Microconstriction Arrays for High-Throughput Quantitative Measurements of Cell Mechanical Properties

AbstractWe describe a method for quantifying the mechanical properties of cells in suspension with a microfluidic device consisting of a parallel array of micron-sized constrictions. Using a high-speed charge-coupled device camera, we measure the flow speed, cell deformation, and entry time into the constrictions of several hundred cells per minute during their passage through the device. From the flow speed and the occupation state of the microconstriction array with cells, the driving pressure across each constriction is continuously computed. Cell entry times into microconstrictions decrease with increased driving pressure and decreased cell size according to a power law. From this power-law relationship, the cell elasticity and fluidity can be estimated. When cells are treated with drugs that depolymerize or stabilize the cytoskeleton or the nucleus, elasticity and fluidity data from all treatments collapse onto a master curve. Power-law rheology and collapse onto a master curve are predicted by the theory of soft glassy materials and have been previously shown to describe the mechanical behavior of cells adhering to a substrate. Our finding that this theory also applies to cells in suspension provides the foundation for a quantitative high-throughput measurement of cell mechanical properties with microfluidic devices

Biomembrane-mimicking lipid bilayer system as a mechanically tunable cell substrate

Cell behavior such as cell adhesion, spreading, and contraction critically depends on the elastic properties of the extracellular matrix. It is not known, however, how cells respond to viscoelastic or plastic material properties that more closely resemble the mechanical environment that cells encounter in the body. In this report, we employ viscoelastic and plastic biomembrane-mimicking cell substrates. The compliance of the substrates can be tuned by increasing the number of polymer-tethered bilayers. This leaves the density and conformation of adhesive ligands on the top bilayer unaltered. We then observe the response of fibroblasts to these property changes. For comparison, we also study the cells on soft polyacrylamide and hard glass surfaces. Cell morphology, motility, cell stiffness, contractile forces and adhesive contact size all decrease on more compliant matrices but are less sensitive to changes in matrix dissipative properties. These data suggest that cells are able to feel and respond predominantly to the effective matrix compliance, which arises as a combination of substrate and adhesive ligand mechanical properties

Zellmigration und mechanosensitive Signalübertragung auf 2-dimensionalen biomembran-ähnlichen Doppellipidschichtstapeln und in beengten 3-dimensionalen Mikrostrukturen

Cell mechanics, e.g. cell mechanical properties, force generation and migration are crucial for human development, cell function and physiology. Cell mechanics can be dramatically altered in or even contribute to diseases like cancer. Cell behavior, such as cell adhesion, spreading, migration and contraction, critically depends on the elastic properties of the cell's environment, a process termed mechanosensing. It is not known, however, how cells respond to viscoelastic or plastic material properties, which more closely resemble the mechanical environment that cells encounter in the body. In this thesis, therefore, viscoelastic and plastic biomembrane-mimicking polymer-tethered lipid bilayer stacks are employed as cell substrates to study cell mechanosensing. The compliance of the substrates is tuned by increasing the number of polymer-tethered bilayers. This leaves the density and conformation of adhesive ligands on the top bilayer unaltered. Consequently, the response of fibroblasts to changes in compliance is observed exclusively. As a comparison to the bilayer stacks, cell behavior on soft polyacrylamide and hard glass surfaces is studied. Cell morphology, motility, stiffness, contractile forces and adhesion contact size all decrease on more compliant matrices but are less sensitive to changes in matrix dissipative properties. The data in this thesis suggest that cells are able to feel and respond predominantly to the effective matrix compliance, which arises as a combination of substrate and adhesive ligand mechanical properties. One of the most important cell properties, which is crucially influenced by mechanosensing is cell migration. Cell migration plays a major role in cancer metastasis and other physiological processes, during which cells migrate through the 3-dimensional (3D) extracellular matrix of the connective tissue and must eventually, overcome the steric hindrance posed by pores that are smaller than the cells. It is currently assumed that low cell stiffness promotes cell migration through confined spaces, while the contribution of other factors such as adhesion and traction forces is less well understood but may be equally important. Thus, in this thesis, in addition to 2D migration on flat substrates, more physiological 3D migration under confinement is studied using soft lithographically fabricated devices consisting of 15 channel segments with 20 µm length, 3.7 µm height, and a decreasing width from 11.2 to 1.7 µm. Channel segments are separated by 20 x 20 µm chambers to simulate a more physiological environment and to allow cells to spread between channel crossings. To study 3D migration in a soft (550 Pa) environment, self-assembled collagen networks with an average pore size of 3 µm are used. The ability of 4 different cancer cell lines to migrate through these 3D matrices is measured, and the results are correlated with the following cell properties: 2D migration velocity and persistence, contractility, adhesiveness, cell stiffness, and nuclear volume. Beyond that, cell adhesion is altered by coating the channel walls with different amounts of adhesion proteins, and cell stiffness is increased by overexpression of the nuclear envelope protein lamin A, which enhances the nuclear lamina. Although all cell lines are able to migrate through the smallest 1.7 µm channels, large differences in the migration velocity become evident. Cell migration is found to be impeded in cells with larger nuclei, lower adhesiveness, and to a lesser degree also in cells with a lower contractility and higher stiffness. Taken together, the data in this thesis demonstrates that the ability to overcome the steric hindrance of the matrix cannot be attributed to a single cell property, but instead arises from a combination of adhesiveness, nuclear volume, contractility and cell stiffness. These results, therefore, highlight that a multiparameter analysis is essential to understand and predict the ability of cells to invade or migrate in a confined environment. Finally, the in vitro systems and physical methods developed in this thesis are used to approach biomedical questions and study the influence of chemical signals on cell migration. Therefore, 2D as well as 3D migration, in the context of either drug treatment, gene mutations or the chronic immune disease endometriosis, is analyzed. Taken together, the migration studies clearly reveal the impact of several signaling pathways on cell migration. Thus, these pathways could be targeted as treatment for migration related diseases.Zellmechanik spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklungsbiologie, für die Zellfunktion und Physiologie. Zur Zellmechanik gehören die mechanischen Zelleigenschaften, sowie die zelluläre Kraftgeneration und Migration. Die Zellmechanik kann bei Erkrankungen, wie Krebs, stark verändert sein und darüber hinaus sogar zur Krankheitsentwicklung beitragen. Das Zellverhalten, wie z.B. Adhäsion, Ausbreitung, Migration und Kontraktion, wird stark von den elastischen Eigenschaften des Zellsubstrates beeinflusst. Dieser Prozess wird Mechanotransduktion bzw. Mechanosensing genannt. Wie Zellen auf viskoelastische und plastische Materialeigenschaften reagieren, die mehr dem entsprechen, was Zellen im lebenden Organismus wahrnehmen, ist jedoch noch nicht bekannt In dieser Arbeit werden deshalb viskoelastische und plastische Biomembran-imitierende Polymer-angebundene Lipidbilayer-Stapel als Zellsubstrat zur Untersuchung von Mechanotransduktion genutzt. Die Nachgiebigkeit dieser Substrate kann durch Veränderung der Anzahl an gestapelten Bilayern variiert werden. Dabei bleiben die Dichte und Konfirmation der Adhäsionsliganden auf dem obersten Bilayer unverändert. Somit wird ausschließlich die Reaktion der Fibroblasten auf die Veränderung der Nachgiebigkeit der Substrate betrachtet. Als Vergleich zu den Bilayersubstraten wird zusätzlich das Zellverhalten auf weichen Polyacrylamidgelen und harten Glasoberflächen betrachtet. Es zeigt sich, dass Zellmorphologie, Motilität, Steifigkeit, Kraftgeneration und Adhäsionskomplexgröße auf nachgiebigeren Matrizen verringert sind, wobei Änderungen der plastischen Nachgiebigkeit einen geringeren Einfluss haben. Eine wichtige Zelleigenschaft, die durch Mechanotransduktion beeinflusst wird, ist die Zellmigration. Diese spielt eine entscheidende Rolle bei der Metastasenbildung sowie in physiologischen Vorgängen, bei denen Zellen durch die 3-dimensionale extrazelluläre Matrix des Bindegewebes migrieren und dabei die sterische Behinderung von Poren, die kleiner als sie selbst sind, überwinden müssen. Derzeit wird angenommen, dass eine niedrige Zellsteifigkeit die Migration in beengten Umgebungen vereinfacht. Andere Eigenschaften wie Adhäsion und Traktionskräfte sind weniger gut verstanden, könnten aber ähnlich wichtig sein. Deshalb wird in dieser Arbeit neben der Migration auf 2D-Substraten auch die mehr physiologische 3D-Migration in beengten Räumen untersucht. Dafür werden softlithographisch hergestellte Substrate, die aus 15 aufeinanderfolgenden Kanalsegmenten mit je einer Länge von 20 µm, einer Höhe von 3.7 µm und abnehmenden Breite von 11.2 µm bis 1.7 µm bestehen, genutzt. Die Kanäle sind durch 20 x 20 µm Kammern getrennt, um eine physiologische Umgebung zu simulieren, die es der Zelle erlauben, sich zwischen den Kanaldurchgängen auszubreiten. Um Zellmigration in einer weichen (550Pa), Umgebung zu untersuchen werden Collagen-Netzwerke mit einer Porengröße von 3 µm benutzt. Die Migrationsfähigkeit von vier verschiedenen Krebszelllinien wird mit diesen 3D Matrizen untersucht und die Ergebnisse mit den folgenden Zelleigenschaften korreliert: 2D Migrationsgeschwindigkeit und -persistenz, Kontraktilität, Adhäsivität, Zellsteifigkeit und Kernvolumen. Darüber hinaus wird die Adhäsivität der Kanalsubstrate verändert, indem diese mit verschiedenen Konzentrationen von Adhäsionsproteinen beschichtet werden, außerdem wird die Zellsteifigkeit durch LaminA-Überexpression erhöht. Obwohl es allen Zelltypen möglich ist, auch durch die kleinsten 1.7 µm großen Kanäle zu migrieren, treten große Unterschiede in der Migrationsgeschwindigkeit auf. Es zeigt sich, dass Zellmigration durch größere Kerne, verringerte Adhäsivität und, zu geringerem Anteil, auch durch Kontraktilität und Steifigkeit behindert wird. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die Fähigkeit von Zellen, sterische Behinderungen zu überwinden, nicht einer einzelnen Zelleigenschaft zugeschrieben werden kann, sondern vielmehr durch ein Zusammenspiel von Adhäsion, Zellkernvolumen, Kontraktilität und Zellsteifigkeit bestimmt wird. Daher betonen diese Ergebnisse, dass eine Multiparameteranalyse nötig ist, um den Vorgang der Zellmigration oder Invasion in beengten Räumen zu verstehen oder vorhersagen zu können. Im letzten Teil werden die in vitro Systeme und physikalischen Methoden, die für diese Arbeit entwickelt wurden, benutzt um biomedizinische Fragestellungen zu beantworten und den Einfluss von chemischen Signalen auf die Zellmigration zu untersuchen. Dafür wird 2D- sowie 3D- Migration im Zusammenhang mit Arzneistoffen, Genmutationen und der chronischen Immunkrankheit Endometriose untersucht. Zusammengefasst zeigen diese Migrationsstudien, dass Migration über verschiedene Signalwege beeinflusst werden kann, wobei jeder dieser Wege Ansatzpunkte für die Behandlung von zellmigrationsbezogenen Krankheiten bietet

CAS directly interacts with vinculin to control mechanosensing and focal adhesion dynamics

Focal adhesions are cellular structures through which both mechanical forces and regulatory signals are transmitted. Two focal adhesion-associated proteins, Crk-associated substrate (CAS) and vinculin, were both independently shown to be crucial for the ability of cells to transmit mechanical forces and to regulate cytoskeletal tension. Here, we identify a novel, direct binding interaction between CAS and vinculin. This interaction is mediated by the CAS SRC homology 3 domain and a proline-rich sequence in the hinge region of vinculin. We show that CAS localization in focal adhesions is partially dependent on vinculin, and that CAS–vinculin coupling is required for stretch-induced activation of CAS at the Y410 phosphorylation site. Moreover, CAS–vinculin binding significantly affects the dynamics of CAS and vinculin within focal adhesions as well as the size of focal adhesions. Finally, disruption of CAS binding to vinculin reduces cell stiffness and traction force generation. Taken together, these findings strongly implicate a crucial role of CAS–vinculin interaction in mechanosensing and focal adhesion dynamic