Anàlisi funcional de la regió N-terminal de l'HMG-CoA reductasa d'Arabidopsis

[cat] Les plantes sintetitzen una gran varietat de compostos isoprenoides a través d'una ruta metabòlica complexa i ramificada. L'enzim HMG-CoA reductasa (HMGR) catalitza la conversió d'HMG-CoA en mevalonat, una etapa limitant de flux per la biosíntesis d'isoprenoides en el citosol-reticle endoplasmàtic (RE). En totes les espècies de plantes analitzades existeixen vàries isoformes d'HMGR codificades per petites famílies multigèniques. En el cas d'Arabidopsis, existeixen dos gens ( HMG1 i HMG2 ) que codifiquen per tres isoformes de l'enzim: HMGR1L, HMGR1S i HMGR2. Múltiples estudis suggereixen que les isoformes d'HMGR de plantes estarien implicades en la síntesi d'isoprenoides particulars. Aquest model d'especialització funcional de les isoformes d'HMGR està basat en estudis d'expressió gènica en diferents estadis del desenvolupament o en resposta a diferents estímuls. Tot i així, a l'inici d'aquesta tesi, no es tenien dades contrastades de la distribució de les isoformes d'HMGR en diferents teixits ni de la seva distribució subcel·lular. Aquest darrer aspecte era particularment interessant, doncs s'havia suggerit que l'especialització funcional de les isoformes d'HMGR podria venir determinada, en part, per diferències en la seva localització subcel·lular. Amb aquests antecedents, es va iniciar un estudi de la distribució tissular i subcel·lular de les diferents isoformes d'HMGR d'Arabidopsis. Mitjançant assaigs de western blot utilitzant anticossos generats contra el domini catalític de l'enzim, es va comprovar que les isoformes HMGR1S i HMGR1L es distribuïen de manera diferencial en teixits d'Arabidopsis, fet que es correlacionava amb els estudis previs d'expressió dels gens corresponents. Tanmateix, estudis de fraccionament subcel·lular a partir de cèl·lules de la línia T87 van demostrar que aquestes isoformes es trobaven en fraccions diferents: si bé l'HMGR1S es trobava bàsicament en una fracció que sedimenta a 16.000xg, l'HMGR1L s'enriquia en una fracció que sedimenta a 105.000xg. Estudis de localització subcel·lular emprant fusions amb la proteïna fluorescent verda (GFP) van determinar que, si bé la isoforma HMGR1S es localitza principalment en estructures vesiculars de 0.5-2 mi/m, la isoforma HMGR1L es troba exclusivament en el RE. Aquesta localització subcel·lular diferencial entre ambdues isoformes ve determinada per la presència d'una extensió N-terminal de 50 aminoàcids (1Lextra) en la isoforma HMGR1L. Per tant, la regió N-terminal citosòlica constitueix una regió que determina la localització subcel·lular de l'enzim, funció que ha de venir mediada per proteïnes que hi interaccionin específicament. Amb l'objectiu de cercar proteïnes que interaccionin amb la regió N-terminal citosòlica de l'HMGR1L, es va realitzar un crivellatge per doble híbrid d'una genoteca d'expressió d'Arabidopsis. D'aquesta manera, es van identificar les proteïnes PR2A1, PR2A2 i KLC1, i es va procedir a la seva caracterització. D'una banda, es va verificar que PR2A1 i PR2A2 eren subunitats reguladores B'' de la proteïna fosfatasa 2A (PP2A). Tanmateix, es va determinar que PR2A1 i PR2A2 interaccionaven selectivament amb la regió N-terminal citosòlica de les isoformes HMGR1L i HMGR1S, però no amb la de l'HMGR2. Finalment, es va constatar que la interacció de les isoformes HMGR1L i HMGR1S amb la PR2A1 és modulada per calci. Les dades suggereixen que la PP2A podria formar part de la cascada de senyalització subcel·lular que permetria ajustar l'activitat HMGR als estímuls ambientals i de desenvolupament. D'altra banda, es va constatar que KLC1 presentava similitud amb la cadena lleugera de quinesina de tipus I, i en conservava una estructura modular equivalent. A més, es va determinar que KLC1 interacciona amb la regió N-terminal citosòlica de la isoforma HMGR1L, però no amb la de l'HMGR1S ni l'HMGR2. També es va comprovar que la regió 1Lextra, que determina la localització de l'HMGR1L en el RE, és imprescindible per aquesta interacció. Aquest fet suggereix que KLC1 podria jugar un paper en la localització subcel·lular de la isoforma HMGR1L. En conjunt, les dades de localització subcel·lular i d'interacció amb les proteïnes PR2A1, PR2A2 i KLC1, permeten postular un model d'especialització funcional de les isoformes HMGR1S i HMGR1L en el qual la biosíntesis de mevalonat es produiria segregada en dos compartiments subcel·lulars: el RE i les estructures vesiculars, les quals constituirien un nou compartiment de biosíntesis d'isoprenoides en plantes

Multilevel control of arabidopsis 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase by protein phosphatase 2A

Plants synthesize a myriad of isoprenoid products that are required both for essential constitutive processes and for adaptive responses to the environment. The enzyme 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGR) catalyzes a key regulatory step of the mevalonate pathway for isoprenoid biosynthesis and is modulated by many endogenous and external stimuli. In spite of that, no protein factor interacting with and regulating plant HMGR in vivo has been described so far. Here, we report the identification of two B99 regulatory subunits of protein phosphatase 2A (PP2A), designated B99a and B99b, that interact with HMGR1S and HMGR1L, the major isoforms of Arabidopsis thaliana HMGR. B99a and B99b are Ca2+ binding proteins of the EF-hand type. We show that HMGR transcript, protein, and activity levels are modulated by PP2A in Arabidopsis. When seedlings are transferred to salt-containing medium, B99a and PP2A mediate the decrease and subsequent increase of HMGR activity, which results from a steady rise of HMGR1-encoding transcript levels and an initial sharper reduction of HMGR protein level. In unchallenged plants, PP2A is a posttranslational negative regulator of HMGR activity with the participation of B99b. Our data indicate that PP2A exerts multilevel control on HMGR through the fivemember B99 protein family during normal development and in response to a variety of stress conditions

Modulation of plant HMG-CoA reductase by protein phosphatase 2A: Positive and negative control at a key node of metabolism

The enzyme HMG-CoA reductase (HMGR) has a key regulatory role in the mevalonate pathway for isoprenoid biosynthesis, critical not only for normal plant development, but also for the adaptation to demanding environmental conditions. Consistent with this notion, plant HMGR is modulated by many diverse endogenous signals and external stimuli. Protein phosphatase 2A (PP2A) is involved in auxin, abscisic acid, ethylene and brassinosteroid signaling and now emerges as a positive and negative multilevel regulator of plant HMGR, both during normal growth and in response to a variety of stress conditions. The interaction with HMGR is mediated by B" regulatory subunits of PP2A, which are also calcium binding proteins. The new discoveries uncover the potential of PP2A to integrate developmental and calcium-mediated environmental signals in the control of plant HMGR

Multilevel control of arabidopsis 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase by protein phosphatase 2A

Plants synthesize a myriad of isoprenoid products that are required both for essential constitutive processes and for adaptive responses to the environment. The enzyme 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGR) catalyzes a key regulatory step of the mevalonate pathway for isoprenoid biosynthesis and is modulated by many endogenous and external stimuli. In spite of that, no protein factor interacting with and regulating plant HMGR in vivo has been described so far. Here, we report the identification of two B99 regulatory subunits of protein phosphatase 2A (PP2A), designated B99a and B99b, that interact with HMGR1S and HMGR1L, the major isoforms of Arabidopsis thaliana HMGR. B99a and B99b are Ca2+ binding proteins of the EF-hand type. We show that HMGR transcript, protein, and activity levels are modulated by PP2A in Arabidopsis. When seedlings are transferred to salt-containing medium, B99a and PP2A mediate the decrease and subsequent increase of HMGR activity, which results from a steady rise of HMGR1-encoding transcript levels and an initial sharper reduction of HMGR protein level. In unchallenged plants, PP2A is a posttranslational negative regulator of HMGR activity with the participation of B99b. Our data indicate that PP2A exerts multilevel control on HMGR through the fivemember B99 protein family during normal development and in response to a variety of stress conditions