Propriétés anti-athérogènes du DHA : effets nutrigénomiques au niveau aortique et rôle potentiel des métabolites issus de la peroxydation

Encadrant de thèse : Cécile GladineNumerous studies have reported beneficial effects of long chain omega-3 polyunsaturated fatty acids (LC-ω3PUFAs) on atherosclerosis and associated cardiovascular events. These fatty acids are mainly represented by eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA). LC-ω3PUFAs exert their athero-protective action mainly by a reduction of triglyceridemia, increased endothelial relaxation, and reduced inflammation. Their specific action at the vascular level is suggested. Their mechanisms of action are still only partially understood because of the complexity of action of LC-ω3PUFAs at the cellular level. LC-ω3PUFAs affect several membrane or cytosolic proteins, including transcription factors, which modulate numerous gene expression. The complexity is further increased when considering a wide range of oxygenated metabolites derived from LC-ω3PUFAs. Among them, the metabolites from lipid peroxidation may be produced in abundance during atherogenesis but their bioactivity is almost unknown. There are still major issues to be clarified, such as the identification of cellular and molecular targets at the vascular level ; the bioactivity of peroxidized metabolites that could play a key role in the prevention of atherosclerosis. The objective of this work was to study the impact of DHA at the vascular level and to evaluate the bioactivity of selected metabolites from DHA lipid peroxidation. Studies on anti-atherogenic properties of DHA have so far been carried out only in a targeted manner that does not provide a comprehensive and integrated view of its spectrum of action. Nutrigenomics appears to be a relevant approach to study the effects of DHA at the vascular level. In vivo study was performed on LDLR-/- atherosclerotic mice supplemented or not with DHA. The athero-protective effect of DHA has been confirmed in the previous study performed by our team reporting a 35% decrease of the atherosclerotic lesion in the DHA group. Aorta proteome study demonstrated a significant alteration of the expression of proteins involved mainly in the carbohydrate and lipid metabolism and also in antioxidant defenses. At the transcriptome level, the inflammatory component of atherosclerosis appears to be a major target of DHA at the vascular level. More precisely, DHA supplementation reduced the expression of genes involved in cell adhesion, chemotaxis and antigen presentation. Several genes were found to be phenotypic markers of macrophages and analysis of transcriptional regulators showed a possible contribution of PPARγ, IFNγ and NFκB to the observed modulation of gene expression. Our results suggest a preferential orientation of macrophages to a M2 type repair phenotype in mice receiving DHA supplementation. This was confirmed by immunohistochemical analysis at the aorta which revealed a greater abundance of arginase I. We chose a focused in vitro study of the action of specific DHA peroxidized metabolites: the neuroprostanes on a human macrophages. This study allowed us to confirm our hypothesis that DHA may act at least in part via its peroxidized metabolites. The macrophages exposition to 2 types of neuroprostanes (4-F4t and 14-A4-Neuroprostanes) has significantly reduced the expression and secretion of several pro-inflammatory mediators. Preliminary results suggest that these anti-inflammatory effects are PPARγ-independent but related to inhibition of NFκB pathway. In vivo study, and nutrigenomics approach, allowed us to explore the impact of DHA at the vascular level by an open and unbiased way. The results are that DHA activates energy metabolism and antioxidant defenses and reduces the inflammatory component of atherosclerosis with a possible involvement of DHA in the phenotypic direction of macrophages to a M2 type repair phenotype. The results obtained in vitro on primary human macrophages confirmed that DHA peroxidized metabolites contribute to its anti-inflammatory properties.Les acides gras polyinsaturés oméga-3 à longue chaîne (AGPIω3-LC), principalement représentés par l'acide eicosapentaénoïque (EPA) et l'acide docosahexaénoïque (DHA), présentent des effets bénéfiques vis-à-vis de l'athérosclérose. Leur action au niveau vasculaire est suggérée. Les mécanismes d'action sont mal compris du fait de la complexité d'action des AGPIω3-LC au niveau cellulaire. Les AGPIω3-LC affectent de nombreuses protéines y compris les facteurs de transcription, ce qui engendre la modulation de l'expression de nombreux gènes. La complexité s'accroît si l'on considère l'ensemble des métabolites oxygénés issus des AGPIω3-LC. Les métabolites issus de la peroxydation lipidique peuvent être produits en abondance au cours de l'athérogenèse mais leur bioactivité est quasiment inconnue. Des points majeurs restent à éclaircir comme l'identification des cibles cellulaires et moléculaires au niveau vasculaire et la bioactivité des métabolites peroxydés. Objectifs : étudier l'impact du DHA au niveau vasculaire et évaluer la bioactivité de certains métabolites issus de la peroxydation lipidique du DHA. Les travaux visant à étudier les propriétés athéro-protectrices du DHA n'ont jusqu'à présent pas permis d'obtenir une vision globale de son spectre d'action. La nutrigénomique a paru être une approche pertinente pour étudier les effets du DHA au niveau vasculaire. Une étude in vivo a été réalisée sur des souris athérosclérotiques LDLR-/- recevant ou non une supplémentation en DHA (2% de l'apport énergétique journalier). Le rôle athéro-protecteur du DHA a été confirmé dans une étude précédente rapportant une diminution de 35% de l'étendue des lésions au niveau aortique dans le groupe DHA. Au niveau protéique, nous avons montré une altération significative de l'expression de protéines intervenant principalement au niveau des métabolismes glucidique et lipidique mais aussi dans les défenses anti-oxydantes. Au niveau génique, la composante inflammatoire s'est avérée être une cible majeure du DHA au niveau vasculaire. La supplémentation en DHA a réduit l'expression de gènes impliqués dans l'adhésion cellulaire, la chimiotaxie et la présentation de l'antigène. Plusieurs gènes se sont avérés être des marqueurs phénotypiques des macrophages et l'analyse des régulateurs transcriptionnels montrait une implication probable de PPARγ, IFNγ et NFκB dans les modulations d'expression génique observées. Nos analyses suggèrent une orientation préférentielle des macrophages vers un phénotype réparateur de type M2 chez les souris recevant la supplémentation en DHA. Une analyse immunohistochimique au niveau aortique a révélé une plus grande abondance d'arginase I. Une approche plus ciblée alliant une étude in vitro sur un modèle de macrophages humains et l'utilisation de métabolites peroxydés spécifiques du DHA, les neuroprostanes, nous a permis de conforter notre hypothèse selon laquelle le DHA pourrait agir au moins en partie via ses métabolites peroxydés. L'exposition des macrophages à deux types de neuroprostanes (les 4-F4t et les 14-A4-Neuroprostanes) a permis de réduire significativement l'expression et la sécrétion de plusieurs médiateurs pro-inflammatoires. Des résultats préliminaires suggèrent que ces effets anti-inflammatoires des neuroprostanes seraient indépendants de PPARγ mais liés à une inhibition de la voie NFκB. L'étude in vivo et l'utilisation de la nutrigénomique nous ont permis d'explorer de façon ouverte et non biaisée l'impact du DHA au niveau vasculaire. Les résultats sont que le DHA active le métabolisme énergétique et les défenses anti-oxydantes et diminue l'état inflammatoire avec une implication probable du DHA dans l'orientation phénotypique des macrophages vers un phénotype réparateur de type M2. Les résultats obtenus in vitro sur macrophages primaires humains confirment que les métabolites peroxydés du DHA contribuent à ses propriétés anti-inflammatoires

Docosahexaenoic fatty acid favorably alters inflammatory pathways and macrophage polarization in the aorta of atherosclerotic mice

The omega 3 PUFA docosahexaenoic acid (DHA) has potent anti-atherosclerotic properties but its molecular action at the vascular level remains poorly explored. Knowing the broad range of DHA targets at the cellular and molecular levels, microarray analysis was chosen to evaluate the effect of DHA intake on the overall gene expression in the aorta of atherosclerosis prone LDLR-/- mice. Mice were fed (20 wks) an atherogenic diet and received daily oral gavages with either oleic acid-rich oil or a mixture of oils providing 2% of energy as DHA. As anticipated, DHA intake exerts a potent cardioprotective effects, i.e. reduced systolic blood pressure (-16 mmHg, p<0.01), plasma levels of cholesterol (-28%, p<0.001) and triacylglycerols (-37%, p<0.01), and lowered the extent of atherosclerosis measured in the aortic root (-35%, p<0.001). Bioinformatics analysis of microarray data (functional enrichment and canonical pathway analysis) of the aortic gene expression revealed that DHA supplementation mostly affected inflammatory processes and innate immunity, with a remarkable number of down-regulated genes associated with pro-inflammatory activity of immune cells (e.g. CCL5, CCR7), cell movement (e.g. ICAM-2, SELP, PECAM-1), and antigen presentation (e.g. HLA-DQA1, HLA-DRB1, HLA-DQB1, H2-Q8). Interestingly, the expression of several significantly modulated genes were identified as markers of macrophage phenotype, suggesting their preferential orientation towards a M2 reparative phenotype. This hypothesis was confirmed by the immunohistological analysis of a specific biomarker of M2 macrophage (arginase 1), which abundance was increased in the aortic root of the DHA supplemented group (+111%, p=0.01). All together, these results suggest that DHA mainly intefere with atherosclerosis progression by limiting inflammation probably through the orientation of macrophages towards a M2 reparative phenotype

Immunodétection des adduits protéiques aldéhydiques de type hydroxyalkénal au niveau vasculaire : études in vivo et in vitro

C. Gladine : Communication orale + PosterImmunodétection des adduits protéiques aldéhydiques de type hydroxyalkénal au niveau vasculaire : études in vivo et in vitro. 9. Congrès Annuel de la Nouvelle Société Française d'Athéroscléos

Proteomic analysis of aorta of LDLR-/- mice given omega-3 fatty acids reveals modulation of energy metabolism and oxidative stress pathway

The authors acknowledge Catherine Besson and Jean-Paul Rigaudiere for monitoring of the animal experimentation. We also thank Didier Viala for performing the mass spectrometry analyses at the INRA Clermont-Ferrand/Theix Research Center "Metabolism Exploration Platform: PFEM" and Laetitia Theron for its contribution during mass spectrometry analyses. We acknowledge the Servier library providing pictures for graphical abstract. The project was supported by intramural French National Institute for Agricultural Research (INRA).Long chain omega 3 polyunsaturated fatty acids (LC-n-3PUFAs) exert potent anti-atherosclerotic action but the mechanisms of action at the vascular level remain unclear. The present study used a non-targeted nutrigenomic approach to investigate the modulations of the aortic proteome in atherosclerotic prone mice following DHA supplementation. LDLR-/- male mice received an atherogenic diet (20 weeks) in parallel with daily oral gavages with either oleic acid-rich oil (Control) or a mixture of oils providing 2% of energy as DHA. The overall protein expression was determined by a proteomic approach followed by bioinformatics analysis. In addition, protein oxidative modifications, namely 4-hydroxynonenal (4-HNE) protein adducts, were detected with a specific antibody followed by MS analysis of the identified spots. Nineteen differentially expressed proteins have been identified in the aorta of the DHA group. The top 5 canonical pathways analysis associated all proteins to metabolic pathways and showed that most of them were related to glucose or lipid metabolism. Up-regulation of superoxide dismutase also suggests an impact of DHA supplementation on vascular antioxidant defenses. The analysis of 4-HNE-protein adducts indicated that DHA supplementation did not enhance oxidative modification of proteins with 4-HNE. This study also identified some new proteins with 4-HNE adducts at the aortic level. In summary, DHA supplementation induces significant modifications of aorta proteome which point out the importance of metabolic changes occurring in the vascular tissue in the presence of LC-n-3PUFAs

Nutrigenomic effect of omega-3 fatty acids in the aorta of LDLR-/- mice

Nutrigenomic effect of omega-3 fatty acids in the aorta of LDLR-/- mice. 10. NuGO week 201

Propriétés anti-athérosclérotiques du DHA : approche nutrigénomique au niveau aortique chez la souris LDLR-/-

National audienceIntroduction : Les acides gras polyinsaturés oméga-3 à longue chaîne (AGPIω3-LC) et l’acide docosahexaénoïque (DHA) en particulier, ont des propriétés athéro-protectrices reconnues mais les mécanismes d’action au niveau vasculaire ont été peu décrits. Dans ce contexte, le but de cette étude a été de déterminer l’impact du DHA sur l’expression globale des gènes (transcriptomique) et protéines (protéomique) au niveau aortique. Méthodes : Des souris athérosclérotiques LDLR-/- ont été nourries pendant 20 semaines avec un régime enrichi en saindoux (10%, p/p) et cholestérol (0,045%, p/p) et ont reçu, soit une huile de tournesol riche en acide oléique (Groupe Contrôle), soit un mélange d’huiles fournissant 2% des apports énergétiques sous forme de DHA (Groupe DHA). Résultats : L’apport en DHA a engendré, comme attendu, une réduction des concentrations plasmatiques en cholestérol (-28%, p<0,001) et triglycérides (-37%, p<0,01), de la pression artérielle systolique (-16 mmHg, p<0,01), ainsi qu’une diminution de l’étendue des lésions athérosclérotiques (-35%, p<0,001). Les résultats de l’étude protéomique ont mis en exergue l’impact du DHA sur les voies métaboliques avec une activation des métabolismes glucidique [augmentation de la glycolyse (ENO1 et 3, PKM) et de la voie des pentoses phosphates (G6PD)] et lipidique [augmentation de la b-oxydation (HADHA, ACADVL, PCCB)] ainsi qu’une stimulation des défenses anti-oxydantes (augmentation de SOD1 et HSP75). L’analyse transcriptomique a mis en évidence l’impact du DHA sur la composante inflammatoire. En effet, la majorité des fonctions et des voies de signalisation affectées par la supplémentation en DHA sont en relation avec l’activité des cellules immunitaires. Cette analyse a notamment révélé une réduction de l’expression de molécules d’adhésion (Selectin-P, ICAM-2, PCAM-1), de chimiokines et de leurs récepteurs (CCR7, CXCL12, CX3CL1, CCL-5,) ou de gènes appartenant au complexe majeur d’histocompatibilité (HLA-DRB1, HLA-DQB1, HLA-DQA1). De plus, l’analyse des régulateurs transcriptionnels a permis d’identifier PPARg, INFg et NFkB comme les facteurs de transcription les plus significativement modulés. Conclusion : L’analyse nutrigénomique que nous avons réalisé a permis l’identification des cibles moléculaires du DHA au niveau vasculaire contribuant à une meilleure compréhension des mécanismes d’action athéro-protectrice du DHA. La composante inflammatoire étant particulièrement affectée, les recherches futures viseront à étudier plus précisément l’impact du DHA et de ses métabolites oxygénés sur l’activité des cellules immunitaire

Immunodétection des adduits aldéhydiques de type hydroxyalkénal dans le protéome et le tissu aortique de souris athérosclérotiques – mise au point méthodologique

La peroxydation lipidique des acides gras polyinsaturés (AGPI) induit notamment la formation d’aldéhydes réactifs capables de former des adduits avec différentes molécules dont les protéines, en se liant sur leurs résidus aminoacyls. Il a été montré que le 4-hydroxy-trans-2-nonenal (4-HNE), issu de l’oxydation des AGPI oméga-6, joue un rôle dans l‘athérogenèse. Les AGPI oméga-3 à longue chaîne (EPA : acide eicosapentaénoïque et DHA : acide docosahexaénoïque) sont également susceptibles d’être peroxydés entraînant la formation du 4-hydroxyhexenal (4-HHE). Cependant, plusieurs études expérimentales ont montré des effets anti-athérogènes des AGPI oméga-3 à longue chaîne. Il reste à déterminer si cet effet passe par une modulation (quantitative ou qualitative) de la production de métabolites peroxydés. Ceux-ci pourraient être dire ctement impliqués dans la modulation de l’activité de protéines. Ainsi, nous avons étudié l’abondance des modifications post-traductionnelles oxydatives (MPTO) affectant le protéome d’aorte de souris LDLR-/-, un modèle d’athérosclérose, recevant per os différentes doses de DHA. L’analyse protéomique est réalisée d’une part par électrophorèse bidimensionnelle couplée à une immuno-détection des adduits 4-HNE et 4-HHE et d’autre part par la quantification de protéines carbonylées. Huit protéines présentant des adduits 4-HNE ont été identifiées, par spectrométrie de masse MALDI-ToF, aussi bien dans le groupe témoin que celui recevant le DHA. Ces protéines sont essentiellement mitochondriales et interviennent dans le métabolisme des lipides. Par ailleurs, nous avons localisé des adduits 4-HNE-protéines dans les lésions athéromateuses des aortes de souris par immunohistochimie (IHC). Cependant nous n’avons pas détecté d’adduits 4-HHE ni au niveau du protéome ni sur des coupes d’aorte. Ce résultat pourrait être dû à la faible abondance du 4-HHE ou à la non-spécificité de l’anticorps utilisé. Toutefois, nous avons pu démontrer la présence de 4-HHE, par IHC, dans des cellules endothéliales humaines en culture, en particulier après leur exposition au DHA. Ces mises au point nous permettent l’étude de différentes MPTO et leurs conséquences dans différentes conditions physiopathologiques et nutritionnelles

La teneur hépatique en F4-Neuroprostanes : une variable prédictive majeure de la réduction de la plaque d’athérome

Le fichier annexe contient le livre des résumésLes propriétés athéroprotectrices des acides gras polyinsaturés de type n-3 à longue chaîne (AGPI n-3 LC), et en particulier de l’acide docosahexaénoique (DHA) ont été largement décrites. Néanmoins, les mécanismes d’action restent encore mal connus. Les recherches se sont récemment orientées vers l’identification des métabolites oxygénés issus des AGPI n-3 LC qui sont de plus en plus considérés comme des effecteurs majeurs de leurs effets athéroprotecteurs. Dans ce contexte, une étude dose-réponse de supplémentation en DHA a été réalisée chez un modèle animal d’athérosclérose (souris LDLR-/-) afin d’étudier les relations entre la progression de la plaque d’athérome et les profils en métabolites oxygénés issus du DHA. La supplémentation en DHA a réduit de façon dose-dépendante la plupart des facteurs de risque cardiovasculaire (TG plasmatique, R2=0.97, p=0.01; Cholestérol plasmatique et hépatique, respectivement R2=0.96, p<0.01 et R2=0.93, p=0.03) ainsi que l’étendue de la plaque d’athérome (R2=0.97, p=0.02). L’analyse des profils lipidomiques a révélé une forte modulation des compositions en acides gras mais également des augmentations substantielles des métabolites oxygénés issus du DHA. Parmi ceux-ci, il faut noter l’augmentation dose-dépendante (R2=0.99, p<0.01) des niveaux hépatiques en F4-Neuroprostanes (F4-NP), un métabolite oxygéné issus de la peroxydation du DHA. Par ailleurs, une matrice de corrélation de Pearson intégrant l’ensemble des variables a montré que les F4-NP étaient le paramètre le plus négativement corrélé avec l’étendue de la plaque d’athérome. Pour définir les variables les plus prédictives de la progression de l’athérosclérose, nous avons réalisé une analyse en régression PLS avec l’ensemble des données. Cette analyse confirme que la concentration hépatique en F4-NP représente une variable fortement discriminante pour la répartition des animaux en fonction de l’étendue de leur plaque d’athérome. Enfin, le modèle de prédiction de la plaque d’athérome obtenu (R2=0.68) révèle que l’augmentation des teneurs hépatiques en F4-NP est la variable la plus prédictive de la réduction de la plaque d’athérome. Notre étude suggère donc que les F4-NP issus de la peroxydation du DHA pourraient jouer un rôle dans la prévention de l’athéroscléros

La teneur hépatique en F4-Neuroprostanes : une variable prédictive majeure de la réduction de la plaque d’athérome

Le fichier annexe contient le livre des résumésLes propriétés athéroprotectrices des acides gras polyinsaturés de type n-3 à longue chaîne (AGPI n-3 LC), et en particulier de l’acide docosahexaénoique (DHA) ont été largement décrites. Néanmoins, les mécanismes d’action restent encore mal connus. Les recherches se sont récemment orientées vers l’identification des métabolites oxygénés issus des AGPI n-3 LC qui sont de plus en plus considérés comme des effecteurs majeurs de leurs effets athéroprotecteurs. Dans ce contexte, une étude dose-réponse de supplémentation en DHA a été réalisée chez un modèle animal d’athérosclérose (souris LDLR-/-) afin d’étudier les relations entre la progression de la plaque d’athérome et les profils en métabolites oxygénés issus du DHA. La supplémentation en DHA a réduit de façon dose-dépendante la plupart des facteurs de risque cardiovasculaire (TG plasmatique, R2=0.97, p=0.01; Cholestérol plasmatique et hépatique, respectivement R2=0.96, p<0.01 et R2=0.93, p=0.03) ainsi que l’étendue de la plaque d’athérome (R2=0.97, p=0.02). L’analyse des profils lipidomiques a révélé une forte modulation des compositions en acides gras mais également des augmentations substantielles des métabolites oxygénés issus du DHA. Parmi ceux-ci, il faut noter l’augmentation dose-dépendante (R2=0.99, p<0.01) des niveaux hépatiques en F4-Neuroprostanes (F4-NP), un métabolite oxygéné issus de la peroxydation du DHA. Par ailleurs, une matrice de corrélation de Pearson intégrant l’ensemble des variables a montré que les F4-NP étaient le paramètre le plus négativement corrélé avec l’étendue de la plaque d’athérome. Pour définir les variables les plus prédictives de la progression de l’athérosclérose, nous avons réalisé une analyse en régression PLS avec l’ensemble des données. Cette analyse confirme que la concentration hépatique en F4-NP représente une variable fortement discriminante pour la répartition des animaux en fonction de l’étendue de leur plaque d’athérome. Enfin, le modèle de prédiction de la plaque d’athérome obtenu (R2=0.68) révèle que l’augmentation des teneurs hépatiques en F4-NP est la variable la plus prédictive de la réduction de la plaque d’athérome. Notre étude suggère donc que les F4-NP issus de la peroxydation du DHA pourraient jouer un rôle dans la prévention de l’athéroscléros

Insight into the contribution of isoprostanoids to the health effects of omega 3 PUFAs

The authors received support for their previous and current studies on omega 3 IsoPs from INRA and the Groupe Lipides NutritionOmega 3 polyunsaturated fatty acids have been reported to confer beneficial health effects notably in the field of cardiovascular and inflammatory diseases. The current knowledge suggests a significant portion of the effects of omega 3 polyunsaturated fatty acids are mediated by their oxygenated metabolites. This review attempts to cover the current literature about the contribution of specific omega 3 oxygenated metabolites, namely omega 3 isoprostanoids, which are produced through free-radical mediated oxidation. A special emphasis has been given to the most biologically relevant omega 3 polyunsaturated fatty acids namely the alpha-linolenic, eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids. The review includes a comprehensive description of the biosynthetic pathways, a summary of studies related to the biological significance of omega 3 isoprostanoids as well as a critical description of analytical development in the field of omega 3 isoprostanoids profiling in biological sample