Evolution, gene regulation and functional analysis of BMP2 in fish

Bone morphogenetic proteins (BMPs) are multifunctional growth factors belonging to the transforming growth factor β (TGFβ) superfamily with a central role in bone formation and mineralization. BMP2, a founding member of this family, has demonstrated remarkable osteogenic properties and is clinically used to promote bone repair and fracture healing. Lack of basic data on factors regulating BMP2 expression and activity have hampered a better understanding of its role in bone formation and bone-related diseases. The objective of this work was to collect new functional data and determine spatiotemporal expression patterns in a fish system aiming towards a better understanding of BMP2 function and regulation. Transcriptional and post-transcriptional regulation of gilthead seabream BMP2 gene was inferred from luciferase reporter systems. Several bone- and cartilage-related transcription factors (e.g. RUNX3, MEF2c, SOX9 and ETS1) were found to regulate BMP2 transcription, while microRNA 20a was shown to affect stability of the BMP2 transcript and thus the mineralogenic capacity of fish bone-derived host cells. The regulation of BMP2 activity through an interaction with the matrix Gla protein (MGP) was investigated in vitro using BMP responsive elements (BRE) coupled to luciferase reporter gene. Although we demonstrated the functionality of the experimental system in a fish cell line and the activation of BMP signaling pathway by seabream BMP2, no conclusive evidence could be collected on a possible interaction beween MGP and BMP2. The evolutionary relationship among the members of BMP2/4/16 subfamily was inferred from taxonomic and phylogenetic analyses. BMP16 diverged prior to BMP2 and BMP4 and should be the result of an ancient genome duplication that occurred early in vertebrate evolution. Structural and functional data suggested that all three proteins are effectors of the BMP signaling pathway, but expression data revealed different spatiotemporal patterns in teleost fish suggesting distinct mechanisms of regulation. In this work, through the collection of novel data, we provide additional insight into the regulation, the structure and the phylogenetic relationship of BMP2 and its closely related family members.O sistema esquelético confere suporte e proteção ao organismo, permite o armazenamento de minerais e desempenha funções hematopoiéticas. Um dos seus principais componentes é o osso, um tecido conectivo especializado e constituído por uma matriz extracelular extensamente mineralizada. O processo de mineralização envolve mecanismos extremamente complexos que estão sujeitos a um rigoroso controlo a nível molecular, no qual estão envolvidas várias proteínas responsáveis pela diferenciação celular e pela síntese de matriz extracelular. Dentro deste conjunto de proteínas, destacam-se alguns fatores de crescimento essenciais ao mecanismo de mineralização tecidular, como é o caso das proteínas morfogenéticas do osso (BMPs). As BMPs pertencem à superfamília de fatores de crescimento de transformação β (TGFβ) e estão envolvidas em vários processos durante a embriogénese, organogénese, proliferação e diferenciação celular e mecanismos de formação óssea. Atualmente estão descritos e caracterizados mais de vinte membros pertencentes a esta família, que foram divididos em várias subfamílias, de acordo com a semelhança da estrutura primária das suas proteínas. A subfamília BMP2/4/16 à qual pertence a BMP2 foi uma das primeiras a ser identificada e caracterizada. A BMP2 é uma das proteínas que possui uma maior capacidade osteogénica e é, desde há muito tempo, considerada um potencial agente terapêutico para o tratamento de doenças relacionadas com o osso, sendo mesmo utilizada em alguns casos clínicos de fraturas ósseas. O conhecimento dos processos de formação óssea, bem como os mecanismos de regulação da BMP2, são por isso de extrema importância para uma melhor compreensão dos processos subjacentes ao desenvolvimento e progressão de algumas doenças ósseas. Assim, a BMP2 tem sido alvo de vários estudos, quer a nível de conhecimento da sua função, quer a nível de mecanismos de ação e processamento. Sabe-se que a BMP2 é uma proteína secretada para a matriz extracelular onde, através de um mecanismo de sinalização molecular, é responsável pela regulação de vários processos. O mecanismo de sinalização inicia-se quando dímeros de BMP2 se ligam aos respetivos recetores, presentes na superfície da célula, ativando assim uma cascata de sinalização molecular. Através de diferentes intermediários intracelulares, envolvidos na cascata de sinalização, a BMP2 é responsável pela regulação transcricional de vários genes-alvo. No entanto, e apesar dos vários estudos que foram feitos nesta área, o conhecimento existente acerca deste assunto é ainda bastante escasso. Neste sentido, o objetivo principal deste trabalho foi a recolha de novos dados funcionais e estruturais, que permitam uma melhor compreensão da função da BMP2. Para tal, e de modo a complementar o conhecimento existente, utilizámos o peixe como modelo alternativo aos sistemas de mamíferos. O peixe é atualmente reconhecido como um modelo válido para estudos do esqueleto de vertebrados para o qual existem já várias ferramentas que permitem análises in silico, in vitro e in vivo. Este trabalho envolveu o estudo da regulação do gene da BMP2 de dourada, tanto a nível transcricional como a nível pós-transcricional. Numa primeira fase, foram identificados potenciais reguladores transcricionais da BMP2 de dourada, através da análise in silico da região reguladora do gene. Dentro dos potenciais reguladores transcricionais, foram identificados vários fatores de transcrição com funções descritas ao nível do osso e da cartilagem, nomeadamente o RUNX3, SOX9, MEF2C e ETS1, que foram posteriormente testados a nível funcional através de ensaios repórter de luciferase. Em paralelo, no decorrer da caracterização de reguladores pós-transcricionais da BMP2, através da análise da região 3’ não traduzida (3’UTR) do seu mRNA, foi possível identificar um local de ligação para o miR-20a, conservado ao longo da evolução. A fim de melhor compreender os mecanismos de ação da BMP2, neste trabalho investigámos também possíveis parceiros desta proteína. A caraterização da interação entre a BMP2 e a proteína Gla da matriz (MGP), um conhecido inibidor da calcificação, foi avaliada através do uso de um sistema de elementos de resposta às BMPs, acoplado a um gene repórter, a luciferase. Embora tenhamos demonstrado a funcionalidade do sistema através da ativação do mecanismo de sinalização celular pela BMP2 de dourada, não foram obtidos dados conclusivos no que diz respeito à interação entre a BMP2 e a MGP. Finalmente, abordamos o aspecto evolutivo dos membros da subfamília BMP2/4/16 através da análise da sua distribuição taxonómica entre vários organismos vertebrados, bem como as relações filogenéticas existentes entre os vários membros desta subfamília. Foi demonstrado que a BMP16 divergiu antes da BMP2 e BMP4 na linhagem dos vertebrados e foi, provavelmente, o resultado de uma duplicação genómica que terá ocorrido ancestralmente. Dados estruturais sugerem uma conservação funcional das três proteínas, facto que foi confirmado pela capacidade de ativação dos mecanismos de sinalização das BMPs. No entanto, e apesar da conservação ao nível da região codante dos genes das BMP2, BMP4 e BMP16, as regiões não traduzidas são substancialmente diferentes, apontando para uma regulação diferencial dos três genes, como é aliás sugerido pelos distintos padrões de expressão observados para a BMP2, BMP4 e BMP16, tanto em linguado como em peixe zebra. Ao longo deste trabalho foram recolhidos novos dados que permitem uma melhor compreensão da função e regulação da BMP2. Foram igualmente obtidas informações relevantes acerca da filogenia molecular dos membros da subfamília das BMP2/4/16 que contribuíram para uma melhor compreensão e interpretação da complexa história evolutiva desta subfamília. No seu conjunto, os resultados deste trabalho contribuem para uma validação do uso dos peixes como um modelo alternativo na investigação de mecanismos moleculares envolvidos no processo de mineralização tecidular.Universidade do Algarve, Departamento de Ciências Biomédica

Effect of Dietary Incorporation of Yellow Mealworm as a Partial Fishmeal Replacer on Growth, Metabolism, and Intestinal Histomorphology in Juvenile Meagre (Argyrosomus regius)

Publisher Copyright: © 2023 Margarida Saavedra et al. This study was supported by the National Project DIVERSIAQUA II (MAR-02.01.01 FEAMP-0175) and by the project ATLAZUL–Impulsionar a Aliança Litoral Atlântica para o Crescimento Azul (0755_ATLAZUL_6_E) from Spain-Portugal Interreg (POCTEP).Efforts have been made to find alternatives to fish meal (FM), as the sustainability of aquaculture depends on it. Insect meal (IM) is a potential candidate to partially replace FM, being more sustainable and economically viable. In this experimental trial, three diets were tested with different yellow mealworm incorporation: a control diet with no IM, a diet with an inclusion of 10% IM (Ins10), and a diet with an incorporation of 20% IM (Ins20). The diets were tested on 10.5 g meagre for 47 days. The results showed that an IM inclusion higher than 10% affected both growth (2.6 vs. 2.2) and FCR (1.5 vs. 1.9) of meagre juveniles. However, this reduction in growth did not result from lower protein retention or changes in muscle fibre area or density. Little differences were observed in the activity of pancreatic and intestinal enzymes except for aminopeptidase total activity which was higher in the control and Ins10 compared to Ins20 (3847 vs. 3540 mU/mg protein), suggesting no limitations in protein synthesis. Also, the alkaline phosphatase intestinal maturation index was higher in the control group compared to the IM groups (437 vs. 296). On the contrary, several differences were also found in the proteolytic activity in the hepatic and muscle tissues of meagre juveniles fed the Ins10 diet. The inclusion of IM had no impact on intestine histomorphology but changes were detected in the enterocytes of fish from control and Ins10 which showed hypervacuolization and nucleus misplacement compared to the Ins20 treatment. Nevertheless, a higher percentage of Vibrionaceae was recorded for meagre fed on the Ins20 diet. Since no signs of inflammation were observed in the distal intestine, this suggests IM incorporation could have had an important impact on intestinal health due to its antimicrobial properties. This is supported by an increase in the haematocrit in the treatments where IM was added (20 to 25%). In conclusion, incorporations of IM at percentages up to 10% do not seem to have a negative impact on meagre performance at this age but can enhance the fish immune system and protection against intestinal inflammation.publishersversionpublishe

MAMMALS IN PORTUGAL : A data set of terrestrial, volant, and marine mammal occurrences in P ortugal

Mammals are threatened worldwide, with 26% of all species being includedin the IUCN threatened categories. This overall pattern is primarily associatedwith habitat loss or degradation, and human persecution for terrestrial mam-mals, and pollution, open net fishing, climate change, and prey depletion formarine mammals. Mammals play a key role in maintaining ecosystems func-tionality and resilience, and therefore information on their distribution is cru-cial to delineate and support conservation actions. MAMMALS INPORTUGAL is a publicly available data set compiling unpublishedgeoreferenced occurrence records of 92 terrestrial, volant, and marine mam-mals in mainland Portugal and archipelagos of the Azores and Madeira thatincludes 105,026 data entries between 1873 and 2021 (72% of the data occur-ring in 2000 and 2021). The methods used to collect the data were: live obser-vations/captures (43%), sign surveys (35%), camera trapping (16%),bioacoustics surveys (4%) and radiotracking, and inquiries that represent lessthan 1% of the records. The data set includes 13 types of records: (1) burrowsjsoil moundsjtunnel, (2) capture, (3) colony, (4) dead animaljhairjskullsjjaws, (5) genetic confirmation, (6) inquiries, (7) observation of live animal (8),observation in shelters, (9) photo trappingjvideo, (10) predators dietjpelletsjpine cones/nuts, (11) scatjtrackjditch, (12) telemetry and (13) vocalizationjecholocation. The spatial uncertainty of most records ranges between 0 and100 m (76%). Rodentia (n=31,573) has the highest number of records followedby Chiroptera (n=18,857), Carnivora (n=18,594), Lagomorpha (n=17,496),Cetartiodactyla (n=11,568) and Eulipotyphla (n=7008). The data setincludes records of species classified by the IUCN as threatened(e.g.,Oryctolagus cuniculus[n=12,159],Monachus monachus[n=1,512],andLynx pardinus[n=197]). We believe that this data set may stimulate thepublication of other European countries data sets that would certainly contrib-ute to ecology and conservation-related research, and therefore assisting onthe development of more accurate and tailored conservation managementstrategies for each species. There are no copyright restrictions; please cite thisdata paper when the data are used in publications.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Mammals in Portugal: a data set of terrestrial, volant, and marine mammal occurrences in Portugal

Mammals are threatened worldwide, with ~26% of all species being included in the IUCN threatened categories. This overall pattern is primarily associated with habitat loss or degradation, and human persecution for terrestrial mammals, and pollution, open net fishing, climate change, and prey depletion for marine mammals. Mammals play a key role in maintaining ecosystems functionality and resilience, and therefore information on their distribution is crucial to delineate and support conservation actions. MAMMALS IN PORTUGAL is a publicly available data set compiling unpublished georeferenced occurrence records of 92 terrestrial, volant, and marine mammals in mainland Portugal and archipelagos of the Azores and Madeira that includes 105,026 data entries between 1873 and 2021 (72% of the data occurring in 2000 and 2021). The methods used to collect the data were: live observations/captures (43%), sign surveys (35%), camera trapping (16%), bioacoustics surveys (4%) and radiotracking, and inquiries that represent less than 1% of the records. The data set includes 13 types of records: (1) burrows | soil mounds | tunnel, (2) capture, (3) colony, (4) dead animal | hair | skulls | jaws, (5) genetic confirmation, (6) inquiries, (7) observation of live animal (8), observation in shelters, (9) photo trapping | video, (10) predators diet | pellets | pine cones/nuts, (11) scat | track | ditch, (12) telemetry and (13) vocalization | echolocation. The spatial uncertainty of most records ranges between 0 and 100 m (76%). Rodentia (n =31,573) has the highest number of records followed by Chiroptera (n = 18,857), Carnivora (n = 18,594), Lagomorpha (n = 17,496), Cetartiodactyla (n = 11,568) and Eulipotyphla (n = 7008). The data set includes records of species classified by the IUCN as threatened (e.g., Oryctolagus cuniculus [n = 12,159], Monachus monachus [n = 1,512], and Lynx pardinus [n = 197]). We believe that this data set may stimulate the publication of other European countries data sets that would certainly contribute to ecology and conservation-related research, and therefore assisting on the development of more accurate and tailored conservation management strategies for each species. There are no copyright restrictions; please cite this data paper when the data are used in publications

In vivo Nitric Oxide Concentration Dynamics Induced by Glutamatergic Neuronal Activation in Rat Brains and its Role in Neurovascular Coupling

Tese de doutoramento em Ciências e Tecnologias da Saúde (Bioquímia), apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbr

Acrylamide levels in chips: are potato chips the only “bad guys”?

Objectives: Acrylamide is a carcinogenic substance produced by a chemical reaction between reducing sugars and asparagine, when exposed to high temperatures (over 1200C), which often occurs in roasting, baking or deep frying. Some food products such as potato chips, coffee and toasts have been extensively studied and have acrylamide benchmark levels tightly regulated by the European Regulation (EU) 2017/2158. However, novel food products such as sweet potato chips and other vegetable tubers-based foods have been steadily arising in the food markets as healthier alternatives to regular potato chips and French fries. However, there is little to no information about the acrylamide levels in these novel foods. The aim of this pilot study was to compare the acrylamide levels in fried potatoes with other snack alternatives for human consumption. Despite being a small-scale pilot study, this work could help us to be more aware of the level of acrylamide exposure on these foods and to bring awareness to the need to reevaluate the current regulations for this contaminant. Materials and Methods: Several brands and chips were randomly selected and were analyzed with the help of the Food Hygiene, Safety, and Health class of 2022/2023 of the Faculty of Veterinary Medicine in Lusófona University. All samples were store-bought randomly and comprised several types of chips, including regular potato, sweet potato, vegetables, tubers, lentils, and corn. For the quantitative determination of acrylamide, we used a recently developed spectrophotometric method that involved its reduction to ammonia. Results: When compared to regular potato chips, all the other samples presented significantly similar or significantly higher levels of acrylamide (p<0.001). These levels were particularly higher in veggie puffs and in baby foods. Conclusions: Although these are preliminary results, with a low sample number, our results strongly suggest that the novel foods arising as alternatives to potato chips should also be regulated concerning their acrylamide levels. Particularly since they are advertised as healthy foods and/or baby foods. Overall, this pilot study highlights the importance of creating acrylamide formation control strategies, as well as reference benchmark levels for newly introduced ready-to-eat products in the market. Special attention should be given to food for children. Their lower body weight when compared to adults, their metabolism, and the likely higher consumption of these kinds of foods make children at higher risk for acrylamide exposure and more vulnerable to the effects of this contaminant. Thus, broader studies on this topic are warranted in the future.   Keywords: Acrylamide, carcinogenic, heat treatment, asparagin

Aplicação de salicórnia como alternativa ao sal em produtos cárneos curados: Potencial para a segurança alimentar e para a saúde humana

Objectivos: A excessiva ingestão de sal tem vindo a aumentar consideravelmente nas últimas décadas e encontra-se muito associada ao consumo de produtos processados, entre os quais os cárneos. O presente trabalho, fruto da colaboração entre a Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Lusófona com a Jerónimo Martins e a Sicasal, tem como objetivo determinar o potencial da utilização de salicórnia (“sal verde”) como alternativa ao sal em enchidos. Para tal foram avaliadas bioatividades com potencial para a saúde humana e para o shelflife do produto, contra bactérias patogénicas alimentares e uma metaloproteínase de matriz, a MMP-9, comumente associada a estados de inflamação e a patologias tumorais. Materiais e métodos: A salicórnia utilizada foi na sua forma desidratada como produto comercial. Foi realizada uma extração polar e apolar sendo o seu material recolhido e congelado a -80ºC para futuras análises. As atividades anti-bacterianas foram avaliadas contra Escherichia coli, através do método de diluições sucessivas. O potencial inibitório da MMP-9 foi determinado através de um ensaio fluorométrico e também por zimografia de gelatina. Resultados: Os extratos polares e apolares de salicórnia reduziram o crescimento de E. coli, de uma forma dose-dependente. Ambos os extratos também apresentaram atividades inibidoras de MMP-9, demonstrando assim um grande potencial de exercer função anti-inflamatória bem como anti-tumoral. Conclusões: Embora esta seja uma alternativa ao sal, a salicórnia ainda não foi testada em enchidos em Portugal. Os nossos resultados demostram o potencial benéfico da sua aplicação em produtos alimentares, quer a nível de segurança e higiene alimentar, bem como para a saúde humana.   Keywords: Salicórnia; Alternativa ao sal; Segurança alimentar e saúde humana; Escherichia coli; MMP-9

Potential health benefits of cardoon in cheese production

Objectives: Cardoon thistle (Cynara cardunculus) is frequently used as a coagulant in Portuguese cheese production in a water-based extract called thistle-rennet, particularly in the region of Serpa in Alentejo, Serra da Estrela and Azeitão. The goal of this study was to test the potential bioactivity of cardoon and thistle-rennet, specifically against foodborne pathogens, MMP-9 (matrix metalloprotease 9) and endoprotease, which has for long been recognized as playing important roles in inflammation and cancer. Materials and Methods: The Cardoon was collected from a cheese factory in Serpa as dry plant and flowers, and the thistle-rennet was prepared according to the manufacturer’s instructions. The thistle-rennet was used for the bioactivity tests using Escherichia coli for the antibacterial activities and a fluorometric assay and reverse and a standard gelatin zymography for the MMP-9 inhibitory effects. Results: The thistle-rennet was found to have a dose dependent effect on reducing E. coli growth as well as presented MMP-9 inhibitory activity, suggesting a strong potential antibacterial and anti-inflammatory activity. Conclusion: Our results open promising perspectives for traditional cheese industries in Portugal and overall food safety and health. Considering cardoon is frequently used in the cheese industry and is completely GRAS (generally accepted as safe), this could be of great importance not only as an added value to the cheese industry but also as a functional food for human health purposes.   Keywords: Cardoon; antibacterial activity; anti-inflammatory activity; Portuguese DOP cheese; Thistle-rennet.   Financing: This work wassupported by a project (Cardoon) funded by FMV-Ulusófona. &nbsp

Compostos bioativos para a saúde e segurança alimentar

Atualmente, o tópico dos compostos bioativos para a segurança alimentar tem sido alvo de grande foco, sobretudo numa época em que a utilização de desinfetantes químicos e de antibióticos é cada vez mais evitada na área agro-alimentar, dentro de um contexto One Health. Deste modo, o estudo de compostos moleculares com capacidade de inibir a presença de bactérias ou fungos patogénicos ou de promover uma população microbiana saudável é um campo de investigação cada vez com mais importância. Se por um lado os compostos bioativos naturais têm atraído grande atenção devido aos seus efeitos benéficos para a saúde, sobretudo ao nível da prevenção de doenças inflamatórias e oncológicas, por outro, as suas atividades antimicrobianas podem ser muito úteis para segurança alimentar e para a saúde global, como alternativas a desinfetantes e a antibióticos. É nestas áreas que a nossa equipa dos bioativos e da segurança alimentar trabalha. Iremos apresentar alguns trabalhos mais importantes, exemplificativos do tipo de técnicas e áreas em que nos focamos, que envolvem o isolamento e caracterização de proteínas, péptidos e compostos fenólicos bioativos de alimentos, utilizando diversas metodologias moleculares e celulares, modelos in vitro e in vivo de atividades anti-inflamatórias, anti-tumorais e antibacterianas. Desde a descoberta de uma proteína anti-tumoral no tremoço, ao desenvolvimento de um protocolo de fermentação de soro de queijo para produzir péptidos anti-inflamatórios e antibacterianos, até ao desenvolvimento de alternativas ao sal em carnes, promotores de uma microbiota saudável, à identificação de alimentos para combater a osteoartrite em equinos e as mastites em bovinos, vamos fazer uma viagem pelos vários compostos bioativos que já descobrimos e com os quais temos desenvolvido projetos em colaboração com várias equipas da FMV-ULHT e várias instituições extramuros.   Palavras-chave: Compostos bioativos, Alimentos, Anti-inflamatórios, Anti-tumorais, Antibacterianos, One Health.   Financiamento: Projetos FMV-ULHT Estratégicos 2021 – OSTEOHEALTH e OP-FEED&FOOD; Projeto FMV-ULHT Exploratório 2021 - Lupine4Weaning. Projeto FCT PTDC/BAA-AGR/28608/2017. &nbsp

Elemental Composition and Implications on Brown Rice Flour Biofortified with Selenium

This research was funded by PDR2020, grant number 101-030671. Publisher Copyright: © 2023 by the authors.Rice (Oryza sativa L.) is one of the most economically and socially important cereals in the world. Several strategies such as biofortification have been developed in a way eco-friendly and sustainable to enhance crop productivity. This study implemented an agronomic itinerary in Ariete and Ceres rice varieties in experimental fields using the foliar application of selenium (Se) to increase rice nutritional value. At strategic phases of the plant’s development (at the end of booting, anthesis, and at the milky grain stage), they were sprayed with sodium selenate (Na2SeO4) and sodium selenite (Na2SeO3). In the first foliar application plants were sprayed with 500 g Se·ha−1 and in the remaining two foliar applications were sprayed with 300 g Se·ha−1. The effects of Se in the level of micro and macronutrients in brown grains, the localization of Se in these grains, and the subsequent quality parameters such as colorimetric characteristics and total protein were considered. After grain harvesting, the application of selenite showed the highest enrichment in all grain with levels reaching 17.06 µg g−1 Se and 14.28 µg g−1 Se in Ariete and Ceres varieties, respectively. In the Ceres and Ariete varieties, biofortification significantly affected the K and P contents. Regarding Ca, a clear trend prevailed suggesting that Se antagonizes the uptake of it, while for the remaining elements in general (except Mn) no significant differences were noted. Protein content increased with selenite treatment in the Ariete variety but not in Ceres. Therefore, it was possible to conclude, without compromising quality, that there was an increase in the nutritional content of Se in brown rice grain.publishersversionpublishe