Die Bradykinin B1 und B2 Rezeptoren als Modell für die Untersuchung der Regulation G-Protein-gekoppelter Rezeptoren

Die Familie A der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) bildet die größte und vielfältigste aller Transmembranrezeptorfamilien. Ihre Mitglieder spielen eine wesentliche Rolle in fast allen (patho)physiologischen Prozessen. Nach Agonistenbindung aktivieren GPCRs, wie ihr Name andeutet, heterotrimere G-Proteine aber auch G-Protein-unabhängige Signalwege. Die verschiedenen aktiven G-Proteinuntereinheiten (Gα-GTP und βγ) induzieren nach Dissoziation vom Rezeptor entsprechende Signalkaskaden z.B. über Phospholipase A und Cβ. Um eine Fehlregulation zellulärer Prozesse z.B. durch „Überstimulation“ zu verhindern, unterliegen GPCRs strengen Regulationsmechanismen, die ihre Fähigkeit zur Signaltransduktion und ihre Verfügbarkeit an der Zelloberfläche bestimmen. Die Bradykininrezeptoren B1 und B2 (B1R, B2R) gehören zur Familie A der GPCRs, also zu den Rhodopsin-ähnlichen GPCRs, und werden durch die pro-inflammatorischen Peptide desArg9-Bradykinin/desArg10-Kallidin (DABK/DAK) bzw. Bradykinin (BK)/Kallidin aktiviert. Im Gegensatz zum konstitutiv exprimierten B2R, der nach Stimulation schnell desensitisiert und internalisiert wird, erfolgt eine B1R-Expression fast ausschließlich unter pathophysiologischen Bedingungen über Induktion durch Zytokine. Nach Stimulation wird der B1R nicht internalisiert, sondern verbleibt an der Zelloberfläche. Beide Rezeptoren koppeln sowohl an Gαq/11 als auch an Gαi und aktivieren somit weitgehend identische Signalwege [vor allem Phospholipase Cβ (PLCβ) und „mitogen activated protein kinase“ (MAPK)-Kaskaden]. Durch ihre - besonders im Hinblick auf ihre Internalisierungs-eigenschaften - konträre Regulation, stellen die Bradykininrezeptoren ein interessantes Modell zur Untersuchung regulatorischer Mechanismen und deren Einflüsse auf die Signalübertragung von GPCRs dar. Beide Bradykininrezeptoren spielen bei inflammatorischen Prozessen eine Rolle. Sie fördern die Ausschüttung pro-inflammatorischer Zytokine und rekrutieren Immunzellen. Während entzündlicher Ereignisse kommt es zu erhöhter Zytokinfreisetzung z.B. von Interleukin-1β (IL-1β) und dadurch zur de novo Synthese von B1R. Pro-inflammatorische Zytokine wie IL-1β, die zur B1R-Expression führen, induzieren unter anderem aber auch einen Anstieg der Körpertemperatur (Fieber), eine häufige Begleiterscheinung inflammatorischer Vorgänge. Trotz des bekannten Zusammenhangs zwischen Inflammation und erhöhter Temperatur war über den Einfluss eines Temperaturanstiegs auf Membranrezeptoren und ihre Signalvermittlung auf zellulärer Ebene bisher nur sehr wenig bekannt. In dieser Arbeit wurde - unseres Wissens nach - erstmals auf die Temperatur als regulatorische Komponente für GPCR-vermittelte Signalübertragung eingegangen. Am Beispiel der Bradykininrezeptoren wurde gezeigt, dass die Stärke der Signalübertragung von GPCRs signifikant durch eine Temperaturerhöhung von 37°C auf 41°C beeinflusst werden kann. Hierbei war jedoch zwischen einer Temperaturabhängigkeit des Signalwegs selbst und einer rezeptorspezifischen Temperatursensitivität zu unterscheiden. So wurde die Aktivierung von ERK1/2 unter pathophysiologisch erhöhter Temperatur (41°C; normale Körpertemperatur: 37°C) signifikant gesteigert, unabhängig davon ob sie durch B1 oder B2 Rezeptoren stimuliert wurde. Die gesteigerte Aktivität PLCβ-vermittelter Signalkaskaden bei 41°C konnte hingegen auf eine nur für den B1R spezifische Temperaturabhängigkeit zurückgeführt werden. Diese Beobachtung zusammen mit der Tatsache, dass die B1R-Expression unter pathophysiologischen Bedingungen besonders induziert wird, deutet darauf hin, dass der B1R in Kombination mit Fieber eine verstärkte Wirkung im Organismus haben könnte. Ob diese Heilungs-fördernd oder -abträglich wirkt, müsste noch genauer untersucht werden. Neben dem Einfluss der Temperatur wird die Signalübertragung der GPCRs durch die jeweiligen Rezeptorkonformationen und die sich daraus ergebenden Funktionsunterschiede bestimmt. Die Familie A der GPCRs wird durch einige hoch konservierte Strukturmerkmale wie die E/DRY-Sequenz mit R3.50 in der dritten Transmembrandomäne (TM) oder die NPXXY-Sequenz am Ende der siebten TM charakterisiert. Publizierte Ergebnisse deuten darauf hin, dass bovines Rhodopsin durch eine Salzbrücke zwischen R3.50135 (TM3) und E6.30247 (TM6), auch „ionic lock“ genannt, im inaktiven Zustand gehalten wird. Der B2R ist einer der wenigen Peptid-GPCRs, der ein Glutamat an Position 6.30 (E6.30238) trägt, und eignete sich daher zur Untersuchung der Anwesenheit und Funktion eines möglichen „ionic lock“ auch in „nicht-Rhodopsin“-GPCRs. Für alle bisher entsprechend untersuchten GPCRs ist bekannt, dass R3.50 für eine effiziente G-Protein-Aktivierung unabdingbar ist (selbiges wurde in der vorliegenden Arbeit auch für den B2R bestätigt). Die funktionelle Analyse eines „ionic lock“ anhand einer R3.50 Mutation und G-Protein-abhängiger Kaskaden ist deshalb nicht möglich. Die Rolle eines „ionic lock“ im Hinblick auf G-Protein-unabhängige Mechanismen wie die Rezeptorinternalisierung, einem wichtigen Regulationsschritt für die meisten GPCRs, wurde bisher jedoch noch nicht untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass die Rezeptorendozytose durch Mutation von R3.50128 zu Alanin (R3.50128A), im Gegensatz zur G-Protein-Aktivierung, nicht zum Erliegen kommt. Die mutierten Rezeptorkonstrukte wiesen sogar ein konstitutives Internalisierungsverhalten auf. Dies verwies auf unterschiedliche Funktionen dieser Aminosäure bei der G-Protein-vermittelten Signaltransduktion und bei der Rezeptorinternalisierung. Ein Aufbrechen des möglichen „ionic lock“ durch Mutation von E6.30238 zu Alanin oder Arginin resultierte ebenfalls in konstitutiv internalisierenden Rezeptorkonstrukten. Im Gegensatz zur Endozytose zeigten diese Mutanten zwar keine konstitutive Signalübertragung, wurden aber auch durch prinzipiell als Antagonisten klassifizierte Verbindungen effizient aktiviert. Diese Ergebnisse legen einen mehrstufigen Aktivierungsprozess nahe, dessen Stufen sich durch verschiedene Rezeptorkonformationen mit unterschiedlichen Interaktionsmöglichkeiten für die G-Protein-Rekrutierung/Aktivierung oder mit der Internalisierungsmaschinerie [GPCR-Kinasen (GRKs), Arrestine] auszeichnen. Der wechselseitige Austausch der beiden hoch konservierten Aminosäuren R3.50128 und E6.30238 ermöglichte wahrscheinlich die Bildung eines inversen „ionic lock“, wodurch normales B2R-Verhalten wieder hergestellt wurde. Diese Arbeit zeigt somit erstmals, dass ein Aufbrechen eines möglichen „ionic lock“ in einem Peptidrezeptor unterschiedliche Auswirkungen für die Prozesse der G-Protein-Aktivierung und der Rezeptorendozytose haben kann. Dadurch wird die Annahme bestärkt, dass es bei einem GPCR mehrere aktive Konformationen geben kann, die unterschiedliche Affinitäten gegenüber regulatorischen Proteinen (GRKs, Arrestinen) oder Effektoren (G-Proteinen, Arrestinen) aufweisen und dadurch differenziert zelluläre Signale auslösen können. Die Aufklärung der unterschiedlichen Aktivierungsmechanismen von GPCRs in Kombination mit der Herstellung von Verbindungen z.B. sogenannten „small molecule compounds“, die bestimmte Rezeptorkonformationen mit ihren signalspezifischen Eigenschaften stabilisieren können, wäre möglicherweise für die Entwicklung von Agonisten oder Antagonisten, die nur ganz bestimmte Signalwege modulieren und so eine optimierte therapeutische Anwendung erlauben, hilfreich

Fever-like temperature modification differentially affects in vitro signaling of bradykinin B-1 and B-2 receptors

The bradykinin (BK) B-2 and B-1 receptors (B2R, B1R) belong to the rhodopsin-like G protein-coupled receptors (GPCRs) and are involved in (patho)physiological processes such as blood pressure regulation or inflammation. They mediate the effects of the pro-inflammatory peptides bradykinin/kallidin and desArg(9)-BK/desArg(10)-kallidin, respectively. Whereas the B2R is constitutively expressed and gets internalized upon activation, the B1R is especially induced by inflammatory mediators and responds to stimulation with increased surface receptor numbers. Stimulation of both receptors activates phospholipase C beta (PLC beta) and mitogen activated protein kinase (MAPK) signaling. Because inflammatory processes are characterized by heat (fever), we analyzed the effect of increased temperature (41 degrees C vs. 37 degrees C) on B1R and B2R signaling in HEK 293 and IMR 90 cells. Our results show that signaling of both receptors is temperature-sensitive, however to a different extent and with regard to the investigated pathways. Comparing PLCb activity and Ca2+-regulated signals, a temperature-dependent increase was only observed for B1R but not for B2R activation, whereas MAPK activities were doubled at 41 degrees C for both receptors. Taken together, our findings suggest that the observed temperature sensitivity of B1R-induced PLCb activation is B1R-specific. In contrast, the enhanced stimulation of MAPK activity under hyperthermic conditions appears to be a common phenomenon for GPCRs

Flowzytometrische Untersuchung der Apoptose humaner Spermatozoen mit Hilfe des Annexin V-Tests

Zielsetzung : Die Präsentation des Phospholipids Phosphatidylserin (PS) an der äußeren Zellmembran ist ein Prozess der Frühphase der Apoptose in humanen Zellen. Diese Veränderungen können mit dem Annexin V-Test flowzytometrisch nachgewiesen werden. Ziel dieser Studie war es, nach Inkubation von Spermatozoen mit unterschiedlichen Einflussfaktoren die Bindungsraten von Annexin V zu ermitteln und dadurch einen Einfluss auf die Spermienapoptose nachzuweisen. Im speziellen wurde der Einfluss von Fas-Antikörpern, von Antispermien-Autoantikörpern (ASA) und der Akrosomreaktion mit Hilfe des Kalziumionophors A23187 untersucht. Des weiteren wurde untersucht, ob sich Fas-Apoptoserezeptoren an der Membran von Spermatozoen flowzytometrisch nachweisen lassen. Aufbau der Experimente: 1. Die gewaschenen Spermien wurden mit 2 verschiedenen Fas-Antikörper Klonen für 4 Stunden inkubiert, gefolgt von einem weiteren Waschschritt und dem Annexin V-Test. Flowzytometrisch wurde die direkte Bindung von CD95-PE an Fas-Rezeptoren sowie die Annexin V-Bindungsraten nach Inkubation mit den Fas-Klonen ausgewertet. 2. Die Ejakulate wurden nach Swim-up Vorbehandlung für 2 Stunden inkubiert und anschließend mit dem Kalziumionophor A23187 behandelt. Nach einem Waschschritt wurde der Annexin V-Test durchgeführt. Ausgewertet wurden die Gesamtraten der Annexin-V-Bindung, die Anzahl Akrosom-reagierter Zellen nach Ionophor-Einwirkung mit Hilfe des konjugierten Antikörpers gegen die innere Akrosommembran CD46-FITC, und die Bindung von Annexin V an Akrosom-reagierte Zellen. 3. 2 Ejakulate wurden durch einfache Zentrifugation und 2 Ejakulate durch Swim-up Präparation vorbehandelt und die Ansätze mit ASA-enthaltendem Seminalplasma oder ASA-enthaltendem Blutserum für eine Stunde inkubiert. Anschließend wurden die Bindungsraten von ASA an die Spermatozoen mit Hilfe des MAR-Tests ermittelt, nach einem Waschschritt der Annexin V-Test durchgeführt und die flowzytometrischen Annexin V-Bindungsraten mit den MAR-Test Ergebnissen in Verbindung gesetzt. Für alle Testreihen wurde eine flowzytometrische Analyse durchgeführt und für alle Ansätze eine Vitalfärbung mit 7-Amino-Actinomycin D vorgenommen. Avitale Zellen wurden von der Analyse ausgeschlossen. Ergebnisse: 1. Nach Inkubation mit den Fas-Antikörper-Klonen konnte nur ein äußerst geringes Vorkommen von Fas-Rezeptoren ermittelt werden, im Mittel 1,46% der vitalen Zellen. Ein Einfluss auf die Annexin-V-Bindungsrate von vitalen Spermatozoen ließ sich nach der Antikörperinkubation nicht nachweisen. 2. Die Ansätze, welche mit A23187 inkubiert worden waren, zeigten im Mittelwert eine Rate von Annexin-V-gebundenen vitalen Zellen an allen vitalen Zellen von 42,17%, nachdem die entsprechenden Raten der Kontrollproben abgezogen worden waren. Ansätze, die mit dem Kalziumionophor behandelt und gleichzeitig mit CD46-FITC und Phycoerythrin-konjugiertem Annexin V gefärbt worden waren, konnten aufgrund einer unerwarteten Verschiebung der Gesamtpopulation in das avitale Spektrum der flowzytometrischen DotPlot-Auswertung nicht auf eine gleichzeitige Annexin-Bindung akrosom-reagierter Zellen ausgewertet werden. Vitale Spermatozoen mit spontaner Akrosomreaktion ohne Ionophor-Einwirkung konnten analysiert werden und zeigten eine gleichzeitige Annexin V-Bindungsrate von im Mittel 32,12%. 3. Nach ASA-Inkubation ließ sich keinerlei Einfluss auf den Anteil vitaler Spermatozoen mit Annexin-V-Bindung feststellen. Schlussfolgerungen: 1. Nur ein sehr geringer Anteil von Fas-präsentierenden Spermatozoen konnte ermittelt werden. Fas-Antikörper führten bei Spermatozoen nicht zu einer erhöhten Rate von PS-Präsentation als Zeichen der frühen Apoptose. Offensichtlich ist der Fas-Reaktionsweg der Apoptose bei reifen Spermatozoen nicht funktionsfähig. Diese Ergebnisse unterstützten die Theorie, dass auf dem Weg der Keimzellentwicklung der größte Anteil Fas-tragender Zellen eliminiert wird und verbliebene Fas-Rezeptoren auf reifen Spermatozoen nicht funktionelle Residuen darstellen. 2. Die Einwirkung von A23187 erhöht eindeutig den Anteil von Spermatozoen, die PS an ihrer Zellmembran präsentieren. Unklar bleibt, ob diese Veränderungen die Frühphase der Apoptose wiederspiegeln oder ob die erhöhte PS-Präsentation sich alternativ auf die Membranveränderungen der Akrosomreaktion zurückführen läßt. Der erhöhte Anteil vitaler spontan Akrosom-reagierter Spermatozoen mit gleichzeitiger Annexin V-Bindung unterstützt diese Annahme. Letztere Erklärung stellt die Eignung des Annexin V-Tests als spezifischer Test für Apoptose für Spermatozoen in Frage, da es bei diesen haploiden Keimzellen zu nicht-apoptotischen Membranveränderungen mit PS-Expression kommen kann. 3. ASA scheinen keine Rolle für die PS-Expression bei Spermatozoen zu spielen

Die Bradykinin B1 und B2 Rezeptoren als Modell für die Untersuchung der Regulation G-Protein-gekoppelter Rezeptoren

Die Familie A der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) bildet die größte und vielfältigste aller Transmembranrezeptorfamilien. Ihre Mitglieder spielen eine wesentliche Rolle in fast allen (patho)physiologischen Prozessen. Nach Agonistenbindung aktivieren GPCRs, wie ihr Name andeutet, heterotrimere G-Proteine aber auch G-Protein-unabhängige Signalwege. Die verschiedenen aktiven G-Proteinuntereinheiten (Gα-GTP und βγ) induzieren nach Dissoziation vom Rezeptor entsprechende Signalkaskaden z.B. über Phospholipase A und Cβ. Um eine Fehlregulation zellulärer Prozesse z.B. durch „Überstimulation“ zu verhindern, unterliegen GPCRs strengen Regulationsmechanismen, die ihre Fähigkeit zur Signaltransduktion und ihre Verfügbarkeit an der Zelloberfläche bestimmen. Die Bradykininrezeptoren B1 und B2 (B1R, B2R) gehören zur Familie A der GPCRs, also zu den Rhodopsin-ähnlichen GPCRs, und werden durch die pro-inflammatorischen Peptide desArg9-Bradykinin/desArg10-Kallidin (DABK/DAK) bzw. Bradykinin (BK)/Kallidin aktiviert. Im Gegensatz zum konstitutiv exprimierten B2R, der nach Stimulation schnell desensitisiert und internalisiert wird, erfolgt eine B1R-Expression fast ausschließlich unter pathophysiologischen Bedingungen über Induktion durch Zytokine. Nach Stimulation wird der B1R nicht internalisiert, sondern verbleibt an der Zelloberfläche. Beide Rezeptoren koppeln sowohl an Gαq/11 als auch an Gαi und aktivieren somit weitgehend identische Signalwege [vor allem Phospholipase Cβ (PLCβ) und „mitogen activated protein kinase“ (MAPK)-Kaskaden]. Durch ihre - besonders im Hinblick auf ihre Internalisierungs-eigenschaften - konträre Regulation, stellen die Bradykininrezeptoren ein interessantes Modell zur Untersuchung regulatorischer Mechanismen und deren Einflüsse auf die Signalübertragung von GPCRs dar. Beide Bradykininrezeptoren spielen bei inflammatorischen Prozessen eine Rolle. Sie fördern die Ausschüttung pro-inflammatorischer Zytokine und rekrutieren Immunzellen. Während entzündlicher Ereignisse kommt es zu erhöhter Zytokinfreisetzung z.B. von Interleukin-1β (IL-1β) und dadurch zur de novo Synthese von B1R. Pro-inflammatorische Zytokine wie IL-1β, die zur B1R-Expression führen, induzieren unter anderem aber auch einen Anstieg der Körpertemperatur (Fieber), eine häufige Begleiterscheinung inflammatorischer Vorgänge. Trotz des bekannten Zusammenhangs zwischen Inflammation und erhöhter Temperatur war über den Einfluss eines Temperaturanstiegs auf Membranrezeptoren und ihre Signalvermittlung auf zellulärer Ebene bisher nur sehr wenig bekannt. In dieser Arbeit wurde - unseres Wissens nach - erstmals auf die Temperatur als regulatorische Komponente für GPCR-vermittelte Signalübertragung eingegangen. Am Beispiel der Bradykininrezeptoren wurde gezeigt, dass die Stärke der Signalübertragung von GPCRs signifikant durch eine Temperaturerhöhung von 37°C auf 41°C beeinflusst werden kann. Hierbei war jedoch zwischen einer Temperaturabhängigkeit des Signalwegs selbst und einer rezeptorspezifischen Temperatursensitivität zu unterscheiden. So wurde die Aktivierung von ERK1/2 unter pathophysiologisch erhöhter Temperatur (41°C; normale Körpertemperatur: 37°C) signifikant gesteigert, unabhängig davon ob sie durch B1 oder B2 Rezeptoren stimuliert wurde. Die gesteigerte Aktivität PLCβ-vermittelter Signalkaskaden bei 41°C konnte hingegen auf eine nur für den B1R spezifische Temperaturabhängigkeit zurückgeführt werden. Diese Beobachtung zusammen mit der Tatsache, dass die B1R-Expression unter pathophysiologischen Bedingungen besonders induziert wird, deutet darauf hin, dass der B1R in Kombination mit Fieber eine verstärkte Wirkung im Organismus haben könnte. Ob diese Heilungs-fördernd oder -abträglich wirkt, müsste noch genauer untersucht werden. Neben dem Einfluss der Temperatur wird die Signalübertragung der GPCRs durch die jeweiligen Rezeptorkonformationen und die sich daraus ergebenden Funktionsunterschiede bestimmt. Die Familie A der GPCRs wird durch einige hoch konservierte Strukturmerkmale wie die E/DRY-Sequenz mit R3.50 in der dritten Transmembrandomäne (TM) oder die NPXXY-Sequenz am Ende der siebten TM charakterisiert. Publizierte Ergebnisse deuten darauf hin, dass bovines Rhodopsin durch eine Salzbrücke zwischen R3.50135 (TM3) und E6.30247 (TM6), auch „ionic lock“ genannt, im inaktiven Zustand gehalten wird. Der B2R ist einer der wenigen Peptid-GPCRs, der ein Glutamat an Position 6.30 (E6.30238) trägt, und eignete sich daher zur Untersuchung der Anwesenheit und Funktion eines möglichen „ionic lock“ auch in „nicht-Rhodopsin“-GPCRs. Für alle bisher entsprechend untersuchten GPCRs ist bekannt, dass R3.50 für eine effiziente G-Protein-Aktivierung unabdingbar ist (selbiges wurde in der vorliegenden Arbeit auch für den B2R bestätigt). Die funktionelle Analyse eines „ionic lock“ anhand einer R3.50 Mutation und G-Protein-abhängiger Kaskaden ist deshalb nicht möglich. Die Rolle eines „ionic lock“ im Hinblick auf G-Protein-unabhängige Mechanismen wie die Rezeptorinternalisierung, einem wichtigen Regulationsschritt für die meisten GPCRs, wurde bisher jedoch noch nicht untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass die Rezeptorendozytose durch Mutation von R3.50128 zu Alanin (R3.50128A), im Gegensatz zur G-Protein-Aktivierung, nicht zum Erliegen kommt. Die mutierten Rezeptorkonstrukte wiesen sogar ein konstitutives Internalisierungsverhalten auf. Dies verwies auf unterschiedliche Funktionen dieser Aminosäure bei der G-Protein-vermittelten Signaltransduktion und bei der Rezeptorinternalisierung. Ein Aufbrechen des möglichen „ionic lock“ durch Mutation von E6.30238 zu Alanin oder Arginin resultierte ebenfalls in konstitutiv internalisierenden Rezeptorkonstrukten. Im Gegensatz zur Endozytose zeigten diese Mutanten zwar keine konstitutive Signalübertragung, wurden aber auch durch prinzipiell als Antagonisten klassifizierte Verbindungen effizient aktiviert. Diese Ergebnisse legen einen mehrstufigen Aktivierungsprozess nahe, dessen Stufen sich durch verschiedene Rezeptorkonformationen mit unterschiedlichen Interaktionsmöglichkeiten für die G-Protein-Rekrutierung/Aktivierung oder mit der Internalisierungsmaschinerie [GPCR-Kinasen (GRKs), Arrestine] auszeichnen. Der wechselseitige Austausch der beiden hoch konservierten Aminosäuren R3.50128 und E6.30238 ermöglichte wahrscheinlich die Bildung eines inversen „ionic lock“, wodurch normales B2R-Verhalten wieder hergestellt wurde. Diese Arbeit zeigt somit erstmals, dass ein Aufbrechen eines möglichen „ionic lock“ in einem Peptidrezeptor unterschiedliche Auswirkungen für die Prozesse der G-Protein-Aktivierung und der Rezeptorendozytose haben kann. Dadurch wird die Annahme bestärkt, dass es bei einem GPCR mehrere aktive Konformationen geben kann, die unterschiedliche Affinitäten gegenüber regulatorischen Proteinen (GRKs, Arrestinen) oder Effektoren (G-Proteinen, Arrestinen) aufweisen und dadurch differenziert zelluläre Signale auslösen können. Die Aufklärung der unterschiedlichen Aktivierungsmechanismen von GPCRs in Kombination mit der Herstellung von Verbindungen z.B. sogenannten „small molecule compounds“, die bestimmte Rezeptorkonformationen mit ihren signalspezifischen Eigenschaften stabilisieren können, wäre möglicherweise für die Entwicklung von Agonisten oder Antagonisten, die nur ganz bestimmte Signalwege modulieren und so eine optimierte therapeutische Anwendung erlauben, hilfreich

Mount Carmel Area Community Center Strategic Plan

This document outlines various strategic planning areas for the Mount Carmel Area Community Center located in Mount Carmel, Pennsylvania, to consider, including: building repairs, partners, funding, operations, and marketing. The project builds on prior Bucknell University student reports conducted in partnership with the Mount Carmel Area Community Center (MCACC). This project was completed as a course requirement for MORS 400: Management Consulting at Bucknell University in Spring 2023, taught by Prof. Eric Martin. The project was in partnership with the Mount Carmel Area Community Center

Identification of tumor-specific Salmonella Typhimurium promoters and their regulatory logic

Conventional cancer therapies are often limited in effectiveness and exhibit strong side effects. Therefore, alternative therapeutic strategies are demanded. The employment of tumor-colonizing bacteria that exert anticancer effects is such a novel approach that attracts increasing attention. For instance, Salmonella enterica serovar Typhimurium has been used in many animal tumor models as well as in first clinical studies. These bacteria exhibit inherent tumoricidal effects. In addition, they can be used to deliver therapeutic agents. However, bacterial expression has to be restricted to the tumor to prevent toxic substances from harming healthy tissue. Therefore, we screened an S. Typhimurium promoter-trap library to identify promoters that exclusively drive gene expression in the cancerous tissue. Twelve elements could be detected that show reporter gene expression in tumors but not in spleen and liver. In addition, a DNA motif was identified that appears to be necessary for tumor specificity. Now, such tumor-specific promoters can be used to safely express therapeutic proteins by tumor-colonizing S. Typhimurium directly in the neoplasia

Identification of tumor-specific Salmonella Typhimurium promoters and their regulatory logic

Conventional cancer therapies are often limited in effectiveness and exhibit strong side effects. Therefore, alternative therapeutic strategies are demanded. The employment of tumor-colonizing bacteria that exert anticancer effects is such a novel approach that attracts increasing attention. For instance, Salmonella enterica serovar Typhimurium has been used in many animal tumor models as well as in first clinical studies. These bacteria exhibit inherent tumoricidal effects. In addition, they can be used to deliver therapeutic agents. However, bacterial expression has to be restricted to the tumor to prevent toxic substances from harming healthy tissue. Therefore, we screened an S. Typhimurium promoter-trap library to identify promoters that exclusively drive gene expression in the cancerous tissue. Twelve elements could be detected that show reporter gene expression in tumors but not in spleen and liver. In addition, a DNA motif was identified that appears to be necessary for tumor specificity. Now, such tumor-specific promoters can be used to safely express therapeutic proteins by tumor-colonizing S. Typhimurium directly in the neoplasi

Geographic variation in Juniperus drupacea: DNA sequencing and volatile leaf oils: Further evidence of putative Pleistocene genetic isolation between Europe and Asia

Recently, Sobierajska et al. (2016), using nSSR and morphology, showed that Juniperus drupacea exhibited differentiation between Greece and Turkey/ Lebanon, suggestive of Pleistocene genetic isolation. Here, we report that leaf terpenoids and DNA sequence data support their hypothesis by confirming differentiation between Greece and Turkey/ Lebanon/ Israel. The leaf oils of the Turkey/ Lebanon plants contained one unique terpene (trans-verbenol, 0.1-1.4%) that was absent in the Greece plants. The Greece oil contained three terpenes not found in the Lebanon/ Turkey plants: (ar)-curcumene (2.2%), β-alaskene (0.3%) and α-alaskene (0.4%). Four other terpenes were in higher concentration in the Greece oils: camphene (0.4%), δ-3-carene (10.9%), p-mentha-1,5-dien-8-ol, isomer (0.3%) and 4-terpineol (0.3%). Three terpenes were higher in Turkey and Lebanon oils: α-pinene (10.5 - 32.9%), hexadecanoic acid (0.4 - 1.4%) and trans-totarol (0.3 - 1.2%). Only one SNP was found (in nrDNA) that separated Greece from Turkey-Lebanon-Israel. No informative SNPs were found in petN-psbM, trnS-trnG, trnD-trnT or trnL-trnF cp regions

Analysis of Juniperus phoenicea from throughout its range in the Mediterranean using DNA sequence data from nrDNA and petN-psbM: the case for the recognition of J. turbinata Guss

DNA sequences were analyzed from 19 populations of J. phoenicea from throughout its range. The sequence data (nrDNA, petN-psbM) revealed that J. phoenicea is clearly divided into two taxa. These taxa have been recognized as var. (subsp.) phoenicea and var. (subsp.) turbinata by Adams (2011) and Farjon (2005). However, the magnitude of the differences in the DNA regions, along with the differences in pollen shedding times, morphology and prodelphinidin content support the recognition of J. turbinata Guss. No differentiation was found between the typical Mediterranean and Canary Island populations, offering no support for the recognition of J. phoenicea subsp. canariensis (Guyot) RivasMartinez. Juniperus turbinata appears to be widespread from Madeira - Canary Islands to the Sinai with few DNA differences among most populations. However, some populations (Grazalema, Madeira, Sinai, central Italy) had moderate amounts of divergence (3-4 mutations) and warrant additional study

Explicit hypoxia targeting with tumor suppression by creating an “obligate” anaerobic Salmonella Typhimurium strain

Using bacteria as therapeutic agents against solid tumors is emerging as an area of great potential in the treatment of cancer. Obligate and facultative anaerobic bacteria have been shown to infiltrate the hypoxic regions of solid tumors, thereby reducing their growth rate or causing regression. However, a major challenge for bacterial therapy of cancer with facultative anaerobes is avoiding damage to normal tissues. Consequently the virulence of bacteria must be adequately attenuated for therapeutic use. By placing an essential gene under a hypoxia conditioned promoter, Salmonella Typhimurium strain SL7207 was engineered to survive only in anaerobic conditions (strain YB1) without otherwise affecting its functions. In breast tumor bearing nude mice, YB1 grew within the tumor, retarding its growth, while being rapidly eliminated from normal tissues. YB1 provides a safe bacterial vector for anti-tumor therapies without compromising the other functions or tumor fitness of the bacterium as attenuation methods normally do