Spatio-temporal propagation of Ca2+ signals by cyclic ADP-ribose in 3T3 cells stimulated via purinergic P2Y receptors

The role of cyclic ADP-ribose in the amplification of subcellular and global Ca2+ signaling upon stimulation of P2Y purinergic receptors was studied in 3T3 fibroblasts. Either (1) 3T3 fibroblasts (CD38− cells), (2) 3T3 fibroblasts preloaded by incubation with extracellular cyclic ADP-ribose (cADPR), (3) 3T3 fibroblasts microinjected with ryanodine, or (4) 3T3 fibroblasts transfected to express the ADP-ribosyl cyclase CD38 (CD38+ cells) were used. Both preincubation with cADPR and CD38 expression resulted in comparable intracellular amounts of cyclic ADP-ribose (42.3 ± 5.2 and 50.5 ± 8.0 pmol/mg protein). P2Y receptor stimulation of CD38− cells yielded a small increase of intracellular Ca2+ concentration and a much higher Ca2+ signal in CD38-transfected cells, in cADPR-preloaded cells, or in cells microinjected with ryanodine. Confocal Ca2+ imaging revealed that stimulation of ryanodine receptors by cADPR or ryanodine amplified localized pacemaker Ca2+ signals with properties resembling Ca2+ quarks and triggered the propagation of such localized signals from the plasma membrane toward the internal environment, thereby initiating a global Ca2+ wave

Analysis of subcellular calcium signals and characterisation of ryanodine receptor induced signals in T lymphocytes and 3T3 fibroblasts

Subzelluläre Ca2+ Signale werden durch die Ca2+ Freisetzung aus intrazellulären Speichern, die über die Second-Messenger IP3, cADPR und NAADP aktiviert werden, erzeugt. Während der Pacemaker-Phase werden diese subzellulären Ca2+ Signale amplifiziert, überschreiten dann einen Ca2+ Schwellenwert und führen zur Entwicklung eines globalen Ca2+ Signals. Sowohl subzelluläre als auch globale Ca2+ Signale sind je nach Zelltyp und physiologischer Antwort für die weitere Signaltransduktion unerlässlich. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst die Auswertung zur Analyse der subzellulären Ca2+ Signale so optimiert, dass diese Signale über die Parameter Durchmesser, Amplitude und Frequenz charakterisiert werden konnten. Die subzellulären Ca2+ Signale während der Pacemaker-Phase wurden in Jurkat und peripheren T-Lymphozyten analysiert und lokalisiert. Dabei hat der Einstrom von Ca2+ aus dem extrazellulären Raum kaum Einfluss auf die subzellulären Signale, allein die Entstehung des globalen Ca2+ Signals wird deutlich verzögert. Protein-Lokalisationsstudien deuten darauf hin, dass die am Zellrand und im Cytosol analysierten Pacemaker-Signale von IP3R und RyR stammen. Um die Rezeptoren (IP3R/RyR), die für die subzellulären Ca2+ Signale verantwortlich sind, genauer zu definieren, wurde einerseits mit Inhibitoren gearbeitet, andererseits die Rolle des Typ 3 RyR für die Amplifikation der subzellulären Ca2+ Signale vergleichend in Typ 3 RyR knock-down T-Zellen und entsprechenden Kontrollzellen analysiert. Sowohl nach physiologischer Stimulation (anti-CD3) als auch nach spezifischer Stimulation des RyR (cADPR, cADPR Analogon) war die Signalfrequenz in den knock-down T-Zellen insbesondere im Cytosol erniedrigt. Eine ähnlich signifikante Frequenzverringerung im Cytosol wurde in den Kontrollzellen durch die Hemmung des cADPR/RyR-Signalwegs hervorgerufen. Eine signifikante Abnahme der Frequenz der subzellulären Ca2+ Signale wurde außerdem nach der Blockierung des IP3R beobachtet. Eine Reduktion der Frequenz und Amplitude der subzellulären Ca2+ Signale wurde auch während der langanhaltenden Plateau-Phase in den Typ 3 RyR knock-down Zellen nach physiologischer Stimulation gefunden. Alternativ zu den T-Lymphozyten wurde in 3T3 Fibroblasten der Maus die Rolle von cADPR in Bezug auf die subzellulären Ca2+ Signale während der Pacemaker-Phase und die Entwicklung der globalen Ca2+ Welle charakterisiert. Bei Anwesenheit von intrazellulärem cADPR entwickelten die subzellulären Ca2+ Signale während der Pacemaker-Phase eine signifikant höhere Amplitude und Frequenz und trugen maßgeblich zur globalen Ca2+ Welle bei. Zum ersten Mal wurden innerhalb dieser Arbeit subzelluläre Ca2+ Signale in T-Lymphozyten und 3T3 Fibroblasten analysiert, charakterisiert und subzellulär lokalisiert. In T-Lymphozyten wurde die Bedeutung des Typ 3 RyR für die Entwicklung der lokalen Ca2+ Signale im Cytosol aufgeklärt: der Typ 3 RyR ist im inneren Cytosol für die Amplifikation der lokalen subzellulären Ca2+ Signale, die am Zellrand gebildet werden, verantwortlich und bewirkt somit das Entstehen der globalen Ca2+ Welle in den Kern. Diese Aussagen wurden durch die Ergebnisse mit den 3T3 Fibroblasten bestätigt, denn nur in Anwesenheit von cADPR, das die Ca2+ Freisetzung über den RyR stimuliert, können subzelluläre Ca2+ Signale von ausreichender Amplitude und Frequenz generiert werden, sodass sich eine globale Ca2+ Welle über die Zellen ausbreiten kann. Die Pacemaker-Signale in 3T3 Zellen stimmen bezüglich Amplitude und Durchmesser in etwa mit den Ca2+-Quarks überein, die subzelluläre Ca2+ Signale aufgrund der Öffnung eines oder weniger RyR darstellen. In T-Lymphozyten und Fibroblasten ist mit dieser Arbeit die entscheidende Rolle der subzellulären Ca2+ Signale im cADPR/RyR Signalweg aufgeklärt worden. So bietet es sich an, modulierende Pharmaka schon auf der Ebene der subzellulären Signale einzusetzen, da der Verlauf des globalen Signals von der Amplifikation der subzellulären Pacemaker-Signale abhängt.Subcellular Ca2+ signals are generated by Ca2+ release from intracellular stores by the second messengers IP3, cADPR, and NAADP. These subcellular signals are amplified during the pacemaker phase, pass a threshold [Ca2+]i, and finally develop into a global Ca2+ signal. Local and global Ca2+ signals in general are imperative for further signal transduction. In this thesis, data acquisition and off-line analysis of subcellular Ca2+ signals by digital confocal Ca2+ imaging was optimised to characterise signal diameters, amplitudes , and frequencies. Subcellular Ca2+ signals during the pacemaker phase were analysed and localised in Jurkat and peripheral T lymphocytes. Transmembrane Ca2+ influx from the extracellular space did not influence the subcellular signalling, except that the development of the global Ca2+ signal was clearly delayed. Protein localisation studies indicate that pacemaker signals near the edge of the cell and in the cytosol are generated by IP3R and RyR. Type 3 RyR knock-down T cells were compared to control cells to elucidate a function of type 3 RyR in the amplification of subcellular Ca2+ signals. Furthermore, different inhibitors were used to characterise in detail the role of both IP3R and RyR in the generation of subcellular Ca2+ signals. After physiological stimulation using anti-CD3 as well as after specific stimulation of the RyR using cADPR or a cADPR analogue the frequency of single Ca2+ signals was significantly diminished in the cytosolic region of the knock-down T-cells. A similar significant reduction of the frequency in the cytosol was achieved in the control cell by pharmacological blocking the cADPR/RyR signalling pathway. Furthermore, a significant decrease of the frequency of subcellular Ca2+ signals was observed after blocking the IP3R. In addition, subcellular signals were reduced during the longlasting plateau phase in type 3 RyR knock-down cells after physiological stimulation. In comparison to the T lymphocytes, the role of cADPR in mouse 3T3 fibroblasts was characterised concerning the subcellular Ca2+ signals during the pacemaker phase and the development of the global Ca2+ wave. In the presence of intracellular cADPR during the pacemaker phase, the subcellular Ca2+ signals showed significantly higher amplitudes and frequencies and substantially contributed to the global Ca2+ wave. For the first time, in the current thesis subcellular Ca2+ signals were analysed, characterised and localised in T lymphocytes and 3T3 fibroblasts. In T lymphocytes the importance of the type 3 RyR in generation of local Ca2+ signals was elucidated: in the inner cytosol the type 3 RyR is responsible for the amplification of local subcellular Ca2+ signals generated near the edge of the cell, and causes the formation of a global Ca2+ wave towards the nucleus. These findings were supported by the results from 3T3 fibroblasts since only in the presence of cADPR by stimulating of RyR, subcellular Ca2+ signals of sufficient amplitude and frequency were generated. This resulted in a global Ca2+ wave spreading throughout the cells. In 3T3 cells the amplitude and diameter of the pacemaker signals correspond to these determined Ca2+ quarks. Such elemental signal events represent subcellular Ca2+ signals caused by opening events of one or a few RyR. In summary, in this thesis evidence for a significant role of the subcellular Ca2+ signals in the cADPR/ RyR signalling pathway in T lymphocytes and 3T3 fibroblasts is accumulated. In the future, pharmaceuticals modulating subcellular signals may be used to control the effector systems of cellular Ca2+ signalling, since the development of global signals depends on the amplification of subcellular pacemaker signals

Spino-dendritic cross-talk in rodent Purkinje neurons mediated by endogenous Ca2+-binding proteins

The range of actions of the second messenger Ca2+ is a key determinant of neuronal excitability and plasticity. For dendritic spines, there is on-going debate regarding how diffusional efflux of Ca2+ affects spine signalling. However, the consequences of spino-dendritic coupling for dendritic Ca2+ homeostasis and downstream signalling cascades have not been explored to date. We addressed this question by four-dimensional computer simulations, which were based on Ca2+-imaging data from mice that either express or lack distinct endogenous Ca2+-binding proteins. Our simulations revealed that single active spines do not affect dendritic Ca2+ signalling. Neighbouring, coactive spines, however, induce sizeable increases in dendritic [Ca2+]i when they process slow synaptic Ca2+ signals, such as those implicated in the induction of long-term plasticity. This spino-dendritic coupling is mediated by buffered diffusion, specifically by diffusing calbindin-bound Ca2+. This represents a central mechanism for activating calmodulin in dendritic shafts and therefore a novel form of signal integration in spiny dendrites