The p53 homolog p73 takes hold of the male germ line – a novel function of TAp73 in protecting sperm cell adhesion, migration and maturation within the seminiferous epithelium of the testis

Die Transkriptionsfaktoren der p53 Familie besitzen diverse Aufgaben sowohl während der Tumorentstehung als auch während der Entwicklung. In seiner ursprünglichen, evolutionär konservierten Rolle hat p63, ein Mitglied der p53 Familie, die Aufgabe die genetische Stabilität von Keimzellen zu gewährleisten und beeinflusst zudem die Keimbahnentwicklung. Mit Hilfe von „knockout“ (KO) Mausmodellen wurde bereits der Einfluss der 3 Transkriptionsfaktoren p53, p63 und p73 auf die weibliche und männliche Keimbahn untersucht. Während p53KO und p63KO Mäuse fruchtbar sind, führt der gemeinsame Verlust aller p73 Isoformen oder der Verlust der transkriptionell aktiven Isoform TAp73 hingegen zur Infertilität der Tiere. Weibliche TAp73KO Tiere sind deshalb infertil, da es bei ihnen zu einer Inhibition der Ovulation kommt, die Blastozystenentwicklung gestört ist und Spindeldefekte in den Oozyten auftreten. Eine Erklärung für die Infertilität von männlichen TAp73KO Mäusen wurde hingegen noch nicht gegeben. In der vorliegenden wissenschaftlichen Studie beschreiben wir eine bisher unbekannte Funktion des Transkriptionsfaktors TAp73: seinen Einfluss auf die Entwicklung und den Erhalt der adulten männlichen Keimbahn. Untersuchungen an Mausmodellen zeigen, dass „total“ p73KO und Isoform-spezifische TAp73KO Mäuse im Alter von 6 Wochen oder älter einen starken Verlust von sich entwickelnden Keimzellen in den testikulären Tubuli aufweisen. ΔNp73KO Tiere zeigen diesen Phänotyp nicht und ihre Testis Morphologie entspricht der der Wildtyp (WT) Tiere. Der Phänotyp der p73KO und TAp73KO Testes lässt sich durch eine starke Reduktion in der Zahl der späten Stadien der Spermatozyten und Spermatiden charakterisieren, wohingegen die Zahl der basalen Spermatogonien und pachytänen Spermatozyten des Keimepithels nicht betroffen ist (reguläre Zellzahl und Proliferation). Die Depletion von p73 oder TAp73 führt zu einer Anhäufung von apoptotischen und unreifen Keimzellen im Lumen des Epididymis, was auf eine atypische, verfrühte Ablösung der Keimzellen aus dem Keimepithel schließen lässt. Diese Beobachtung wird dadurch bestätigt, dass die Sertoli-Zellen, welche die Keimzellen stützen und ernähren, im Elektronenmikroskop verkürzte cytoplasmatische Arme sowie eine verstärkte Vakuolisierung aufweisen. Außerdem zeigt das Keimepithel große strukturelle Veränderungen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Keimzellen nicht mehr dicht zu einem Epithel gepackt sind und die Sertoli-Keimzell-Verbindung gestört ist. Der Verlust der Epithelstruktur begleitet von der Reduktion der Keimzellen scheint das Ergebnis eines Defekts der Blut-Testis-Schranke (BTS) zu sein. Dies wird durch einen in vivo BTS Permeabilitätstest und die gestörte Morphologie der Sertoli-Sertoli „tight junctions“ deutlich. Der funktionelle Verlust der BTS führt zur Zerstörung der epithelialen Polarität und der Umgebung der sich entwickelnden Keimzellen. Somit wird auch die basal-luminal gerichtete Migration der Keimzellen entlang der Keimzelltaschen der Sertoli-Zellen verhindert. Der molekulare Hintergrund für das Ungleichgewicht in der Reorganisation der Zell-Zell Verbindungen wurde mit Hilfe der quantitativen Expressionsanalyse des Gesamtgenoms untersucht. Dabei wurde Testis Gewebe von TAp73KO mit WT Mäusen verglichen, um TAp73-Zielgene zu finden. Die Depletion von TAp73 führt zur Induktion von Genen, die an der Adhäsion und Zellmigration beteiligt sind; Integrine und Proteaseinhibitoren wie Timp1 und die Serpine zeigen eine Hochregulation in der Expression. Es ist bekannt, dass diese Proteine bei der Reorganisation von Zell-Zell Verbindungen im Testis involviert sind. Die Studie zeigt, dass TAp73 vorwiegend in den Keimzellen exprimiert wird und dass diese parakrin auf die Sertoli-Zellen zu wirken scheinen, da die Überexpression von TAp73 Zielgenen in isolierten Sertoli-Zellen in der Langzeitkultur zurückgeht. Zusammenfassend konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Funktion von TAp73 für die adulte Spermatogenese unerlässlich ist. TAp73 reguliert im Testis ein Transkriptionsprogramm von Genen, die an Adhäsion und Migration beteiligt sind, sichert den Zusammenhalt des Keimepithels und verhindert den frühzeitigen Verlust von Keimzellen. Somit wird die ungestörte Keimzellentwicklung ermöglicht. Umgekehrt führt die Depletion von TAp73 zu starken Defekten in Zell-Zell Verbindungen von sich entwickelnden Keimzellen im Keimepithel, was die Infertilität von p73KO und TAp73KO Mäusen erklärt.The p53 family of transcription factors possesses diverge functions in tumorigenesis and development. The evolutionarily conserved role of the family member p63 to protect the genetic stability of germ cells and influence germ cell development is thought to be the ancestral protein function. Using p53, p63 and p73 knockout (KO) mice, the impact of these transcription factors on the female and male germ line was previously investigated. While mice deficient for p53 and p63 are fertile, loss of either all p73 isoforms or of the transcriptionally active TAp73 isoform alone was shown to cause infertility. Concerning its cause, female TAp73KO mice were reported to be infertile due to impaired ovulation, oocyte spindle defects and abnormal blastocyst development. However, the effect of TAp73 loss in the male germ line is unknown. Here we identify a hitherto unknown function of the transcription factor TAp73 in the development and maintenance of the adult male germ line. Working with total p73KO and isoform-specific KO mice, we find that TAp73, but not ΔNp73 deficiency, leads to a strong loss of developing sperm cells in the testicular tubules of mice 6 weeks and older. Whereas the basal spermatogonia and pachytene spermatocytes of the germ cell epithelium are unaffected (normal cell number and cell proliferation), the numbers of late spermatocytes and spermatids are strongly reduced in global p73- and TAp73-deficient testis. Concomitantly, a higher amount of apoptotic and immature sperm cells accumulate in the lumen of the epididymis of both KO mice, indicating aberrant premature sloughing of sperm cells from the seminiferous epithelium. This finding is reinforced by the observation that the sperm cell nurse cells, the Sertoli cells, display shortened cytoplasmic arms and abnormal vacuolated morphology by electron microscopy. Moreover, the seminiferous epithelium is loosened with loss of tight packaging of sperm cells and strongly disorganized Sertoli-sperm cell junctions. This impaired epithelial structure with aberrant loss of sperm cells appears to be the result of a defective blood testis barrier (BTB), as revealed by in vivo BTB permeability assay and aberrant Sertoli-Sertoli tight junctions. Functional loss of the BTB disturbs the epithelial polarity, the microenvironment of developing sperm cells and their upward migration via attachment-reattachment cycles in the germ cell nursing pockets of Sertoli cells. The molecular explanation for imbalanced junctional restructuring was obtained by quantitative whole genome expression profiling of TAp73 target genes comparing wildtype (WT) versus TAp73KO testes tissue. Loss of TAp73 induces upregulation of adhesion- and migration-related genes including integrins and protease inhibitors like Timp1 and Serpins, known to be involved in disassembly and reassembly of cell-cell junctions in the testis. TAp73 is primarily expressed in the sperm cell fraction and seems to act on Sertoli cells in a paracrine fashion, as revealed by isolated primary Sertoli cell culture, where upregulation of TAp73 target genes declined over time in long-term cultures. In conclusion, we identify for the first time an indispensable role of TAp73 in adult spermatogenesis. Specifically, TAp73 orchestrates a transcriptional program of adhesion and migration-related genes, ensuring the cohesion of the seminiferous epithelium and preventing premature sloughing of sperm. Together, this enables proper germ cell maturation. Conversely, TAp73 loss leads to severe attachment defects of developing sperm within the seminiferous epithelium, explaining the infertility of p73KO and TAp73KO mice

RBM28, a protein deficient in ANE syndrome, regulates hair follicle growth via miR-203 and p63

Alopecia-neurological defects-endocrinopathy (ANE) syndrome is a rare inherited hair disorder, which was shown to result from decreased expression of the RNA-binding motif protein 28 (RBM28). In this study, we attempted to delineate the role of RBM28 in hair biology. First, we sought to obtain evidence for the direct involvement of RBM28 in hair growth. When RBM28 was downregulated in human hair follicle (HF) organ cultures, we observed catagen induction and HF growth arrest, indicating that RBM28 is necessary for normal hair growth. We also aimed at identifying molecular targets of RBM28. Given that an RBM28 homologue was recently found to regulate miRNA biogenesis in C. elegans and given the known pivotal importance of miRNAs for proper hair follicle development, we studied global miRNA expression profile in cells knocked down for RBM28. This analysis revealed that RBM28 controls the expression of miR-203. miR-203 was found to regulate in turn TP63, encoding the transcription factor p63, which is critical for hair morphogenesis. In conclusion, RBM28 contributes to HF growth regulation through modulation of miR-203 and p63 activity

While p73 is essential, p63 is completely dispensable for the development of the central nervous system

The ancient p53 paralogs p63 and p73 regulate specific tissue formation, cell survival and cell death via their TA and ΔN isoforms. Targeted disruption of the p73 locus leads to severe defects in the development of the central nervous system (CNS), and p73 has recently been shown to be an essential regulator of neural stem cell maintenance and differentiation in both embryonal and adult neurogenesis. In contrast, global p63−/− mice lack skin and limbs. Moreover, p63 is detectable in embryonic cortex. It has previously been proposed to also play critical pro-death and pro-survival roles in neural precursors of the developing sympathetic and central nervous system, respectively, based on experimental overexpression and siRNA-mediated knockdown of p63