Replication gap suppression depends on the double-strand DNA binding activity of BRCA2

Replication stress (RS) is a major source of genomic instability and is intrinsic to cancer cells. RS is also the consequence of chemotherapeutic drugs for treating cancer. However, adaptation to RS is also a mechanism of resistance to chemotherapy. BRCA2 deficiency results in replication stress in human cells. BRCA2 protein’s main functions include DNA repair by homologous recombination (HR) both at induced DNA double-strand breaks (DSB) and spontaneous replicative lesions. At stalled replication forks, BRCA2 protects the DNA from aberrant nucleolytic degradation and is thought to limit the appearance of ssDNA gaps by arresting replication and via post-replicative HR. However, whether and how BRCA2 acts to limit the formation of ssDNA gaps or mediate their repair, remains ill-defined. Here, we use breast cancer variants affecting different domains of BRCA2 to shed light on this function. We demonstrate that the N-terminal DNA binding domain (NTD), and specifically, its dsDNA binding activity, is required to prevent and repair/fill-in ssDNA gaps upon nucleotide depletion but not to limit PARPi-induced ssDNA gaps. Thus, these findings suggest that nucleotide depletion and PARPi trigger gaps via distinct mechanisms and that the NTD of BRCA2 prevents nucleotide depletion-induced ssDNA gaps.This research was funded by grants from the Agence National de Recherche (ANR-17-CE12-0016), Institut National du Cancer (INCa-DGOS_8706), and Agencia Española de Investigacion (MCIN/AEI) (PID2020-115977RB-I00) to A.C. and Jeunes Chercheuses from the Agence National de la Recherche (REPLIBLOCK ANR-17-CE12-0034-01) to C.R. A predoctoral Fellowship from Fondation ARC pour la recherche sur le cancer and French Ministry of Education supported D.V. A predoctoral Fellowship from Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) supported I.D., A.M., and C.v.N. L.A-A. was funded by an FPI Fellowship from Agencia Española de Investigacion (MCIN/AEI) (PID2020-115977RB-I00). R.C. was funded by a PSL (Paris Science et Lettres) predoctoral Fellowship and R.L. was funded by Fondation ARC pour la recherche sur le cancer

Caractérisation d’un nouveau rôle de Gnl3 dans la maintenance de la stabilité de génome

DNA replication requires a plethora of proteins to maintain its accuracy during replicative stress. In order to fully understand how DNA replication is sustained at proper pace, it is important to study the mechanisms that are guarding DNA replication during normal and perturbed conditions. Using the iPOND (isolation of proteins on nascent DNA) based screen we uncovered a new protein, GNL3 (aka nucleostemin), to be associated with replisome. GNL3 is overexpressed in several cancers and is involved in maintaining genomic integrity in stem and cancer cells, however its precise role(s) is unclear.One of the key mechanisms that protects the genomic stability during replication stress is the proper regulation of origin firing. In this project we show that GNL3 limits replicative stress by limiting replication origins firing. We proved that GNL3 is in in proximity of nascent DNA using different approaches and that its depletion reduces forks speed but increases forks density and replication origin firing. Conversely, overexpression of GNL3 leads to a decrease in origin firing. When subjected to exogenous replicative stress, cells impaired for GNL3 exhibits an increased MRN-dependent resection and RPA phosphorylation. Interestingly , we found that inhibition of origin firing using CDC7 inhibitor decreased resection in absence of GNL3 but not in absence of BRCA1, suggesting that GNL3 protects the integrity of stalled forks indirectly by regulating origin firing efficiency. In addition, using various approaches (BioID, PLA, coIP), we established that ORC2 and GNL3 interact together in the nucleolus. We propose that GNL3 level is crucial to determine the correct distribution of ORC2 on chromatin to regulate origins licensing. Our data present insights into a new role of GNL3 in the regulation of origin firing that protects genomic stability.La réplication de l’ADN nécessite une pléthore de protéines afin d’assurer sa processivité en particulier en présence de stress réplicatif. . Afin de mieux comprendre le processus de réplication de l’ADN, il est important d’étudier les mécanismes qui permettent la réplication dans des conditions normales et en présence de stress réplicatif. A l’aide de la méthode iPOND (isolation of proteins on nascent DNA), nous avons découvert une nouvelle protéine associée avec la machinerie de réplication de l’ADN : GNL3 (appelée aussi nucleostemin). GNL3 est surexprimées dans plusieurs cancers et est impliquée dans la réponse aux lésions de l’ADN dans les cellules souches et cancéreuses, néanmoins ses fonctions précises au sein de la cellule ne sont pas connues.Un des mécanismes majeurs de la protection de l’intégrité du génome durant la réplication en présence de stress est le contrôle précis de l’activation des origines de réplication. Durant ma thèse de Doctorat j’ai montré que GNL3 limite le stress réplicatif en contrôlant l’activation des origines de réplication. J’ai montré que GNL3 est à proximité de l’ADN naissant en utilisant plusieurs approches et que sa déplétion réduit la vitesse de progression des fourches de réplication tout en augmentant la leur densité et l’activation de origines de réplication. Inversement, la surexpression de GNL3 inhibe l’activation des origines de réplication. En présence de sources exogènes de stress réplicatif, l’inactivation de GNL3 conduit à une résection de l’ADN naissant par le complexe MRN et à un la phosphorylation de RPA. J’ai montré que l’inhibition de l’activation des origines de réplication (en utilisant un inhibiteur de CDC7) conduit à une baisse du niveau de résection en absence de GNL3 mais pas en absence de BRCA1. Il apparait donc que GNL3 joue un rôle clé dans la stabilité des fourches de réplication bloquées en régulant l’efficacité d’activation des origines. De plus, à l’aide de plusieurs approches (BioID, PLA, CoIP), j’ai établi que GNL3 interagit avec ORC2 dans le nucléole. Je propose que GNL3 joue un rôle clé dans la distribution d’ORC2 sur la chromatine permettant ainsi la régulation correcte de l’activation des origines. Au final il apparait que le rôle de GNL3 dans la régulation des origines est crucial pour assurer la stabilité du génome

Characterization of a Novel Role of GNL3 in Maintaining Genomic Stability

La réplication de l’ADN nécessite une pléthore de protéines afin d’assurer sa processivité en particulier en présence de stress réplicatif. . Afin de mieux comprendre le processus de réplication de l’ADN, il est important d’étudier les mécanismes qui permettent la réplication dans des conditions normales et en présence de stress réplicatif. A l’aide de la méthode iPOND (isolation of proteins on nascent DNA), nous avons découvert une nouvelle protéine associée avec la machinerie de réplication de l’ADN : GNL3 (appelée aussi nucleostemin). GNL3 est surexprimées dans plusieurs cancers et est impliquée dans la réponse aux lésions de l’ADN dans les cellules souches et cancéreuses, néanmoins ses fonctions précises au sein de la cellule ne sont pas connues.Un des mécanismes majeurs de la protection de l’intégrité du génome durant la réplication en présence de stress est le contrôle précis de l’activation des origines de réplication. Durant ma thèse de Doctorat j’ai montré que GNL3 limite le stress réplicatif en contrôlant l’activation des origines de réplication. J’ai montré que GNL3 est à proximité de l’ADN naissant en utilisant plusieurs approches et que sa déplétion réduit la vitesse de progression des fourches de réplication tout en augmentant la leur densité et l’activation de origines de réplication. Inversement, la surexpression de GNL3 inhibe l’activation des origines de réplication. En présence de sources exogènes de stress réplicatif, l’inactivation de GNL3 conduit à une résection de l’ADN naissant par le complexe MRN et à un la phosphorylation de RPA. J’ai montré que l’inhibition de l’activation des origines de réplication (en utilisant un inhibiteur de CDC7) conduit à une baisse du niveau de résection en absence de GNL3 mais pas en absence de BRCA1. Il apparait donc que GNL3 joue un rôle clé dans la stabilité des fourches de réplication bloquées en régulant l’efficacité d’activation des origines. De plus, à l’aide de plusieurs approches (BioID, PLA, CoIP), j’ai établi que GNL3 interagit avec ORC2 dans le nucléole. Je propose que GNL3 joue un rôle clé dans la distribution d’ORC2 sur la chromatine permettant ainsi la régulation correcte de l’activation des origines. Au final il apparait que le rôle de GNL3 dans la régulation des origines est crucial pour assurer la stabilité du génome.DNA replication requires a plethora of proteins to maintain its accuracy during replicative stress. In order to fully understand how DNA replication is sustained at proper pace, it is important to study the mechanisms that are guarding DNA replication during normal and perturbed conditions. Using the iPOND (isolation of proteins on nascent DNA) based screen we uncovered a new protein, GNL3 (aka nucleostemin), to be associated with replisome. GNL3 is overexpressed in several cancers and is involved in maintaining genomic integrity in stem and cancer cells, however its precise role(s) is unclear.One of the key mechanisms that protects the genomic stability during replication stress is the proper regulation of origin firing. In this project we show that GNL3 limits replicative stress by limiting replication origins firing. We proved that GNL3 is in in proximity of nascent DNA using different approaches and that its depletion reduces forks speed but increases forks density and replication origin firing. Conversely, overexpression of GNL3 leads to a decrease in origin firing. When subjected to exogenous replicative stress, cells impaired for GNL3 exhibits an increased MRN-dependent resection and RPA phosphorylation. Interestingly , we found that inhibition of origin firing using CDC7 inhibitor decreased resection in absence of GNL3 but not in absence of BRCA1, suggesting that GNL3 protects the integrity of stalled forks indirectly by regulating origin firing efficiency. In addition, using various approaches (BioID, PLA, coIP), we established that ORC2 and GNL3 interact together in the nucleolus. We propose that GNL3 level is crucial to determine the correct distribution of ORC2 on chromatin to regulate origins licensing. Our data present insights into a new role of GNL3 in the regulation of origin firing that protects genomic stability

GNL3 regulates replication origin firing and protects stalled replication forks

DNA replication by the replisome requires specific proteins that protect replication forks and so prevent the formation of DNA lesions that may damage the genome. Here, we show that human GNL3/nucleostemin, a GTP-binding protein localized in the nucleolus and the nucleoplasm, is a new component of the replisome. Depletion of GNL3 reduces fork speed but increases replication origin firing. When subjected to replication stress, the nascent DNA of GNL3-depleted cells undergoes nuclease-dependent resection, a source of DNA lesions. Inhibition of origin firing decreases this resection, indicating that the increased replication origin firing seen upon GNL3 depletion mainly accounts for the observed DNA resection. We show that GNL3 and DNA replication initiation factor ORC2 interact in the nucleolus, and that GNL3 regulates ORC2 subnuclear localization. The accumulation of GNL3 in the nucleolus is thus required to limit DNA resection in response to replicative stress, potentially through the regulation of ORC2 functions

Dihydropyrimidinase protects from DNA replication stress caused by cytotoxic metabolites

International audienceImbalance in the level of the pyrimidine degradation products dihydrouracil and dihydrothymine is associated with cellular transformation and cancer progression. Dihydropyrimidines are degraded by dihy-dropyrimidinase (DHP), a zinc metalloenzyme that is upregulated in solid tumors but not in the corresponding normal tissues. How dihydropyrimidine metabolites affect cellular phenotypes remains elusive. Here we show that the accumulation of di-hydropyrimidines induces the formation of DNA-protein crosslinks (DPCs) and causes DNA replication and transcriptional stress. We used Xenopus egg extracts to recapitulate DNA replication in vitro. We found that dihydropyrimidines interfere directly with the replication of both plasmid and chromo-somal DNA. Furthermore, we show that the plant flavonoid dihydromyricetin inhibits human DHP activity. Cellular exposure to dihydromyricetin triggered DPCs-dependent DNA replication stress in cancer cells. This study defines dihydropyrimidines as potentially cytotoxic metabolites that may offer an opportunity for therapeutic-targeting of DHP activity in solid tumors