relacionadas. Este subgrupo é formado pelas espécies Drosophila willistoni, Drosophila paulistorum, Drosophila equinoxialis, Drosophila tropicalis, Drosophila insularis e D. pavlovskiana. As relações evolutivas entre estas espécies são bem resolvidas em filogenias moleculares usando genes nucleares, porém as reconstruções com marcadores mitocondriais mostram incongruências que refletem uma diferente história evolutiva do genoma mitocondrial. Screenings usando principalmente linhagens de laboratório encontraram Wolbachia em D. willistoni, D. tropicalis e D. paulistorum. Em D. willistoni e D. tropicalis foi encontrada uma variante de Wolbachia denominada wWil, enquanto que na superespécie D. paulistorum, foram encontradas diferentes linhagens de Wolbachia em diferentes semiespécies do complexo. Contudo, pouco se sabe sobre a ocorrência, diversidade e efeitos evolutivos em populações naturais. Este estudo tem como objetivo contribuir para o conhecimento da relação de Wolbachia com espécies do subgrupo da Drosophila willistoni. Varreduras foram realizadas com PCR diagnóstica e Dot-blot tanto em amostras de populações naturais quanto em linhagens de laboratório Os resultados iniciais usando somente PCR mostraram 55% da amostra de D. willistoni, coletada no bioma Mata Atlântica no sul do Brasil, infectada por Wolbachia. Também foi constatado que o endossimbionte estava associado a diferentes haplótipos mitocondriais o que sugere infecção por transmissão horizontal. Não foi encontrada evidência que Wolbachia diminuiu a diversidade mitocondrial nesta espécie. Já nas amostras diagnosticadas com PCR e Dot-blot, todas as linhagens de D. willistoni, D. paulistorum, D. equinoxialis, mostraram sinal de infecção no Dot-blot, porém a maioria delas falhou na amplificação do gene wsp (Wolbachia Surface Protein). Isto sugere diferentes níveis de infecção, tanto intraespecíficos quanto interespecíficos. Desta situação, a técnica de Dot-blot é mais adequada para a detecção de Wolbachia do que a PCR padrão. Em D. willistoni, a infecção wWil foi detectada tanto em amostras do sul quanto do norte do Brasil, mostrando uma infecção de proporções continentais. Em D. tropicalis foi caracterizada a infecção wAu, de D. simulans. Pela primeira vez foi encontrada D. equinoxialis abrigando Wolbachia, sendo que a variante detectada é relacionada a wMel de D. melanogaster. Uma linhagem de laboratório de D. paulistorum Amazônica também mostrou estar infectada por uma variante wMel. Com isso, há evidências de transmissão horizontal de variantes de Wolbachia entre espécies de Drosophila do velho mundo e neotropicais O sequenciamento de região 5’ do gene COI (Citocromo Oxidase Subunidade I), mostrou um complexo padrão de variação no mtDNA no subgrupo willistoni. Foi encontrado um haplótipo compartilhado entre D. willistoni e D. insularis, o que constitui evidência de introgressão. Associação com Wolbachia pode ter levado a diminuição da diversidade haplotípica em D. equinoxialis. Devido à complexa evolução mitocondrial, as distâncias genéticas de COI não separam corretamente as espécies. O gene nuclear kl-3 é sugerido como um DNA Barcoding para a identificação molecular destas espécies.Wolbachia is an α-proteobacterium from the Anaplasmataceae family, and lives in symbiosis inside invertebrate cells, mostly from insect species. In Drosophila species, Wolbachia may cause two reproductive parasitism phenotypes: cytoplasmic incompatibility and male killing, besides some other phenotypes that can affect the host fitness. These phenotypes are strategies employed by the endosymbiont in order to increase its own frequency in the host population, which can cause evolutionary consequences for the mitochondria, since the bacterium is co-inherited with it, and for the gene flow. The willistoni subgroup, belonging to the Sophophora subgenus, is a group of cryptic Neotropical species, which are all phylogenetically related. This subgroup is formed by the species Drosophila willistoni, Drosophila paulistorum, Drosophila equinoxialis, Drosophila tropicalis, Drosophila insularis and D. pavlovskiana. The evolutionary relationships between these species are well resolved in molecular phylogenies when using nuclear genes. On the other hand, reconstructions using mitochondrial markers show incongruences that reflect a different evolutionary history of the mitochondrial genome. Screenings mainly using laboratory lines found Wolbachia infection in D. willistoni, D. tropicalis and D. paulistorum. In D. willistoni and D. tropicalis it was found a Wolbachia variant called wWil, while in the superspecies D. paulistorum were found different Wolbachia lines according to each semispecies from the complex. However, little is known about the occurrence, diversity and evolutionary effects of Wolbachia in natural populations of Drosophila This study aims to contribute to the knowledge regarding the relationships of this endosymbiont with species from the Drosophila willistoni subgroup. Screenings were performed with diagnostic PCR and Dot-blot either in samples from natural populations and also from laboratory lines. Initial results using PCR only showed that 55% of the D. willistoni sample, collected in the Atlantic Forest biome in southern Brazil, was infected with Wolbachia. It was also found that the endosymbiont was associated to different mitochondrial haplotypes, suggesting an infection by horizontal transmission. We did not find any evidence suggesting that Wolbachia decreased the mitochondrial diversity in this species. In the samples diagnosed with PCR and Dot-blot, all lines of D. willistoni, D. paulistorum and D. equinoxialis showed sign of infection in the Dot-blot, however, most of them failed in the wsp (Wolbachia Surface Protein) gene amplification. This suggests different levels of infection, either intra and interspecific. Therefore, we assume that the Dot-blot technique is more suitable for Wolbachia detection than standard PCR. In D. willistoni, the wWil infection was detected either in samples from the South and the North of Brazil, showing an infection with continental proportions. In D. tropicalis it was characterized the wAu infection, originally from D. simulans. For the first time it was found D. equinoxialis to be hosting Wolbachia, and the variant found is related to wMel from D. melanogaster A laboratory line of D. paulistorum Amazonian also showed to be infected with a wMel variant, so there is evidence of horizontal transmission of Wolbachia variants between Old World and Neotropic Drosophila species. Sequencing of the 5’ region from the COI (Citocromo Oxidase Subunidade I) gene showed a complex pattern of variation in the mtDNA from the willistoni subgroup. It was found a haplotype shared between D. willistoni and D. insularis, which constitutes evidence for introgression. Association with Wolbachia may have led a decrease in the haplotype diversity in D. equinoxialis. Due to a complex mitochondrial evolution, the COI genetic distances do not correctly separate the species. The nuclear gene kl-3 is suggested as a DNA barcoding to the molecular identification of these species

Caracterização do comportamento sexual, do som de corte e de um fragmento do gene period (per) de populações de Zaprionus indianus (Gupta) (Diptera: Drosophilidae)

Este trabalho apresenta a descrição do comportamento sexual e do som de corte do macho de populações geográficas da América do Sul da mosca africana Zaprionus indianus, juntamente com a caracterização de um fragmento do gene period (per) de Z. indianus e Z. sepsoides, relacionado, em Drosophila melanogaster, com o controle dos ciclos de som de corte. As seqüências destas espécies são comparadas com as de outras da subfamília Drosophilinae e utilizadas em reconstruções filogenéticas. Também é avaliado o polimorfismo populacional deste marcador nas populações de Z. indianus. O comportamento de corte de Z. indianus é mais simples do que o de espécies do gênero Drosophila, sendo a média de latência de corte de 1 min e 33 s, com mínima de 13 s e máxima de 6 min e 51 s, enquanto que a latência de cópula ficou com média de 2 min e 16 s, com mínima de 18 s e máxima de 6 min e 56 s, sendo que não houve diferença estatística entre os valores obtidos nas diferentes populações. O som de corte é formado por uma seqüência de pulsos monocíclicos, com freqüência fundamental intrapulso variando de 193,8 Hz a 269,17 Hz. Dois padrões de intervalo interpulso foram identificados e denominados como pré-cópula e "montado". O primeiro que precede a cópula (pré-cópula), apresentou um IPI com média de 0,2343 ms ± 0,0799 e maiores amplitudes, enquanto o segundo, geralmente mais longo, foi emitido quando o macho já está copulando com a fêmea ("montado"), com média de 0,3657 ms ± 0,1299 e amplitudes menores. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas nas médias de IPIs entre as três populações estudadas, entretanto foi detectada diferença estatística nas freqüências intrapulso entre todas as populações. Em relação ao gene per, Z. indianus e Z. sepsoides, não possuem uma repetição do dipeptídio treonina-glicina, característica de algumas espécies de Drosophila, porém Z. indianus apresenta 4 mutações silenciosas nesta região, formando dois haplótipos presente na maioria das populações amostradas. A AMOVA demonstrou uma estruturação geográfica da variância molecular entre os grupos populacionais do Sul, Sudeste e Nordeste. Já a comparação das seqüências de per entre espécies da subfamília Drosophilinae revelou várias sinapomorfias que na análise filogenética recuperam todos os grupos de Drosophila analisados, bem como a monofilia de Zaprionus. Contudo a monofilia dos subgêneros Drosophila e Sophophora não foram recuperadas. Os resultados do comportamento de corte, em especial a velocidade de acasalamento, podem ajudar a explicar a rápida dispersão de Z. indianus no continente sul-americano. As diferenças nas freqüências intrapulso entre as populações podem representar a primeira adaptação comportamental registrada desta espécie na América do Sul. Quanto ao gene per, as sinapomorfias encontradas, reforçam a relação do gênero Zaprionus com as espécies dos grupos immigrans, virilis e repleta, também indicada na reconstrução filogenética usando o método da máxima verossimilhança. Já em relação aos dois haplótipos de per encontrados nas populações colonizadoras de Z. indianus, suas distribuições eqüitativas pode ser resultado da recente e rápida expansão geográfica desta espécie.This paper describes the sexual behavior and courtship songs of the male in South American populations of the Zaprionus indianus African fly, together with the characterization of a fragment of the period gene (per) of Z. indianus and Z. sepsoides, which is related, in Drosophila melanogaster, with the control of the cycles of the courtship sounds. The sequences of these species are compared with those of the others of the Drosophilinae subfamily and used in phylogenetic reconstructions. The populational polymorphism of this marker of the Z. indianus populations is also evaluated. The courting behavior of Z. indianus is simpler than that of species of the genus Drosophila, with a latency of courtship of 1 minute 33 seconds - a minimum of 13 seconds and maximum of 6 minutes 51 seconds; The latency of copulation has an average of 2 minutes 16 seconds with a minimum of 18 seconds and maximum of 6 minutes 56 seconds. There were no statistically significant differences between the values obtained from the different populations. The courting song is made up of a sequence of monocyclic sounds with an intrapulse frequency varying from 193.8 Hz to 269.17 Hz. Two patterns of inter-pulse intervals were identified and denominated ´´pre-copulation`` and ´´mounted``. The first, which precedes the copulation (pre-copulation) demonstrated an IPI with an average of 0.2343 ms ± 0.0799 and with considerable amplitude while the second - generally longer - was emitted when the male was actually copulating with the female (´´mounted``) and had an average of 0.3657 ms ± 0.1299 but at lower amplitudes. No statistically significant differences were found in the IPI averages in the three populations studied, but such differences were detected in the intra-pulse frequencies in all the populations. In relation to the gene per, Z. indianus and Z. sepsoides do not have the repetition of dipeptide threonine-glycine characteristic of some species of Drosophila, but Z. indianus presents four silent mutations in this region that form two haplotypes that are present in the majority of the populations sampled. The AMOVA analysis demonstrates a geographical structuration of the molecular variance among groups of populations from South, Southeast and Northeast. However, the comparison of the per sequences of the Drosophilinae subfamily revealed various synapomorphies which, in the phylogenetic analysis, recovered all the Drosophila groups that were analyzed as well as the Zaprionus monophyly - that of Drosophila and Sophophora was not recovered. The results of the courting behavior, especially the rapidity of intercourse, could help to explain the rapid dispersion of Z. indianus in the South American continent. The differences in the intrapulse frequencies amongst the populations may represent the first behavioral adaptation registered for this species in South America. As for the per gene, the synapomorphies discovered tend to reinforce the relationship of the genus Zaprionus with the species of the immigrans, virilis and repleta groups, also detected in the phylogenetic reconstruction using the maximum likelihood method. As regards the two per haplotypes found in the Z. indianus colonizing populations, their equitative distribution may be the result of the recent and rapid geographic expansion of this species

Ocorrência, diversidade e efeitos evolutivos do endossimbionte Wolbachia (ANAPLASMATACEAE) em espécies neotropicais de Drosophila do subgrupo willistoni

Wolbachia é uma α-proteobactérias da família Anaplasmataceae que vive em simbiose no interior de células de invertebrados, a maioria deles espécies de insetos. Em espécies de Drosophila, Wolbachia pode causar dois fenótipos de parasitismo reprodutivo, incompatibilidade citoplamsmática e a morte do macho, além de outros fenótipos que afetam o fitness do hospedeiro. São estratégias usadas pelo endossimbionte para aumentar sua frequência na população da espécie hospedeira as quais podem ter consequências evolutivas para a mitocôndria, que com ela é co-herdada e para o fluxo gênico. O subgrupo willistoni, pertencente ao subgênero Sophophora, é um conjunto de espécies crípticas, neotropicais e filogeneticamente relacionadas. Este subgrupo é formado pelas espécies Drosophila willistoni, Drosophila paulistorum, Drosophila equinoxialis, Drosophila tropicalis, Drosophila insularis e D. pavlovskiana. As relações evolutivas entre estas espécies são bem resolvidas em filogenias moleculares usando genes nucleares, porém as reconstruções com marcadores mitocondriais mostram incongruências que refletem uma diferente história evolutiva do genoma mitocondrial. Screenings usando principalmente linhagens de laboratório encontraram Wolbachia em D. willistoni, D. tropicalis e D. paulistorum. Em D. willistoni e D. tropicalis foi encontrada uma variante de Wolbachia denominada wWil, enquanto que na superespécie D. paulistorum, foram encontradas diferentes linhagens de Wolbachia em diferentes semiespécies do complexo. Contudo, pouco se sabe sobre a ocorrência, diversidade e efeitos evolutivos em populações naturais. Este estudo tem como objetivo contribuir para o conhecimento da relação de Wolbachia com espécies do subgrupo da Drosophila willistoni. Varreduras foram realizadas com PCR diagnóstica e Dot-blot tanto em amostras de populações naturais quanto em linhagens de laboratório Os resultados iniciais usando somente PCR mostraram 55% da amostra de D. willistoni, coletada no bioma Mata Atlântica no sul do Brasil, infectada por Wolbachia. Também foi constatado que o endossimbionte estava associado a diferentes haplótipos mitocondriais o que sugere infecção por transmissão horizontal. Não foi encontrada evidência que Wolbachia diminuiu a diversidade mitocondrial nesta espécie. Já nas amostras diagnosticadas com PCR e Dot-blot, todas as linhagens de D. willistoni, D. paulistorum, D. equinoxialis, mostraram sinal de infecção no Dot-blot, porém a maioria delas falhou na amplificação do gene wsp (Wolbachia Surface Protein). Isto sugere diferentes níveis de infecção, tanto intraespecíficos quanto interespecíficos. Desta situação, a técnica de Dot-blot é mais adequada para a detecção de Wolbachia do que a PCR padrão. Em D. willistoni, a infecção wWil foi detectada tanto em amostras do sul quanto do norte do Brasil, mostrando uma infecção de proporções continentais. Em D. tropicalis foi caracterizada a infecção wAu, de D. simulans. Pela primeira vez foi encontrada D. equinoxialis abrigando Wolbachia, sendo que a variante detectada é relacionada a wMel de D. melanogaster. Uma linhagem de laboratório de D. paulistorum Amazônica também mostrou estar infectada por uma variante wMel. Com isso, há evidências de transmissão horizontal de variantes de Wolbachia entre espécies de Drosophila do velho mundo e neotropicais O sequenciamento de região 5’ do gene COI (Citocromo Oxidase Subunidade I), mostrou um complexo padrão de variação no mtDNA no subgrupo willistoni. Foi encontrado um haplótipo compartilhado entre D. willistoni e D. insularis, o que constitui evidência de introgressão. Associação com Wolbachia pode ter levado a diminuição da diversidade haplotípica em D. equinoxialis. Devido à complexa evolução mitocondrial, as distâncias genéticas de COI não separam corretamente as espécies. O gene nuclear kl-3 é sugerido como um DNA Barcoding para a identificação molecular destas espécies.Wolbachia is an α-proteobacterium from the Anaplasmataceae family, and lives in symbiosis inside invertebrate cells, mostly from insect species. In Drosophila species, Wolbachia may cause two reproductive parasitism phenotypes: cytoplasmic incompatibility and male killing, besides some other phenotypes that can affect the host fitness. These phenotypes are strategies employed by the endosymbiont in order to increase its own frequency in the host population, which can cause evolutionary consequences for the mitochondria, since the bacterium is co-inherited with it, and for the gene flow. The willistoni subgroup, belonging to the Sophophora subgenus, is a group of cryptic Neotropical species, which are all phylogenetically related. This subgroup is formed by the species Drosophila willistoni, Drosophila paulistorum, Drosophila equinoxialis, Drosophila tropicalis, Drosophila insularis and D. pavlovskiana. The evolutionary relationships between these species are well resolved in molecular phylogenies when using nuclear genes. On the other hand, reconstructions using mitochondrial markers show incongruences that reflect a different evolutionary history of the mitochondrial genome. Screenings mainly using laboratory lines found Wolbachia infection in D. willistoni, D. tropicalis and D. paulistorum. In D. willistoni and D. tropicalis it was found a Wolbachia variant called wWil, while in the superspecies D. paulistorum were found different Wolbachia lines according to each semispecies from the complex. However, little is known about the occurrence, diversity and evolutionary effects of Wolbachia in natural populations of Drosophila This study aims to contribute to the knowledge regarding the relationships of this endosymbiont with species from the Drosophila willistoni subgroup. Screenings were performed with diagnostic PCR and Dot-blot either in samples from natural populations and also from laboratory lines. Initial results using PCR only showed that 55% of the D. willistoni sample, collected in the Atlantic Forest biome in southern Brazil, was infected with Wolbachia. It was also found that the endosymbiont was associated to different mitochondrial haplotypes, suggesting an infection by horizontal transmission. We did not find any evidence suggesting that Wolbachia decreased the mitochondrial diversity in this species. In the samples diagnosed with PCR and Dot-blot, all lines of D. willistoni, D. paulistorum and D. equinoxialis showed sign of infection in the Dot-blot, however, most of them failed in the wsp (Wolbachia Surface Protein) gene amplification. This suggests different levels of infection, either intra and interspecific. Therefore, we assume that the Dot-blot technique is more suitable for Wolbachia detection than standard PCR. In D. willistoni, the wWil infection was detected either in samples from the South and the North of Brazil, showing an infection with continental proportions. In D. tropicalis it was characterized the wAu infection, originally from D. simulans. For the first time it was found D. equinoxialis to be hosting Wolbachia, and the variant found is related to wMel from D. melanogaster A laboratory line of D. paulistorum Amazonian also showed to be infected with a wMel variant, so there is evidence of horizontal transmission of Wolbachia variants between Old World and Neotropic Drosophila species. Sequencing of the 5’ region from the COI (Citocromo Oxidase Subunidade I) gene showed a complex pattern of variation in the mtDNA from the willistoni subgroup. It was found a haplotype shared between D. willistoni and D. insularis, which constitutes evidence for introgression. Association with Wolbachia may have led a decrease in the haplotype diversity in D. equinoxialis. Due to a complex mitochondrial evolution, the COI genetic distances do not correctly separate the species. The nuclear gene kl-3 is suggested as a DNA barcoding to the molecular identification of these species

Combining morphology and molecular data to improve Drosophila paulistorum (Diptera, Drosophilidae) taxonomic status

The willistoni species subgroup has been the subject of several studies since the latter half of the past century and is considered a Neotropical model for evolutionary studies, given the many levels of reproductive isolation and different evolutionary stages occurring within them. Here we present for the first time a phylogenetic reconstruction combining morphological characters and molecular data obtained from 8 gene fragments (COI, COII, Cytb, Adh, Ddc, Hb, kl-3 and per). Some relationships were incongruent when comparing morphological and molecular data. Also, morphological data presented some unresolved polytomies, which could reflect the very recent divergence of the subgroup. The total evidence phylogenetic reconstruction presented well-supported relationships and summarized the results of all analyses. The diversification of the willistoni subgroup began about 7.3 Ma with the split of D. insularis while D.paulistorum complex has a much more recent diversification history, which began about 2.1 Ma and apparently has not completed the speciation process, since the average time to sister species separation is one million years, and some entities of the D. paulistorum complex diverge between 0.3 and 1 Ma. Based on the obtained data, we propose the categorization of the former “semispecies” of D. paulistorum as a subspecies and describe the subspecies D. paulistorum amazonian, D. paulistorum andeanbrazilian, D. paulistorum centroamerican, D. paulistorum interior, D. paulistorum orinocan and D. paulistorum transitional

Combining morphology and molecular data to improve <i>Drosophila paulistorum</i> (Diptera, Drosophilidae) taxonomic status

<p>The <i>willistoni</i> species subgroup has been the subject of several studies since the latter half of the past century and is considered a Neotropical model for evolutionary studies, given the many levels of reproductive isolation and different evolutionary stages occurring within them. Here we present for the first time a phylogenetic reconstruction combining morphological characters and molecular data obtained from 8 gene fragments (C<i>OI, COII, Cytb, Adh, Ddc, Hb, kl-3</i> and <i>per</i>). Some relationships were incongruent when comparing morphological and molecular data. Also, morphological data presented some unresolved polytomies, which could reflect the very recent divergence of the subgroup. The total evidence phylogenetic reconstruction presented well-supported relationships and summarized the results of all analyses. The diversification of the <i>willistoni</i> subgroup began about 7.3 Ma with the split of <i>D. insularis</i> while <i>D.paulistorum</i> complex has a much more recent diversification history, which began about 2.1 Ma and apparently has not completed the speciation process, since the average time to sister species separation is one million years, and some entities of the <i>D. paulistorum</i> complex diverge between 0.3 and 1 Ma. Based on the obtained data, we propose the categorization of the former “semispecies” of <i>D. paulistorum</i> as a subspecies and describe the subspecies <i>D. paulistorum amazonian, D. paulistorum andeanbrazilian, D. paulistorum centroamerican, D. paulistorum interior, D. paulistorum orinocan</i> and <i>D. paulistorum transitional.</i></p