Molekulare Dosimetrie Platin-induzierter DNA-Läsionen

In der internistischen Onkologie gehören die Substanzen Cis- und Carboplatin seit Jahren zu den wirksamsten Zytostatika bei der Behandlung solider Tumoren. Die molekularen Mechanismen der therapeutischen Wirkungen und Nebenwirkungen dieser Verbindungen, sowie die Ursache(n) eines Therapieversagens sind multifaktoriell und in ihrer Komplexität bisher weitgehend unverstanden geblieben. Die Aufkärung dieser pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Prozesse ist die Grundlage jeder chemoprotektiven bzw. resensitivierenden Intervention und damit des Fernziels einer individualisierten Chemotherapie. Die Einwirkung von Cis- bzw. Carboplatin auf die zelluläre DNA ist interindividuell und Zelltyp-spezifisch sehr unterschiedlich. Unter anderem kontrollieren die Nierenfunktion, der Wirkstoffimport- und -export über die Zellmembran, sowie zytoplasmatische Detoxifizierungsprozesse das Ausmaß der initialen Pt-DNA Adduktbildung. Ähnlich heterogen ist die Leistungsfähigkeit der zellulären DNA-Reparatursysteme und schließlich die Toleranz der Zellen gegenüber bestehenden Läsionen. Wie die klinische Bedeutung dieser Faktoren für eine primäre oder erworbene Platin-Resistenz zu bewerten ist, kann bislang nicht beantwortet werden. Im Rahmen klinisch realisierbarer Pt-Dosen ist die Möglichkeit, Tumorzellen zur Auslösung der Apoptose zu provozieren, wahrscheinlich das entscheidende Kriterium für ihre therapeutische Ansprechbarkeit. Bisher ist ungeklärt, welchen Anteil die einzelnen, strukturell verschiedenen Pt-DNA Addukte an diesem zytotoxischen Potential von Cis- und Carboplatin haben. Da Bildung und Elimination dieser Addukte im Zentrum des pharmakologischen Geschehens stehen, ist die Entwicklung einer hinreichend empfindlichen Methode zur quantitativen Bestimmung definierter Platin-DNA-Läsionen auf dem Niveau individueller Zellen, d. h. eine molekulare Dosimetrie, der erfolgversprechenste Weg zur Beantwortung der offenen Fragen. In dieser Arbeit wurden mit dem Ziel einer immunhistochemischen Einzelzell-Analytik monoklonale Antikörper gegen die verschiedenen Pt-DNA Addukte generiert und charakterisiert. Cisplatin-induzierte DNA Addukte sind in einen stereochemischen Kontext eingebunden, der offenbar weit über die koordinativen Bindungen der eigentlichen Läsion hinausreicht. Es konnte in diser Arbeit gezeigt werden, daß die Nachahmung dieser Raumordnung mit platinierten Oligonukleotiden nicht möglich ist. Daher führt der "klassische" Weg zur Generierung von spezifischen monoklonalen Antikörpern, d. h. die Immunisierung mit einem strukturell eindeutigen Antigen, nicht zum gewünschten Ziel. Aus diesem Grund wurde hier ein ganz neues Verfahren entwickelt: Die Immunaktivität der geimpften Tiere wurde mit platinierter DNA als Antigen zunächst gegen ein komplexes Epitopgemisch, d. h. gegen die Summe aller Addukte gerichtet. Anti-(Pt-DNA) positive Hybridome wurden nach der Fusion mit einem immunomagnetischen Separationsverfahren isoliert und kloniert. Zur Charakterisierung ihrer Epitop-Spezifität wurden in einem weiteren Schritt den so generierten MAK auf DNA-Fragmenten vereinzelte Pt-Addukte zur Bindung angeboten. Die vom jeweiligen Antikörper erkannten Epitope wurden dann über ein Festphasen-Adsorptionsverfahren isoliert und die Platin-Addukte mit Hilfe einer 32 P-Postlabelling- assozierten Radiochromatographie strukturell identifiziert. Weit über die Platinanalytik hinaus bietet das in dieser Arbeit erstmals entwickelte "retrospektive" Verfahren Zugang zu Strukturen, die von DNA-reaktiven Proteinen (wie z. B. Komponenten des DNA-Reparatursystems, von Faktoren der Genregulation oder von Strukturelementen der Chromatinarchitektur) im nativen Kontext erkannt und gebunden werden. Mit Hilfe dieser MAK wurde dann ein Immunfluoreszenz-Nachweisverfahren entwickelt, mit dem es möglich ist, die einzelnen Pt-DNA Addukte in den Kernen von Normal- oder Tumorzellen zu quantifizieren. Die Methode bedarf im Prinzip nur weniger Einzelzellen, so daß bereits erfolgreiche Pilot-Untersuchungen an Biopsien von Magentumorpatienten unter Cisplatin-Chemotherapie durchgeführt werden konnten. Bezogen auf den einzelnen Zellkern liegt die Nachweisempfindlichkeit für die einzelnen Pt-Addukte im Sub-Atomol Bereich (< 10 - 18 Mol) und erlaubt daher auch Messungen, die im zeitlichen Abstand von Wochen nach der Applikation vorgenommen werden. Cisplatin-Unempfindlichkeit von Tumoren kann vielfältige zellbiologische Ursachen haben, die in Zellkulturmodellen mit Paaren von sensitiven bzw. resistenten Zellen herausgetrennt aus der Komplexität eines Organismus analysiert werden können. In dieser Arbeit wurden humane Melanom- bzw. Ovarialkarzinomzellen untersucht, die sich in der Expression des ABC-Membrantransporters cMOAT unterschieden, der Cisplatin-Glutathionkomplexe aus der Zelle exportiert. Es konnte gezeigt werden, daß sich der Pt-Adduktgehalt in der genomischen DNA der Zellen umgekehrt proportional zur Expression und damit zur Aktivität der Membranpumpe verhielt. In den verschiedenen Zellen resultiert Äquitoxizität für Expositionskonzentrationen, welche gleiche Adduktspiegel induzieren. Auch die Platin-assoziertenellzyklusveränderungen zeigten sich als direkte Konsequenz der Pt-DNA Läsionen. Durch Transfektion mit cMOAT-Konstrukten oder anti-cMOAT-Ribozymen konnte die Cisplatin-Exportkapazität der Zellen, die Adduktbildung und damit die Toxizität verändert werden. Da der Nukleotid Exzisions Reparatur (NER) Weg als wichtigster Mechanismus in der Prozessierung von Pt-DNA Läsionen angesehen wird, wurde in dieser Arbeit ferner der Beitrag der "Schadens-Erkennungsproteine" XPA und XPC in entsprechenden murinen Knockout-Modellen untersucht. Verglichen mit den Wildtyp-Mäusen und XPC -- -Mäusen zeigten die XPA-Knockout Mäuse eine extreme Empfindlichkeit gegen Cisplatin. Durch die Messungen von in vivo Reparatur Kinetiken wurde zum ersten Mal demonstriert, daß die Hypersensitivität mit einer nahezu kompletten Inkompetenz der NER-defizienten Mäuse einhergeht, spezifische Pt-DNA Addukte wie Pt-GG Intrastrang Läsionen aus verschiedenen Zelltypen zu entfernen. DNA-Platinierungsprodukte werden durch XPA offensichtlich bereits auf der Stufe der frühen, intermediär auftretenden monovalenten Addukte prozessiert, so daß der funktionelle Ausfall zu einer exzessiven Bildung der bivalenten Intrastrang Addukte führt. Der erstaunlich gering Addukt-Gehalt in Lymphozyten, der in dieser Arbeit sowohl im Mausmodell wie auch in Patientenproben nachgewiesen wurde, beruht nicht auf der Fähigkeit dieser Zellen, solche frühen Eliminationen besonders effektiv zu realisieren: Obwohl der Addukt-Gehalt der XPA -- -Lymphozyten erwartungsgemäß höher lag als der bei NER-kompetenten Tieren, erreichten die Maxima nie das Ausmaß, das beispielsweise in Zellen von Niere oder Leber gefunden wurde. Deshalb muß ein anderer, noch unbekannter Mechanismus für die geringe Belastung der hämatopoetischen Zellen vermutet werden. In einer Pilotstudie wurden Magenkarzinom-Patienten Cisplatin-Therapie-begleitend auf die Bildung und Elimination spezifischer Pt- DNA Addukte untersucht. In peripheren Lymphozyten zeigte sich, daß der Pt-GG Gehalt über einen Zeitraum von 48 h nach Applikation kontinuierlich zunahm. Die Biopsien von Normal- und Tumorgeweben waren vor allem durch Zelltyp-spezifische Addukt-Belastung gekennzeichnet. Dieser Befund unterstreicht nachdrücklich die Notwendigkeit der Einzellanalytik. Schlußfolgerungen bezüglich der interindividuellen Unterschiede und der Aussagekraft der Messungen für den Therapieerfolg können aufgrund der ausstehenden Reihenuntersuchungen und Verlaufskontrollen bisher noch nicht formuliert werden. Diese Analysen sollen mittelfristig zur Klärung der Frage beitragen, welche Bedeutung Bildung und Elimination bzw. Persistenz spezifischer Pt-DNA-Addukte für den Erfolg oder das Versagen einer Tumortherapie mit Platin-Verbindungen haben und inwieweit an Lymphozyten erhobene Befunde repräsentativ auch für das Geschehen in anderen Zelltypen und besonders im Tumor sind. Außerdem wird es möglich sein, Cisplatin-synergistisch wirkende Substanzen wie z. B. Fludarabin, 5-Fluoruracil oder die Inhibitoren des EGF-Rezeptors bezüglich ihres Einflußes auf die Pt-DNA Addukte besser zu verstehen. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß mit den in dieser Arbeit entwickelten Werkzeugen erstmals die genauen Wirkmechanismen der Platin-Zytostatika analytisch sind und damit molekulare Resistenzparameter in experimentellen Systemen und in klinischen Proben definiert werden können

Adduct-specific monoclonal antibodies for the measurement of cisplatin-induced DNA lesions in individual cell nuclei

The anticancer drug cisplatin executes its cytotoxic activity via formation of intra- and interstrand crosslinks in DNA. The relative contribution of structurally defined cisplatin adducts to induce apoptosis and the cellular processing of these lesions is still poorly understood mostly due to the lack of sensitive analytical tools for in vivo studies. Here we describe a new method to establish and characterize monoclonal antibodies (Mab) for structurally defined DNA adducts. The two major reaction products of cisplatin, the guanine–guanine (Pt-[GG]) and adenine–guanine (Pt-[AG]) intrastrand crosslinks are recognized by Mab R-C18 and R-B3, respectively. Both antibodies were employed in an immuno-cytological assay allowing the quantification of drug-induced lesions in individual cell nuclei at clinically relevant doses. Analyzing various tissues of cisplatin-treated C57Bl/6 mice the accumulation of Pt-(GG) was highest in kidney tubular cells compared with 30, 50 and 90% lower levels in kidney stroma, liver and peripheral blood cells, respectively. Adduct kinetics revealed that wild type mouse cells remove up to 80% of the crosslinks in contrast to their complete persistence in nucleotide excision repair-deficient (XPC(−/−)) mice. The aptitude of the immunoassay for human molecular dosimetry studies was demonstrated by measuring adduct levels in tumor biopsies from patients treated with cisplatin

Norvaline is accumulated after a down-shift of oxygen in Escherichia coli W3110

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Norvaline is an unusual non-proteinogenic branched-chain amino acid which has been of interest especially during the early enzymological studies on regulatory mutants of the branched-chain amino acid pathway in <it>Serratia marcescens</it>. Only recently norvaline and other modified amino acids of the branched-chain amino acid synthesis pathway got attention again when they were found to be incorporated in minor amounts in heterologous proteins with a high leucine or methionine content. Earlier experiments have convincingly shown that norvaline and norleucine are formed from pyruvate being an alternative substrate of α-isopropylmalate synthase, however so far norvaline accumulation was not shown to occur in non-recombinant strains of <it>E. coli</it>.</p> <p>Results</p> <p>Here we show that oxygen limitation causes norvaline accumulation in <it>E. coli </it>K-12 W3110 during grow in glucose-based mineral salt medium. Norvaline accumulates immediately after a shift to oxygen limitation at high glucose concentration. On the contrary free norvaline is not accumulated in <it>E. coli </it>W3110 in aerobic cultures. The analysis of medium components, supported by transcriptomic studies proposes a purely metabolic overflow mechanism from pyruvate into the branched chain amino acid synthesis pathway, which is further supported by the significant accumulation of pyruvate after the oxygen downshift. The results indicate overflow metabolism from pyruvate as necessary and sufficient, but deregulation of the branched chain amino acid pathway may be an additional modulating parameter.</p> <p>Conclusion</p> <p>Norvaline synthesis has been so far mainly related to an imbalance of the synthesis of the branched chain amino acids under conditions were pyruvate level is high. Here we show that simply a downshift of oxygen is sufficient to cause norvaline accumulation at a high glucose concentration as a consequence of the accumulation of pyruvate and its direct chain elongation over α-ketobutyrate and α-ketovalerate.</p> <p>Although the flux to norvaline is low, millimolar concentrations are accumulated in the cultivation broth, which is far above the level which has been discussed for being relevant for misincorporation of norvaline into recombinant proteins. Therefore we believe that our finding is relevant for recombinant protein production but also may even have implications for the physiology of <it>E. coli </it>under oxygen limitation in general.</p

An integrated Young interferometer based on UV-imprinted polymer waveguides for label-free biosensing applications

We demonstrate a polymer rib waveguide Young interferometer sensor fabricated by UV-imprinting. An inverted rib waveguide structure was utilized in order to simplify the fabrication process. In this configuration grooves are formed on the under cladding layer by UV-imprinting and core material is spin coated on top to fill the grooves. Glucose water solution was used to characterize the sensor response against ambient refractive index changes. The sensing responses correspond linearly with the refractive index change of glucose solutions with a detection limit of about 10-5. To verify the capability of the polymer sensor for biosensing, an immunoassay was performed with c-reactive protein (CRP) and human CRP specific antibody adsorbed on the waveguide surface as a receptor. The CRP solution in PBS (phosphate buffered saline) buffer with a concentration of 2 µg/ml (16 nM) resulted in an obvious response which was over a couple hundred times of the noise level. Based on these values, a detection limit of about 2.4 pg/mm2 was found for the surface sensing of molecular adsorption. With the proposed waveguide configuration, the fabrication of polymer sensors can be ultimately transferred to roll-to-roll mass production to produce low-cost disposable sensors

Primary cilia respond to fluid shear stress and mediate flow-induced calcium deposition in osteoblasts

Bone turnover in vivo is regulated by mechanical forces such as shear stress originating from interstitial oscillatory fluid flow (OFF), and bone cells in vitro respond to mechanical loading. However, the mechanisms by which bone cells sense mechanical forces, resulting in increased mineral deposition, are not well understood. The aim of this study was to investigate the role of the primary cilium in mechanosensing by osteoblasts. MLO-A5 murine osteoblasts were cultured in monolayer and subjected to two different OFF regimens: 5 short (2 h daily) bouts of OFF followed by morphological analysis of primary cilia; or exposure to chloral hydrate to damage or remove primary cilia and 2 short bouts (2 h on consecutive days) of OFF. Primary cilia were shorter and there were fewer cilia per cell after exposure to periods of OFF compared with static controls. Damage or removal of primary cilia inhibited OFF-induced PGE2 release into the medium and mineral deposition, assayed by Alizarin red staining. We conclude that primary cilia are important mediators of OFF-induced mineral deposition, which has relevance for the design of bone tissue engineering strategies and may inform clinical treatments of bone disorders causes by load-deficiency.—Delaine-Smith, R. M., Sittichokechaiwut, A., Reilly, G. C. Primary cilia respond to fluid shear stress and mediate flow-induced calcium deposition in osteoblasts

A phase I dose-escalation study of the immunocytokine EMD 521873 (Selectikine) in patients with advanced solid tumours

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Relevance of collagen piezoelectricity to "Wolff's Law": A critical review

According to “Wolff's Law”, bone is deposited and reinforced at areas of greatest stress. From a clinical perspective, this “law” is supported by the strong association between bone density and physical activity. From a mechanistic standpoint, however, the law presents a challenge to scientists seeking to understand how osteocytes and osteoblasts sense the mechanical load. In the 1960s, collagen piezoelectricity was invoked as a potential mechanism by which osteocytes could detect areas of greater stress but piezoelectricity diminished in importance as more compelling mechanisms, such as streaming potential, were identified. In addition, accumulating evidence for the role of fluid-related shear stress in osteocyte's mechanosensory function has made piezoelectricity seemingly more obsolete in bone physiology. This review critically evaluates the role of collagen piezoelectricity (if any) in Wolff's Law—specifically, the evidence regarding its involvement in strain-generated potentials, existing alternate mechanisms, the present understanding of bone mechanosensation, and whether piezoelectricity serves an influential role within the context of this newly proposed mechanism. In addition to reviewing the literature, this review generates several hypotheses and proposes future research to fully address the relevance of piezoelectricity in bone physiology.National Center for Complementary and Alternative Medicine (U.S.) (grant K23-AT003238

Brief Review of Models of Ectopic Bone Formation

Ectopic bone formation is a unique biologic entity?distinct from other areas of skeletal biology. Animal research models of ectopic bone formation most often employ rodent models and have unique advantages over orthotopic (bone) environments, including a relative lack of bone cytokine stimulation and cell-to-cell interaction with endogenous (host) bone-forming cells. This allows for relatively controlled in vivo experimental bone formation. A wide variety of ectopic locations have been used for experimentation, including subcutaneous, intramuscular, and kidney capsule transplantation. The method, benefits and detractions of each method are summarized in the following review. Briefly, subcutaneous implantation is the simplest method. However, the most pertinent concern is the relative paucity of bone formation in comparison to other models. Intramuscular implantation is also widely used and relatively simple, however intramuscular implants are exposed to skeletal muscle satellite progenitor cells. Thus, distinguishing host from donor osteogenesis becomes challenging without cell-tracking studies. The kidney capsule (perirenal or renal capsule) method is less widely used and more technically challenging. It allows for supraphysiologic blood and nutrient resource, promoting robust bone growth. In summary, ectopic bone models are extremely useful in the evaluation of bone-forming stem cells, new osteoinductive biomaterials, and growth factors; an appropriate choice of model, however, will greatly increase experimental success.Peer Reviewedhttp://deepblue.lib.umich.edu/bitstream/2027.42/98476/1/scd%2E2011%2E0517.pd

Erythropoietin overrides the triggering effect of DNA platination products in a mouse model of Cisplatin-induced neuropathy

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Cisplatin mediates its antineoplastic activity by formation of distinct DNA intrastrand cross links. The clinical efficacy and desirable dose escalations of cisplatin are restricted by the accumulation of DNA lesions in dorsal root ganglion (DRG) cells leading to sensory polyneuropathy (PNP). We investigated in a mouse model by which mechanism recombinant erythropoietin (rhEPO) protects the peripheral nervous system from structural and functional damage caused by cisplatin treatment with special emphasis on DNA damage burden.</p> <p>Results</p> <p>A cumulative dose of 16 mg cisplatin/kg resulted in clear electrophysiological signs of neuropathy, which were significantly attenuated by concomitant erythropoietin (cisplatin 32,48 m/s ± 1,68 m/s; cisplatin + rhEPO 49,66 m/s ± 1,26 m/s; control 55,01 m/s ± 1,88 m/s; p < 0,001). The co-application of rhEPO, however, did not alter the level of unrepaired cisplatin-DNA lesions accumulating in DRG target cells. Micro-morphological analyses of the sciatic nerve from cisplatin-exposed mice showed damaged myelin sheaths and mitochondria. Co-administered rhEPO inhibited myelin sheaths from structural injuries and resulted in an increased number of intact mitochondria.</p> <p>Conclusion</p> <p>The protective effect of recombinant erythropoietin is not mediated by reducing the burden of DNA platination in the target cells, but it is likely to be due to a higher resistance of the target cells to the adverse effect of DNA damage. The increased frequency of intact mitochondria might also contribute to this protective role.</p