NPC1 regulates the distribution of phosphatidylinositol 4-kinases at Golgi and lysosomal membranes

Cholesterol and phosphoinositides (PI) are two critically important lipids that are found in cellular membranes and dysregulated in many disorders. Therefore, uncovering molecular pathways connecting these essential lipids may offer new therapeutic insights. We report that loss of function of lysosomal Niemann-Pick Type C1 (NPC1) cholesterol transporter, which leads to neurodegenerative NPC disease, initiates a signaling cascade that alters the cholesterol/phosphatidylinositol 4-phosphate (PtdIns4P) countertransport cycle between Golgi-endoplasmic reticulum (ER), as well as lysosome-ER membrane contact sites (MCS). Central to these disruptions is increased recruitment of phosphatidylinositol 4-kinases-PI4KIIα and PI4KIIIβ-which boosts PtdIns4P metabolism at Golgi and lysosomal membranes. Aberrantly increased PtdIns4P levels elevate constitutive anterograde secretion from the Golgi complex, and mTORC1 recruitment to lysosomes. NPC1 disease mutations phenocopy the transporter loss of function and can be rescued by inhibition or knockdown of either key phosphoinositide enzymes or their recruiting partners. In summary, we show that the lysosomal NPC1 cholesterol transporter tunes the molecular content of Golgi and lysosome MCS to regulate intracellular trafficking and growth signaling in health and disease

Signalisation calcique et couplage excitation-contraction dans le muscle squelettique : modulation par certains phosphoinositides et altérations associées dans deux myopathies centronucléaires

Excitation-contraction (EC) coupling is the process whereby a membrane depolarization leads to an increased cytosolic Ca2+ content, allowing contraction. Mutations in the genes MTM1 and DNM2 are responsible respectively for severe and moderate forms of centronuclear myopathy (CNM). In Mtm1 KO mouse model, MTM deficiency is associated with defective EC coupling, which makes probably the major contribution to muscle meakness.PdtIns(4,5)P2 involvement in regulating EC coupling has been investigated in muscle fibers expressing a voltage sensing PtdInsP phosphatase. Thanks to a combination of electrophysiology and confocal imaging techniques, we showed a reduction of SR Ca2+ release amplitude in response to strong depolarizations activating PdtIns(4,5)P2 depletion at plasma membrane.Secondly, we made a complete characterization of calcium signaling and EC coupling properties in isolated muscle fibers from Mtm1 KO mice. Our results demonstrate that SR Ca2+ release is depressed, delayed and spatially heterogeneous in diseased fibers. Moreover, we showed that pharmacological inhibition of PtdInsP 3-kinase activity improves these defects in vitro and mice survival in vivo, suggesting that accumulation of MTM1 substrates may participate to defective EC coupling. Overall, these results provide proof of concept for the use of PtdIns 3-kinase inhibitors in severe form of CNM.Finally, we showed that muscle fibers from murine model of moderate CNM form (KI-Dnm2R465W) share some of EC coupling defects with Mtm1 KO model (delayed SR Ca2+ release) that may contribute to muscle weakness. However, other defects (structural alterations, depressed SR Ca2+ release) affect more severely Mtm1 KO model, and may be critical in determining the severity of CNMLe couplage excitation-contraction (EC) du muscle squelettique correspond à l’efflux de Ca2+ par le réticulum sarcoplasmique (RS) suite à une dépolarisation sarcolemmale. Des mutations dans les gènes MTM1 et DNM2 sont responsables respectivement de la forme sévère et modérée de la myopathie centronucléaire (CNM). Chez la souris Mtm1 KO, l’absence de la (PtdInsP) 3-phosphatase MTM1 est associée à une altération du couplage EC, propablement la cause majeure de la faiblesse musculaire. Le rôle du PdtIns(4,5)P2 dans la régulation du couplage EC a été étudié dans des fibres musculaires exprimant une PtdInsP phosphatase sensible au potentiel. Grâce à une combinaison d’électrophysiologie et d’imagerie confocale, nous avons montré une altération de l’efflux calcique en réponse à de fortes dépolarisations déplétant les stocks de PdtIns(4,5)P2 à la membrane.Dans un deuxième temps, une caractérisation complète des défauts de signalisation calcique et du couplage EC a été réalisée dans les fibres musculaires isolées de souris Mtm1 KO. Nos résultats indiquent que l’efflux calcique est d’amplitude réduite, est retardé et est spatialement hétérogène. L’inhibition pharmacologique de l’activité PtdInsP 3-kinase améliore ces défauts in vitro et la survie des souris in vivo, suggérant que l’accumulation des substrats de MTM1 participe au défaut du couplage EC. Ces résultats montrent le bénéfice thérapeutique d’une approche pharmacologique aux inhibiteurs d’activité PtdInsP 3-kinase.Enfin, nous avons montré que les fibres musculaires d’un modèle murin de la forme modérée de CNM (KI-Dnm2R465W) partagent certaines altérations du couplage EC avec le modèle Mtm1 KO (retard de l’efflux calcique) pouvant contribuer à la faiblesse musculaire. Cependant, d’autres défauts (altérations structurales, réduction de l’efflux calcique) affectent plus sévèrement le modèle Mtm1 KO, et pourraient être déterminants dans la différence de sévérité entre les deux formes de CN

Calcium signaling and excitation-contraction coupling in skeletal muscle : modulation by some phosphoinositides and related alterations in two centronuclear myopathies

Le couplage excitation-contraction (EC) du muscle squelettique correspond à l’efflux de Ca2+ par le réticulum sarcoplasmique (RS) suite à une dépolarisation sarcolemmale. Des mutations dans les gènes MTM1 et DNM2 sont responsables respectivement de la forme sévère et modérée de la myopathie centronucléaire (CNM). Chez la souris Mtm1 KO, l’absence de la (PtdInsP) 3-phosphatase MTM1 est associée à une altération du couplage EC, propablement la cause majeure de la faiblesse musculaire. Le rôle du PdtIns(4,5)P2 dans la régulation du couplage EC a été étudié dans des fibres musculaires exprimant une PtdInsP phosphatase sensible au potentiel. Grâce à une combinaison d’électrophysiologie et d’imagerie confocale, nous avons montré une altération de l’efflux calcique en réponse à de fortes dépolarisations déplétant les stocks de PdtIns(4,5)P2 à la membrane.Dans un deuxième temps, une caractérisation complète des défauts de signalisation calcique et du couplage EC a été réalisée dans les fibres musculaires isolées de souris Mtm1 KO. Nos résultats indiquent que l’efflux calcique est d’amplitude réduite, est retardé et est spatialement hétérogène. L’inhibition pharmacologique de l’activité PtdInsP 3-kinase améliore ces défauts in vitro et la survie des souris in vivo, suggérant que l’accumulation des substrats de MTM1 participe au défaut du couplage EC. Ces résultats montrent le bénéfice thérapeutique d’une approche pharmacologique aux inhibiteurs d’activité PtdInsP 3-kinase.Enfin, nous avons montré que les fibres musculaires d’un modèle murin de la forme modérée de CNM (KI-Dnm2R465W) partagent certaines altérations du couplage EC avec le modèle Mtm1 KO (retard de l’efflux calcique) pouvant contribuer à la faiblesse musculaire. Cependant, d’autres défauts (altérations structurales, réduction de l’efflux calcique) affectent plus sévèrement le modèle Mtm1 KO, et pourraient être déterminants dans la différence de sévérité entre les deux formes de CNMExcitation-contraction (EC) coupling is the process whereby a membrane depolarization leads to an increased cytosolic Ca2+ content, allowing contraction. Mutations in the genes MTM1 and DNM2 are responsible respectively for severe and moderate forms of centronuclear myopathy (CNM). In Mtm1 KO mouse model, MTM deficiency is associated with defective EC coupling, which makes probably the major contribution to muscle meakness.PdtIns(4,5)P2 involvement in regulating EC coupling has been investigated in muscle fibers expressing a voltage sensing PtdInsP phosphatase. Thanks to a combination of electrophysiology and confocal imaging techniques, we showed a reduction of SR Ca2+ release amplitude in response to strong depolarizations activating PdtIns(4,5)P2 depletion at plasma membrane.Secondly, we made a complete characterization of calcium signaling and EC coupling properties in isolated muscle fibers from Mtm1 KO mice. Our results demonstrate that SR Ca2+ release is depressed, delayed and spatially heterogeneous in diseased fibers. Moreover, we showed that pharmacological inhibition of PtdInsP 3-kinase activity improves these defects in vitro and mice survival in vivo, suggesting that accumulation of MTM1 substrates may participate to defective EC coupling. Overall, these results provide proof of concept for the use of PtdIns 3-kinase inhibitors in severe form of CNM.Finally, we showed that muscle fibers from murine model of moderate CNM form (KI-Dnm2R465W) share some of EC coupling defects with Mtm1 KO model (delayed SR Ca2+ release) that may contribute to muscle weakness. However, other defects (structural alterations, depressed SR Ca2+ release) affect more severely Mtm1 KO model, and may be critical in determining the severity of CN

L’inhibition de l’activité PtdIns 3-kinase : un traitement pharmacologique potentiel de la myopathie myotubulaire

La myopathie myotubulaire est une maladie pédiatrique fatale due à des mutations dans le gène codant la myotubularine (MTM1), une phosphoinositide 3-phosphatase. Elle se caractérise par une faiblesse musculaire très sévère à la naissance ainsi qu’une détresse respiratoire limitant l’espérance de vie à moins d’un an pour la plupart des patients. Le modèle murin déficient en MTM1 (Mtm1-KO) reproduit les principales caractéristiques de la pathologie humaine, dont une faiblesse musculaire conduisant à la mort des animaux autour de 8 semaines. Dans un récent travail, nous avons identifié pour la première fois des altérations de fonction des cellules musculaires de souris Mtm1-KO qui jouent un rôle critique dans la physiopathologie de la maladie. De plus, nous avons révélé le bénéfice d’un traitement pharmacologique. Plus précisément, nous avons démontré que les altérations de signalisation calcique associées à la maladie sont hétérogènes au niveau subcellulaire, et qu’elles affectent non seulement l’amplitude mais aussi les cinétiques d’activation du flux de calcium qui génère la contraction. Nous avons par ailleurs montré que l’inhibition pharmacologique de l’activité phosphoinositide 3-kinase corrige de manière très substantielle les défauts de signalisation calcique in vitro et prolonge l’espérance de vie des souris déficientes en MTM1. La perturbation du métabolisme des phosphoinositides joue donc un rôle critique dans la pathologie et nos résultats fournissent une preuve de concept de bénéfice thérapeutique d’une approche pharmacologique

Spatially Localized Disruptions of Voltage Activated Calcium Release in Mtm1-Deficient Muscle Fibers

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Preserved Ca2+ signaling and excitation-contraction coupling in muscle fibers from Bin1 exon-11 knockout mice.

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Mathematical Model to Simulate Sr Calcium Release in Mammalian Skeletal Muscle with Impaired T-Tubular Structure

L

Mathematical model to simulate SR calcium release in mammalian skeletal muscle with impaired t-tubular structure.

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