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Methylglyoxal metabolism in Leishmania infantum
Tese de doutoramento, Bioquímica (Regulação Bioquímica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010.Leishmaniasis, caused by a Leishmania parasite belonging to the Trypanosomatidae family,
are diseases affecting humans and other mammals. The most severe form of the disease is lethal if
untreated, currently existing no vaccines or efficient therapies. The identification of new therapeutic
targets is presently based on exploiting the biochemical differences between the parasite and the
host. One of the main biochemical characteristics distinguishing trypanosomatids from other
eukaryotic cells is the functional replacement of glutathione by trypanothione. In trypanosomatids,
the glyoxalase system, comprising the enzymes glyoxalase I and glyoxalase II, depends on
trypanothione to eliminate methylglyoxal, a toxic compound formed non-enzymatically during
glycolysis. Hence, this is an excellent model system to understand trypanothione-dependent
enzymes specificity at a kinetic and molecular level. The methylglyoxal metabolism in L. infantum
study would not be complete without an account of aldose reductase, a NADPH-dependent
enzyme also catabolising this toxic compound. This project includes an eclectic structural and
biochemical study of the main enzymes involved in methylglyoxal catabolism, contributing for the
knowledge of these complex parasites. Additionally, these enzymes’ activities complement each
other in such a way that they can be synergistically exploited in the quest for new anti-leishmanial
drug targets.
The glyoxalase I gene from Leishmania infantum (LiGLO1) was isolated and cloned into an
expression vector for bacteria. The recombinant protein was over-expressed in E. coli, purified and
kinetically characterised. LiGLO1 showed to preferentially use the hemithioacetal derived from
trypanothione, although it can also catalyse the same reaction with the glutathione-derived
hemithioacetal. The recombinant protein was crystallised and its structure solved by molecular
replacement, using the glyoxalase structure from L. major as a search model. Although the LiGLO1
structure is very similar to the L. major GLO1, as expected by its high homology, the metal observed
at the active site is different. While LmGLO1 requires nickel for its activity, like glyoxalase I from
prokaryotes, it was shown both by ICP and anomalous diffraction that LiGLO1 contains zinc in the
active site, as its eukaryotic homologues. On the other hand, LiGLO1 has significant structural
differences relatively to the human glyoxalase I enzyme.
The glyoxalase II gene from L. infantum (LiGLO2) was also isolated and cloned in a bacterial
expression vector. The recombinant protein was over-expressed in E. coli, purified and kinetically
characterised, confirming its specificity towards trypanothione-derived thiolesters. LiGLO2 was
crystallised and its structure solved by molecular replacement, using the glutathione-dependent human glyoxalase II structure as a search model, for its high sequence homology with the
structurally unknown L. infantum protein. The determined structural model for LiGLO2 is very
similar to its human counterpart. Highly conserved residues were identified in the active site, as
well as specific residues of the L. infantum enzyme, being noteworthy the presence of the
spermidine-binding Cys294 and Ile171, both absent from the human enzyme. The presence of a
spermidine molecule on the LiGLO2 substrate binding site, together with sequence analysis,
clarified the enzyme’s substrate specificity at a molecular level. Both ICP metal-analysis and the B
factor values for the metal atoms revealed the presence of zinc and/or iron in the enzyme active
site. A structure with D-lactate in the active site was obtained by crystal soaking with substrate.
Superimposing both LiGLO2 structures, the localization of the trypanothione-derived thiolester in
the substrate-binding site could be clearly inferred. Two of the residues forming the substrate-
binding pocket, Tyr291 and Cys294, were subsequently replaced by the S-D-lactoylglutathione-
binding residues found on the human enzyme, Arg249 and Lys252, respectively. Recombinant
mutated LiGLO2 was over-expressed in E. coli. Kinetic analysis revealed that the enzyme’s
substrate specificity was changed, catalysing the reaction with S-D-lactoylglutathione, and loosing
affinity towards S-D-lactoyltrypanothione. These results show that the mutated residues are critical
for the enzyme specificity.
The aldose reductase gene from L. infantum (LiAKR) was identified for the first time in a
trypanosomatid. It was isolated and cloned into an expression vector. Over-expression of the
soluble recombinant protein in E. coli was only achieved by co-expression with chaperone systems.
The LiAKR enzyme was kinetically characterised as a NADPH-dependent aldose reductase
involved in the catabolism of methylglyoxal. This protein was recently crystallised, although the
observed diffraction requires crystal optimization.Leishmanioses são doenças que afectam humanos e outros mamíferos, provocadas por um
parasita do género Leishmania, pertencente à família Trypanosomatidae. A forma mais severa da
doença é letal se não for tratada, não existindo actualmente vacinas ou terapias curativas eficazes. A
identificação de novos alvos terapêuticos baseia-se em diferenças encontradas entre o parasita e o
hospedeiro. Uma das principais características bioquímicas que distingue os tripanossomatídeos de
outras células eucariotas é a substituição funcional de glutationo por tripanotiono. Em
tripanossomatídeos, o sistema dos glioxalases, constituído pelos enzimas glioxalase I e glioxalase II,
depende de tripanotiono para eliminar o metilglioxal, um composto tóxico formado nãoenzimaticamente
durante a glicólise. Assim, este é um excelente sistema modelo para compreender a
especificidade de enzimas dependentes de tripanotiono a um nível cinético e molecular. No entanto,
o estudo do metabolismo do metilglioxal em L. infantum não estaria completo sem referir o aldose
redutase, um enzima dependente de NADPH que também catabolisa este composto tóxico. Este
projecto inclui um estudo estrutural e bioquímico eclético dos principais enzimas envolvidos no
catabolismo do metilglioxal, contribuindo para o estudo destes complexos parasitas. Para além
disso, as actividades destes enzimas são de tal modo complementares que podem ser exploradas
sinergisticamente na busca por novos alvos para fármacos anti-leishmania.
O gene do glioxalase I de Leishmania infantum foi isolado e clonado num vector de expressão. A
proteína recombinante foi sobre-expressa em E. coli, purificada e caracterizada cineticamente, verificando-se
que o LiGLO1 catalisa preferencialmente o hemitioacetal derivado de tripanotiono, embora também possa
utilizar o hemitioacetal derivado de glutationo. A proteína recombinante foi cristalizada e a sua estrutura
resolvida por substituição molecular, utilizando a estrutura do glioxalase I de L. major como modelo de
pesquisa. Embora a estrutura do LiGLO1 seja muito semelhante à do LmGLO1, como esperado pela sua
elevada homologia de 97 %, estes enzimas diveregem no metal presente no centro activo. Enquanto o
LmGLO1 requer níquel para a sua actividade, à semelhança dos glioxalases I de procariotas, foi verificado
tanto por ICP como por difracção anómala, que o LiGLO1 contém zinco no seu centro activo, à semelhança
dos seus homólogos eucariotas. Estes resultados permitiram-nos estabelecer uma diferença entre ambas as
espécies de Leishmania, e propor uma hipótese em que o enzima de L. infantum terá divergido dos procariotas
mais cedo na linha evolutiva do que o enzima de L. major. Por outro lado, LiGLO1 tem grandes diferenças
estruturais em relação ao homólogo humano.
O glioxalase II de L. infantum foi também isolado e clonado num vector de expressão. A proteína
recombinante foi sobre-expressa em E. coli, purificada e caracterizada cineticamente, confirmando-se a sua
especificidade para os tioésteres derivados de tripanotiono. LiGLO2 foi cristalizado e a sua estrutura resolvida por substituição molecular, utilizando a estrutura do glioxalase II humano, dependente de glutationo, como
modelo de pesquisa. O modelo da estrutura determinado para o LiGLO2 é muito semelhante ao do seu
homólogo humano. Foram identificados resíduos conservados no centro activo (His76, His78, Asp80, His81,
His139, Asp164, His210) bem como resíduos específicos no enzima de L. infantum (dos quais é de salientar a
presença da Cys294 e Ile171, que ligam a espermidina e a ausência dos resíduos Arg249, Lys143 e Lys252,
existentes no enzima humano). A presença de uma molécula de espermidina no local de ligação ao substrato
do LiGLO2, juntamente com uma análise das sequências, elucidou a especificidade do substrato do enzima ao
nível molecular. Tanto a análise de metais por ICP, como os valores dos factores B dos átomos de metal,
revelaram a presença de zinco e/ou ferro no centro activo do enzima. Foi obtido um modelo estrutural deste
enzima com D-lactato no centro activo, através de soaking de cristais com substrato. Sobrepondo ambas as
estruturas do LiGLO2, pôde ser claramente inferida a localização do tioester derivado de tripanotiono no
centro de ligação ao substrato. Dois dos resíduos que formam a cavidade onde se liga o substrato, Tyr291 e
Cys294, foram subsequentemente substituídos por resíduos que ligam o S-D-lactoilglutationo no enzima
humano, Arg249 e Lys252, respectivamente. O LiGLO2 mutado recombiante foi sobre-expresso em E. coli.
Este enzima mutado foi instável durante o processo de purificação. Análise cinética revelou que a
especificidade do enzima para o substrato foi alterada, reagindo com S-D-lactoilglutationo e perdendo
actividade para o S-D-lactoiltripanotiono. Estes resultados mostram que os resíduos mutados são críticos para
a especificidade do enzima.
O gene do aldose redutase de L. infantum foi identificado pela primeira vez num tripanossomatídeo.
Foi isolado e clonado num vector de expressão. A sobre-expressão da proteína recombinante na fracção
solúvel em E. coli foi apenas conseguida por co-expressão com sistemas de chaperones. O enzima LiAKR foi
cineticamente caracterizado como um aldose redutase dependente de NADPH envolvido no catabolism do
metilglioxal. Esta proteína foi recentemente cristalizada, embora a difracção observada requeira optimização
dos cristais.Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), SFRH/BD/28691/2006; European Molecular Biology Organization (EMBO
Educação para os media: as notícias das escolas do ensino básico na imprensa regional
A educação para os media tem sido alvo de vários estudos e mote para vários trabalhos e
projetos, sobretudo envolvendo crianças e jovens. Esta atenção sobre a educação para os
media intensificou-se desde a Declaração de Gründwald (1982), que já defendia a introdução
da disciplina em todos os níveis de ensino, a formação de professores nesta área e o
fortalecimento de laços de cooperação internacional. Estas são recomendações reiteradas até
aos nossos dias, faltando, contudo, a sua implementação em pleno no terreno.
O jornalismo escolar é uma das formas de expressão desta educação para os media, pois
quanto maior for a compreensão e consciência dos mais jovens, em relação aos conteúdos que
consomem, maior será a qualidade da produção dos seus próprios conteúdos.
Por sua vez, a imprensa regional também pode fomentar esta ferramenta de educação não
formal, divulgando as atividades das escolas e dando voz a crianças e jovens.
Neste trabalho procurámos contribuir para esta discussão com um estudo de caso no distrito
de Castelo Branco. Desenvolvido o enquadramento teórico do tema - a educação para os
media - analisa-se a forma como os jornais regionais de maior tiragem do distrito,
nomeadamente o Reconquista, o Gazeta do Interior, o Jornal do Fundão e o Notícias da
Covilhã tratam as notícias das escolas do Ensino Básico.
O objetivo foi verificar se entre 2007 e 2011, período em que decorreu o Projeto Educação
para os Media no Distrito de Castelo Branco, houve variação em termos de número de notícias
publicadas nestes jornais, variação de géneros e temas e o destaque que é dado a este tipo
de conteúdos. Procurou-se ainda verificar se os responsáveis por estas publicações dão
importância à educação para os media ou se desvalorizam os conteúdos escolares.
Os resultados permitem verificar que, apesar de não ter havido uma variação significativa no
número de notícias publicadas, nem mesmo em relação aos géneros e temas, os responsáveis
dos quatro jornais são consensuais ao afirmar que as notícias que chegam às redações
provenientes das escolas do Ensino Básico merecem ser analisadas e, caso se justifique,
publicadas com maior destaque. Reconhecem também que a educação para os media é
importante para fomentar o sentido crítico e os hábitos de leitura entre os mais jovens.Media education has been the subject of several studies and the theme of various researches
and projects, particularly involving children and young people. This focus on media education
was intensified since the Declaration of Grundwald (1982), that stands for the introduction of
this subject in the curricula of all levels of education, the promotion of teacher training, as
well as the strengthen of international cooperation. These recommendations have been
repeated until today, however they haven’t been implemented yet. Journalism at school is a
way to promote media education, if students can understand and are aware of the media
products they access, they will easier produce their own.
Local press can also promote non-formal education, promoting the activities of schools,
publishing the students’ media products.
This project aims the discussion of this subject through a case study in the district of Castelo
Branco.
After a theoretical background on the topic media education, we analyze the way local
newspapers, with the largest circulation in the district of Castelo Branco, including
Reconquista, Gazeta do Interior, Jornal do Fundão and Notícias da Covilhã, deal with the
news produced at Primary and Secondary Schools. The main purpose of was to check any
variations on the number, type and themes of the news published in local newspapers during
the period of the project Educação para os Media no Distrito de Castelo Branco, between
2007-2011, as well as to verify the emphasis given to these media products. In addition, we
also looked into the way media education is faced by publishers of local press.
It appears that, there was no significant variation in the number, type and theme of the news
that were published, the publishers of the four papers agree that the school news that reach
their newspapers deserve an analysis and sometimes they are published with prominence.
They also recognize that media education is important to develop critical awareness and
reading habits amongst young people
As potencialidades do livro adaptado e da canção no sistema SPC em crianças com NEE : estudo piloto
O grande desafio da Escola de hoje é dar resposta às necessidades dos alunos, passando pela fusão do sistema de ensino regular e do sistema de ensino especial. Inclusão é a palavra de ordem quando ouvimos falar em educação. As tecnologias de informação e comunicação são aplicadas no sentido de melhorar a qualidade de vida de alunos com Necessidades Educativas Especiais, garantindo uma igualdade de oportunidades, que levará ao sucesso educativo. Conscientes de que a comunicação é fundamental na vida de qualquer ser, este artigo reflete uma abordagem de investigação de alunas do Mestrado do Curso de Ensino Especial no Domínio Cognitivo e Motor da Escola Superior de Educação do Instituto Politécnico de Castelo Branco sobre a Promoção da Comunicação Expressiva em Sujeitos com Necessidades Educativas Especiais, recorrendo a um Sistema Alternativo de Comunicação, nomeadamente o Sistema de Símbolos Pictográficos para a Comunicação. Este estudo piloto teve lugar numa parceria entre a entidade formadora e a Associação Portuguesa de Pais e Amigos do Cidadão Deficiente Mental de Castelo Branco. Neste estudo, procuramos analisar o efeito que produz a leitura de uma história adaptada no Sistema de Símbolos Pictográficos para a Comunicação e numa canção, comparada com a leitura da história analógica e avaliar a importância do livro adaptado no Sistema de Sistema de Símbolos Pictográficos para a Comunicação para a literacia de crianças de Necessidades Educativas Especiais. Pretendeu-se ainda verificar o impacto dos recursos digitais, aferindo a existência ou não de diferenças ao nível da motivação, curiosidade, compreensão por parte das crianças. Consideramos que o sistema de Símbolos Pictográficos para a Comunicação, é um suporte tecnológico que contribui para o desenvolvimento de competências comunicativas, desenvolvimento da linguagem e da literacia, minimizando as barreiras de comunicação e beneficiando as crianças com necessidades educativas especiais, com uma maior e melhor interação social.info:eu-repo/semantics/publishedVersio
In Vitro Analysis of the Interaction between Atovaquone and Proguanil against Liver Stage Malaria Parasites
International audienceThe interaction between atovaquone and proguanil has never been studied against liver stage malaria, which is the main target of this drug combination when used for chemoprevention. Using human hepatocytes lacking cytochrome P450 activity, and thus avoiding proguanil metabolizing into potent cycloguanil, we show in vitro that the atovaquone-proguanil combination synergistically inhibits the growth of rodent Plasmodium yoelii parasites. These results provide a pharmacological basis for the high efficacy of atovaquone-proguanil used as malaria chemoprevention
Biotransformation modulation and genotoxicity in white seabream upon exposure to paralytic shellfish toxins produced by Gymnodinium catenatum
Fish are recurrently exposed to paralytic shellfish toxins (PSTs) produced by Gymnodinium catenatum. Nevertheless, the knowledge regarding metabolism of PSTs and their toxic effects in fish is scarce. Consequently, the current study aims to investigate the role of phase I and II detoxification enzymes on PST metabolism in the liver of white seabream (Diplodus sargus), assessing ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) and glutathione S-transferase (GST) activities. Moreover, the genotoxic potential of PSTs was examined through the erythrocytic nuclear abnormality (ENA) assay. Fish were intracoelomically (IC) injected with a nominal dose (expressed as saxitoxin equivalents) of 1.60 μg STXeq kg⁻¹ semipurified from a G. catenatum cell culture with previously determined toxin profile. Fish were sacrificed 2 and 6 days after IC injection. PST levels determined in fish liver were 15.2 and 12.2 μg STXeq kg⁻¹, respectively, at 2 and 6 days after the injection. Though several PSTs were administered, only dcSTX was detected in the liver after 2 and 6 days. This was regarded as an evidence that most of the N-sulfocarbamoyl and decarbamoyl toxins were rapidly biotransformed in D. sargus liver and/or eliminated. This was corroborated by a hepatic GST activity induction at 2 days after injection. Hepatic EROD activity was unresponsive to PSTs, suggesting that these toxins enter phase II of biotransformation directly. The genotoxic potential of PSTs was also demonstrated; these toxins were able to induce cytogenetic damage, such as chromosome (or chromatid) breaks or loss and segregational anomalies, measured by the ENA assay. Overall, this study pointed out the ecological risk associated with the contamination of fish with PSTs generated by G. catenatum blooms, providing the necessary first data for a proper interpretation of biomonitoring programs aiming to assess the impact of phytoplankton blooms in fish.Authors greatly appreciated the helpful assistance of Pedro Lino in injection of fish.publishe
Purification, crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the glyoxalase II from Leishmania infantum
A glyoxalase II from L. infantum was cloned, purified and crystallized and its structure was solved by X-ray crystallography