Implication de p38 et p53 dans le mécanisme d’action du cetuximab dans le cancer colorectal

Cetuximab is used in colorectal cancer (CRC), as targeted therapy against the Epithelial Growth Factor receptor (EGFR), in association with chemotherapy (5-FU, oxaliplatin and irinotecan). Its binding inhibits signaling pathways downstream to the receptor leading to a decrease in proliferation and surviving. In KRAS mutated CRC patients, Cetuximab is ineffective, and half of KRAS Wild Type (WT) patients does not respond to Cetuximab either. Thus, a better knowledge of Cetuximab mechanism of action will help to improve response rate and to find new biomarkers of response. Recently, studies have shown that p53 protein is involved in the response to cetuximab. It would be interesting to know if the status of this protein could be a biomarker of response. Previously, we have shown that activation of the mitogen activated protein kinase p38 (p38MAPK) induces irinotecan resistance in vitro and in vivo and is a predictive factor of response to irinotecan. Moreover, others teams found that p38 MAPK also partially block 5-FU response and participate to oxaliplatin cytotoxicity. It seems that p38 is involved in mechanism of action of anti-tumor agent. The aim of our project is to determine, in KRAS WT colorectal cells, if p38 MAPK is involved as well in the cetuximab effect. In this aim, experiments were done on two KRAS WT CRC cell lines but with different p53 status which respond differently to Cetuximab: Caco2 cells (30% of survival inhibition, TP53 mutated) and DiFi cells (80% of survival inhibition, TP53 wild-type). Cytotoxic experiments combining cetuximab treatment and inhibition of p38MAPK or p53 by transcriptional inhibition or using a pharmacological inhibitor of p38 (SB202190) were performed. We assessed apoptosis and inhibition of proliferation by FACS analysis of cell cycle and DNA synthesis. In addition, BIM, PUMA and p27 expression were analyzed by QPCR and Western Blot. Our results showed that inhibition of p38MAPK enhances Cetuximab cytotoxic effect in Caco2 cells but impairs it in DiFi cells as inhibition of p53. We also observed that inhibition of p38 MAPK and p53 decreases cetuximab induced apoptosis and inhibition of p38 decrease anti-proliferative effect in DiFi cells. The prevention of cell death by SB202190 in cetuximab treated DiFi cells could be explained by ERK pathway activation and the decrease of FOXO3a nuclear localization leading to p27 and BIM expression decrease, respectively involved in cellular proliferation and mitochondrial apoptosis. Our results have shown the same inhibiting effect of SB202190 on the cytotoxic effect of two tyrosine-kinase inhibitors targeting EGFR (lapatinib and erlotinib) in DiFi cells indicating that p38MAPK implication is linked to inhibition of EGFR kinase activity not to Cetuximab only. We have shown that p38MAPK is involved in response to the inhibition of EGFR activity via nuclear localization of FOXO3a. p53 protein has also a role in cetuximab response. Both seem to be predictive factors of response to cetuximab therapy.Le cetuximab est une thérapie ciblée dirigée contre le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) utilisée dans le cancer colorectal (CCR) en combinaison avec des chimiothérapies (5-FU, irinotécan et oxaliplatine). Sa fixation inhibe les voies de signalisation en aval du récepteur conduisant à une diminution de la prolifération et de la survie des cellules ciblées. Cependant, chez les patients atteint de CCR présentant une protéine KRAS mutée, le cetuximab est inefficace, de plus, la moitié des patients présentant une protéine KRAS wild-type ne répond pas non plus au cetuximab. Afin de découvrir des nouveaux biomarqueurs de sélection des patients qui pourraient bénéficier de ce traitement ou d'améliorer la réponse des patients, une meilleure connaissance des mécanismes d'action du cetuximab est nécessaire. Par exemple récemment, des études ont montré que la protéine p53 participait à la réponse au cetuximab. Il serait intéressant de savoir si le statut de cette protéine peut constituer un bon marqueur de réponse. Précédemment, nous avons montré que l'activation de la « mitogen activated protein kinase » p38 (MAPK p38) induit une résistance à l'irinotécan in vitro et in vivo et est un marqueur de non réponse à cette drogue. De plus, d'autres équipes ont montré que la MAPK p38 bloque également la réponse au 5-FU et participe à la cytotoxicité de l'oxaliplatine. Il semble alors que la MAPK p38 soit impliquée dans les mécanismes d'action des anti-tumoraux. Il est donc intéressant de savoir si la MAPK p38 participe également à la cytotoxicité des thérapies ciblées comme le cetuximab. Pour répondre à ces questions nous avons choisi de comparer deux lignées cellulaires de CCR KRAS wild-type mais au statut TP53 différent et qui répondent différemment au cetuximab: la lignée Caco2 (30% d'inhibition de la survie, TP53 muté) et la lignée DiFi (80% d'inhibition de la survie, TP53 sauvage). Nous avons effectué des tests de cytotoxicité combinant le cetuximab et l'inhibition transcriptionnelle ou pharmacologique de p38 ou l'inhibition transcriptionnelle de p53. Nous avons également testé l'apoptose et la prolifération induite par le cetuximab en l'absence de la MAPK p38 ou de p53. Enfin nous avons testé l'expression des gènes BIM, p27 et PUMA impliqués dans l'apoptose et la prolifération. Dans cette étude, nous avons démontré que la MAPK p38 et p53 participent à l'effet cytotoxique du cetuximab dans les cellules DiFi. En revanche, dans les cellules Caco2, la MAPK p38 bloque partiellement l'effet du cetuximab. Nous avons également montré l'implication de p38 et p53 dans l'apoptose induite par le cetuximab et l'implication de p38 dans l'inhibition de la prolifération. La protéine p38 est impliquée dans la régulation de ERK et dans la localisation nucléaire de FOXO3a responsable de l'expression des gènes BIM et p27. Enfin, nous avons montré que p38 a également un rôle dans le mécanisme d'action d'inhibiteurs de tyrosine kinase ciblant l'EGFR (lapatinib et erlotinib). Pour conclure, nous avons déterminé que p38 et p53 sont impliquées dans le mécanisme d'action du cetuximab. Nous avons décris l'implication de la voie p38-FOXO3a dans le mécanisme d'action du cetuximab. Enfin, p38 et p53 semblent être de bons biomarqueurs de réponse au cetuximab

Implication of p38 and p53 in cetuximab mechanism of action in colorectal cancer

Le cetuximab est une thérapie ciblée dirigée contre le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) utilisée dans le cancer colorectal (CCR) en combinaison avec des chimiothérapies (5-FU, irinotécan et oxaliplatine). Sa fixation inhibe les voies de signalisation en aval du récepteur conduisant à une diminution de la prolifération et de la survie des cellules ciblées. Cependant, chez les patients atteint de CCR présentant une protéine KRAS mutée, le cetuximab est inefficace, de plus, la moitié des patients présentant une protéine KRAS wild-type ne répond pas non plus au cetuximab. Afin de découvrir des nouveaux biomarqueurs de sélection des patients qui pourraient bénéficier de ce traitement ou d'améliorer la réponse des patients, une meilleure connaissance des mécanismes d'action du cetuximab est nécessaire. Par exemple récemment, des études ont montré que la protéine p53 participait à la réponse au cetuximab. Il serait intéressant de savoir si le statut de cette protéine peut constituer un bon marqueur de réponse. Précédemment, nous avons montré que l'activation de la « mitogen activated protein kinase » p38 (MAPK p38) induit une résistance à l'irinotécan in vitro et in vivo et est un marqueur de non réponse à cette drogue. De plus, d'autres équipes ont montré que la MAPK p38 bloque également la réponse au 5-FU et participe à la cytotoxicité de l'oxaliplatine. Il semble alors que la MAPK p38 soit impliquée dans les mécanismes d'action des anti-tumoraux. Il est donc intéressant de savoir si la MAPK p38 participe également à la cytotoxicité des thérapies ciblées comme le cetuximab. Pour répondre à ces questions nous avons choisi de comparer deux lignées cellulaires de CCR KRAS wild-type mais au statut TP53 différent et qui répondent différemment au cetuximab: la lignée Caco2 (30% d'inhibition de la survie, TP53 muté) et la lignée DiFi (80% d'inhibition de la survie, TP53 sauvage). Nous avons effectué des tests de cytotoxicité combinant le cetuximab et l'inhibition transcriptionnelle ou pharmacologique de p38 ou l'inhibition transcriptionnelle de p53. Nous avons également testé l'apoptose et la prolifération induite par le cetuximab en l'absence de la MAPK p38 ou de p53. Enfin nous avons testé l'expression des gènes BIM, p27 et PUMA impliqués dans l'apoptose et la prolifération. Dans cette étude, nous avons démontré que la MAPK p38 et p53 participent à l'effet cytotoxique du cetuximab dans les cellules DiFi. En revanche, dans les cellules Caco2, la MAPK p38 bloque partiellement l'effet du cetuximab. Nous avons également montré l'implication de p38 et p53 dans l'apoptose induite par le cetuximab et l'implication de p38 dans l'inhibition de la prolifération. La protéine p38 est impliquée dans la régulation de ERK et dans la localisation nucléaire de FOXO3a responsable de l'expression des gènes BIM et p27. Enfin, nous avons montré que p38 a également un rôle dans le mécanisme d'action d'inhibiteurs de tyrosine kinase ciblant l'EGFR (lapatinib et erlotinib). Pour conclure, nous avons déterminé que p38 et p53 sont impliquées dans le mécanisme d'action du cetuximab. Nous avons décris l'implication de la voie p38-FOXO3a dans le mécanisme d'action du cetuximab. Enfin, p38 et p53 semblent être de bons biomarqueurs de réponse au cetuximab.Cetuximab is used in colorectal cancer (CRC), as targeted therapy against the Epithelial Growth Factor receptor (EGFR), in association with chemotherapy (5-FU, oxaliplatin and irinotecan). Its binding inhibits signaling pathways downstream to the receptor leading to a decrease in proliferation and surviving. In KRAS mutated CRC patients, Cetuximab is ineffective, and half of KRAS Wild Type (WT) patients does not respond to Cetuximab either. Thus, a better knowledge of Cetuximab mechanism of action will help to improve response rate and to find new biomarkers of response. Recently, studies have shown that p53 protein is involved in the response to cetuximab. It would be interesting to know if the status of this protein could be a biomarker of response. Previously, we have shown that activation of the mitogen activated protein kinase p38 (p38MAPK) induces irinotecan resistance in vitro and in vivo and is a predictive factor of response to irinotecan. Moreover, others teams found that p38 MAPK also partially block 5-FU response and participate to oxaliplatin cytotoxicity. It seems that p38 is involved in mechanism of action of anti-tumor agent. The aim of our project is to determine, in KRAS WT colorectal cells, if p38 MAPK is involved as well in the cetuximab effect. In this aim, experiments were done on two KRAS WT CRC cell lines but with different p53 status which respond differently to Cetuximab: Caco2 cells (30% of survival inhibition, TP53 mutated) and DiFi cells (80% of survival inhibition, TP53 wild-type). Cytotoxic experiments combining cetuximab treatment and inhibition of p38MAPK or p53 by transcriptional inhibition or using a pharmacological inhibitor of p38 (SB202190) were performed. We assessed apoptosis and inhibition of proliferation by FACS analysis of cell cycle and DNA synthesis. In addition, BIM, PUMA and p27 expression were analyzed by QPCR and Western Blot. Our results showed that inhibition of p38MAPK enhances Cetuximab cytotoxic effect in Caco2 cells but impairs it in DiFi cells as inhibition of p53. We also observed that inhibition of p38 MAPK and p53 decreases cetuximab induced apoptosis and inhibition of p38 decrease anti-proliferative effect in DiFi cells. The prevention of cell death by SB202190 in cetuximab treated DiFi cells could be explained by ERK pathway activation and the decrease of FOXO3a nuclear localization leading to p27 and BIM expression decrease, respectively involved in cellular proliferation and mitochondrial apoptosis. Our results have shown the same inhibiting effect of SB202190 on the cytotoxic effect of two tyrosine-kinase inhibitors targeting EGFR (lapatinib and erlotinib) in DiFi cells indicating that p38MAPK implication is linked to inhibition of EGFR kinase activity not to Cetuximab only. We have shown that p38MAPK is involved in response to the inhibition of EGFR activity via nuclear localization of FOXO3a. p53 protein has also a role in cetuximab response. Both seem to be predictive factors of response to cetuximab therapy

Nucleolin Promotes Heat Shock-Associated Translation of VEGF-D to Promote Tumor Lymphangiogenesis.

The vascular endothelial growth factor VEGF-D promotes metastasis by inducing lymphangiogenesis and dilatation of the lymphatic vasculature, facilitating tumor cell extravasion. Here we report a novel level of control for VEGF-D expression at the level of protein translation. In human tumor cells, VEGF-D colocalized with eIF4GI and 4E-BP1, which can program increased initiation at IRES motifs on mRNA by the translational initiation complex. In murine tumors, the steady-state level of VEGF-D protein was increased despite the overexpression and dephosphorylation of 4E-BP1, which downregulates protein synthesis, suggesting the presence of an internal ribosome entry site (IRES) in the 5' UTR of VEGF-D mRNA. We found that nucleolin, a nucleolar protein involved in ribosomal maturation, bound directly to the 5'UTR of VEGF-D mRNA, thereby improving its translation following heat shock stress via IRES activation. Nucleolin blockade by RNAi-mediated silencing or pharmacologic inhibition reduced VEGF-D translation along with a subsequent constriction of lymphatic vessels in tumors. Our results identify nucleolin as a key regulator of VEGF-D expression, deepening understanding of lymphangiogenesis control during tumor formation. Cancer Res; 76(15); 4394-405. (c)2016 AACR

MAPK14/p38α confers irinotecan resistance to TP53-defective cells by inducing survival autophagy.: MAPK14/p38α induces survival autophagy

International audienceRecently we have shown that the mitogen-activated protein kinase (MAPK) MAPK14/p38α is involved in resistance of colon cancer cells to camptothecin-related drugs. Here we further investigated the cellular mechanisms involved in such drug resistance and showed that, in HCT116 human colorectal adenocarcinoma cells in which TP53 was genetically ablated (HCT116-TP53KO), overexpression of constitutively active MAPK14/p38α decreases cell sensitivity to SN-38 (the active metabolite of irinotecan), inhibits cell proliferation and induces survival-autophagy. Since autophagy is known to facilitate cancer cell resistance to chemotherapy and radiation treatment, we then investigated the relationship between MAPK14/p38α, autophagy and resistance to irinotecan. We demonstrated that induction of autophagy by SN38 is dependent on MAPK14/p38α activation. Finally, we showed that inhibition of MAPK14/p38α or autophagy both sensitizes HCT116-TP53KO cells to drug therapy. Our data proved that the two effects are interrelated, since the role of autophagy in drug resistance required the MAPK14/p38α. Our results highlight the existence of a new mechanism of resistance to camptothecin-related drugs: upon SN38 induction, MAPK14/p38α is activated and triggers survival-promoting autophagy to protect tumor cells against the cytotoxic effects of the drug. Colon cancer cells could thus be sensitized to drug therapy by inhibiting either MAPK14/p38 or autophagy

MAPK14/p38α confers irinotecan resistance to TP53-defective cells by inducing survival autophagy

International audienc

Targeting the p38 MAPK pathway inhibits irinotecan resistance in colon adenocarcinoma.: Activated p38 and chemoresistance

International audienceDespite recent advances in the treatment of colon cancer, tumor resistance is a frequent cause of chemotherapy failure. To better elucidate the molecular mechanisms involved in resistance to irinotecan (and its active metabolite SN38), we established SN38-resistant clones derived from HCT-116 and SW48 cell lines. These clones show various levels (6- to 60-fold) of resistance to SN-38 and display enhanced levels of activated MAPK p38 as compared with the corresponding parental cells. Because four different isoforms of p38 have been described, we then studied the effect of p38 overexpression or downregulation of each isoform on cell sensivity to SN38 and found that both α and β isoforms are involved in the development of resistance to SN38. In this line, we show that cell treatment with SB202190, which inhibits p38α and p38β, enhanced the cytotoxic activity of SN38. Moreover, p38 inhibition sensitized tumor cells derived from both SN38-sensitive and -resistant HCT116 cells to irinotecan treatment in xenograft models. Finally, we detected less phosphorylated p38 in primary colon cancer of patients sensitive to irinotecan-based treatment, compared with nonresponder patients. This indicates that enhanced level of phosphorylated p38 could predict the absence of clinical response to irinotecan. Altogether, our results show that the p38 MAPK pathway is involved in irinotecan sensitivity and suggest that phosphorylated p38 expression level could be used as a marker of clinical resistance to irinotecan. They further suggest that targeting the p38 pathway may be a potential strategy to overcome resistance to irinotecan-based chemotherapies in colorectal cancer