Prevalence and determinants of asymptomatic Leishmania infection in HIV-infected individuals living within visceral leishmaniasis endemic areas of Bihar, India

People living with HIV (PLHIV) have an increased risk of developing visceral leishmaniasis (VL) and poor outcomes compared to HIV negative individuals. Here, we aim to establish the prevalence and determinants of asymptomatic Leishmania infection (ALI) in a cohort of PLHIV in Bihar, India. We hoped to evaluate optimal diagnostic algorithms to detect ALI in PLHIV. We conducted a cross-sectional survey of PLHIV ≥18 years of age with no history or current diagnosis of VL or post kala-azar dermal leishmaniasis (PKDL) at anti-retroviral therapy centres within VL endemic districts of Bihar. ALI was defined as a positive rK39 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), rK39 rapid diagnostic test (RDT) and/or quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Additionally, the urinary Leishmania antigen ELISA was evaluated. Determinants for ALI were established using logistic regression and agreement between diagnostic tests calculated using Cohen’s Kappa. A total of 1,296 PLHIV enrolled in HIV care, 694 (53.6%) of whom were female and a median age of 39 years (interquartile range 33–46), were included in the analysis. Baseline prevalence of ALI was 7.4% (n = 96). All 96 individuals were positive by rK39 ELISA, while 0.5% (n = 6) and 0.4% (n = 5) were positive by qPCR and rK39 RDT, respectively. Negligible or weak agreement was seen between assays. Independent risk factors for ALI were CD4 counts <100 (OR 3.1; 95% CI 1.2–7.6) and CD4 counts 100–199 (OR = 2.1;95% CI:1.1–4.0) compared to CD4 counts ≥300, and a household size ≥5 (OR = 1.9;95% CI:1.1–3.1). A total of 2.2% (n = 28) participants were positive by Leishmania antigen ELISA, detecting 20 additional participants to the asymptomatic cohort. Prevalence of ALI in PLHIV in VL endemic villages in Bihar was relatively high. Using the Leishmania antigen ELISA, prevalence increased to 9.0%. Patients with low CD4 counts and larger household size were found to have significantly higher risk of ALI

A Multi-Country, Single-Blinded, Phase 2 Study to Evaluate a Point-of-Need System for Rapid Detection of Leishmaniasis and Its Implementation in Endemic Settings

With the advancement of isothermal nucleic acid amplification techniques, detection of the pathogenic DNA in clinical samples at point-of-need is no longer a dream. The newly developed recombinase polymerase amplification (RPA) assay incorporated in a suitcase laboratory has shown promising diagnostic efficacy over real-time PCR in detection of leishmania DNA from clinical samples. For broader application of this point-of-need system, we undertook a current multi-country diagnostic evaluation study towards establishing this technique in different endemic settings which would be beneficial for the ongoing elimination programs for leishmaniasis. For this study purpose, clinical samples from confirmed visceral leishmaniasis (VL) and post-kala-azar dermal leishmaniasis (PKDL) patients were subjected to both real-time PCR and RPA assay in Bangladesh, India, and Nepal. Further skin samples from confirmed cutaneous leishmaniasis (CL) patients were also included from Sri Lanka. A total of 450 clinical samples from VL patients, 429 from PKDL patients, 47 from CL patients, and 322 from endemic healthy/healthy controls were under investigation to determine the diagnostic efficacy of RPA assay in comparison to real-time PCR. A comparative sensitivity of both methods was found where real-time PCR and RPA assay showed 96.86% (95% CI: 94.45–98.42) and 88.85% (95% CI: 85.08–91.96) sensitivity respectively in the diagnosis of VL cases. This new isothermal method also exhibited promising diagnostic sensitivity (93.50%) for PKDL cases, when a skin sample was used. Due to variation in the sequence of target amplicons, RPA assay showed comparatively lower sensitivity (55.32%) than that of real-time PCR in Sri Lanka for the diagnosis of CL cases. Except for India, the assay presented absolute specificity in the rest of the sites. Excellent concordance between the two molecular methods towards detection of leishmania DNA in clinical samples substantiates the application of RPA assay incorporated in a suitcase laboratory for point-of-need diagnosis of VL and PKDL in low resource endemic settings. However, further improvisation of the method is necessary for diagnosis of CL

Physiopathologie du virus Chikungunya : RAW264.7, un modèle d’infection des macrophages murins

Chikungunya virus (CHIKV) is a member of Alphavirus genus of the Togaviridae family transmitted by Aedes genus mosquitoes. Infection with CHIKV is known to cause human joint disorders like arthralgia or arthritis which can persist for years. During the 2005-2006 outbreaks, CHIKV was seen to be able to persist in synovial macrophages for several months or even years. Macrophages are innate immune cells that play an essential role during inflammation processes but also in other pathologic activities like angiogenesis. In the same time, CNS infections were evidenced, showing a paradigm shift of this virus from the group of arthritogenic „old world alphaviruses‟ to the encephalitic „new world alphaviruses‟ group. Our hypothesis is that the persistently CHIKV-infected macrophages can be polarized towards a chronic inflammatory response that may be harmful to neighboring cells of the connective tissue and contributing to arthritis. Approach: To decipher the engaged mechanisms, we developed a mouse macrophage cell line model (RAW264.7) of CHIKV infection and analyzed the virus replication and innate immune response engaged (cytokine, proangiogenic factor expression and programmed cell death). We also perform a comparative study with Sindbis virus (SINV), another member of the Alphavirus genus. Findings: In-vitro experiments revealed that less than 5% of RAW264.7 cells were infected, with a stable and constant production of intracellular virus particles, during the time course of infection (8-48hr). The capacity of the virus to replicate in macrophages was confirmed by the presence of positive and negative strands of the virus RNA (RT-qPCR) and dsRNA (immunofluorescence using the J2 antibody). However, no infective viral particles were release from the cells. Surprisingly, the infection did not translate into a robust type I IFN innate immune response (IFN-α/β and ISG56). TNF-α, GM-CSF and IL-6 expression were upregulated while IFN-γ, IL-1α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 or IL-17 expression could not be evidenced after CHIKV exposure (ELISA, FACS array). Also and in contrast to CLTT astrocyte cells (positive control), RAW264.7 infected-cells failed to mobilize apoptosis in order to control CHIKV infection. By comparison to RAW264.7 cells, SINV infection of macrophages clearly showed significant increase in PRRs like TLR-3, RIG-I and MDA5 as well as type I IFN innate immune molecules (IFNα4, PKR, ISG15/54/56) as well as signs of apoptosis. In addition, high expression of pro-angiogenic factors such as PDGFB was observed in CHIKV infected cells. These data clearly show that CHIKV can infect RAW macrophages which, in turn, failed to mount a protective interferon innate immune and apoptosis responses. These observations argue for the capacity of CHIKV to persist in macrophages. Moreover, the robust induced pro-inflammatory TNF-α and pro-angiogenic factors PDGFB may contribute to arthritis. We also showed that RAW macrophages responded differently to different virus of the same genus (CHIKV and SINV). The RAW264.7 mouse macrophage cell line model of CHIKV infection developed herein constitutes a new and validated tool to study the mechanism of viral/cell host interaction which could offer a better understanding of chronic pathologies associated with post-CHIKV infections.Le virus Chikungunya (CHIKV) est un membre du genre Alphavirus de la famille des Togaviridae, transmis par les moustiques du genre Aedes. L'infection par le CHIKV provoque des troubles articulaires comme l'arthrite ou des arthralgies qui peuvent persister durant des années. Au cours des épidémies de 2005-2006, il a été démontré que le CHIKV pouvait persister dans les macrophages synoviaux pendant plusieurs mois voire des années. Les macrophages sont des cellules du système immunitaires innées qui jouent un rôle essentiel dans les processus inflammatoires, mais aussi dans d'autres activités pathologiques tels que l'angiogenèse. Des infections du système nerveux central par le CHIKV ont également été mis en évidence, démontrant une extension des caractères arthritogèniques de ce virus du groupe des « alphavirus de l‟ancien monde» à celui des « alphavirus du nouveau monde» causant des encéphalites. Notre hypothèse de travail est que les macrophages infectés, de façon persistante par le CHIKV, sont polarisés vers une réponse inflammatoire chronique qui peut être néfaste envers les autres cellules du tissu conjonctif. Pour élucider les mécanismes mis en jeu, nous avons développé un modèle d‟infection par le CHIKV d‟une lignée cellulaire de macrophage murin (RAW264.7) et analysé la réplication du virus et la réponse immunitaire innée engagée (production/libération de cytokines, facteurs de l‟angiogenèse et mort cellulaire programmée). Une étude comparative avec un autre alphavirus (virus Sindbis, SINV), a également été réalisée. Les expériences menées in-vitro ont révélé que moins de 5% des cellules RAW264.7 sont infectées avec une production stable et constante de particules virales au cours du temps de l'infection (8-48h). La capacité du virus à se répliquer dans les macrophages a été confirmée par la présence des brins d‟ARN viraux positifs et négatifs (RT-qPCR) ainsi que des ARN doubles brins (immunofluorescence avec l‟anticorps J2). Cependant, aucune particule virale infectieuse ne semble être libérée par les cellules infectées. Étonnamment, l'infection ne se traduit pas par une réponse marquée IFN (IFN-α/β et ISG56). Une expression accrue de TNF-α, de GM-CSF et d‟IL-6 a été mis en évidence tandis que l'IFN-γ, l‟IL-1α, l‟IL-2, l‟IL-4, l‟IL-5, l‟IL-10 ou encore l‟IL-17 ne subissent aucune modulation de leur expression suite à l'exposition des macrophages au CHIKV (ELISA, FACS large). En outre, et contrairement aux cellules astrocytaires CLTT (contrôle positif), les cellules RAW264.7 infectées ne mobilisent pas les mécanismes de l‟apoptose afin de contrôler l'infection par le CHIKV. En comparaison avec les cellules RAW264.7, l'infection des macrophages par le virus SINV révèle une augmentation significative de l‟expression des PRRs tels que TLR-3, RIG-I et MDA5, de l‟IFN de type I (IFNα4, PKR, ISG15/54/56) ainsi que l‟activation de l'apoptose. En outre, l'expression élevée de facteurs pro-angiogéniques tels que PDGFB a été observée dans les cellules infectées par le CHIKV. Ces données montrent clairement que le CHIKV peut infecter les macrophages qui n‟engagent néanmoins pas, en retour, de réponse IFN ou les mécanismes de l'apoptose à même de contrôler l‟infection et pouvant de ce fait contribuer à la persistance du virus. Cependant, la robuste réponse pro-inflammatoire induite par le TNF-α et la production de facteurs pro-angiogénique tels que le PDGFB peuvent contribuer à l'arthrite. Nous avons également mis en évidence que les macrophages RAW peuvent réagir différemment aux virus du même genre (CHIKV et SINV). Le modèle d‟infection cellulaire de la lignée murine macrophagique RAW264.7 qui a été développé constitue un nouvel outil pour l‟étude de l‟interaction hôte/virus qui doit permettre d'une meilleure compréhension de certains mécanismes pathologiques associées aux infections chroniques post-CHIKV/Alphavirus

Physiopathologie du virus Chikungunya : RAW264.7, un modèle d’infection des macrophages murins

Chikungunya virus (CHIKV) is a member of Alphavirus genus of the Togaviridae family transmitted by Aedes genus mosquitoes. Infection with CHIKV is known to cause human joint disorders like arthralgia or arthritis which can persist for years. During the 2005-2006 outbreaks, CHIKV was seen to be able to persist in synovial macrophages for several months or even years. Macrophages are innate immune cells that play an essential role during inflammation processes but also in other pathologic activities like angiogenesis. In the same time, CNS infections were evidenced, showing a paradigm shift of this virus from the group of arthritogenic „old world alphaviruses‟ to the encephalitic „new world alphaviruses‟ group. Our hypothesis is that the persistently CHIKV-infected macrophages can be polarized towards a chronic inflammatory response that may be harmful to neighboring cells of the connective tissue and contributing to arthritis. Approach: To decipher the engaged mechanisms, we developed a mouse macrophage cell line model (RAW264.7) of CHIKV infection and analyzed the virus replication and innate immune response engaged (cytokine, proangiogenic factor expression and programmed cell death). We also perform a comparative study with Sindbis virus (SINV), another member of the Alphavirus genus. Findings: In-vitro experiments revealed that less than 5% of RAW264.7 cells were infected, with a stable and constant production of intracellular virus particles, during the time course of infection (8-48hr). The capacity of the virus to replicate in macrophages was confirmed by the presence of positive and negative strands of the virus RNA (RT-qPCR) and dsRNA (immunofluorescence using the J2 antibody). However, no infective viral particles were release from the cells. Surprisingly, the infection did not translate into a robust type I IFN innate immune response (IFN-α/β and ISG56). TNF-α, GM-CSF and IL-6 expression were upregulated while IFN-γ, IL-1α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 or IL-17 expression could not be evidenced after CHIKV exposure (ELISA, FACS array). Also and in contrast to CLTT astrocyte cells (positive control), RAW264.7 infected-cells failed to mobilize apoptosis in order to control CHIKV infection. By comparison to RAW264.7 cells, SINV infection of macrophages clearly showed significant increase in PRRs like TLR-3, RIG-I and MDA5 as well as type I IFN innate immune molecules (IFNα4, PKR, ISG15/54/56) as well as signs of apoptosis. In addition, high expression of pro-angiogenic factors such as PDGFB was observed in CHIKV infected cells. These data clearly show that CHIKV can infect RAW macrophages which, in turn, failed to mount a protective interferon innate immune and apoptosis responses. These observations argue for the capacity of CHIKV to persist in macrophages. Moreover, the robust induced pro-inflammatory TNF-α and pro-angiogenic factors PDGFB may contribute to arthritis. We also showed that RAW macrophages responded differently to different virus of the same genus (CHIKV and SINV). The RAW264.7 mouse macrophage cell line model of CHIKV infection developed herein constitutes a new and validated tool to study the mechanism of viral/cell host interaction which could offer a better understanding of chronic pathologies associated with post-CHIKV infections.Le virus Chikungunya (CHIKV) est un membre du genre Alphavirus de la famille des Togaviridae, transmis par les moustiques du genre Aedes. L'infection par le CHIKV provoque des troubles articulaires comme l'arthrite ou des arthralgies qui peuvent persister durant des années. Au cours des épidémies de 2005-2006, il a été démontré que le CHIKV pouvait persister dans les macrophages synoviaux pendant plusieurs mois voire des années. Les macrophages sont des cellules du système immunitaires innées qui jouent un rôle essentiel dans les processus inflammatoires, mais aussi dans d'autres activités pathologiques tels que l'angiogenèse. Des infections du système nerveux central par le CHIKV ont également été mis en évidence, démontrant une extension des caractères arthritogèniques de ce virus du groupe des « alphavirus de l‟ancien monde» à celui des « alphavirus du nouveau monde» causant des encéphalites. Notre hypothèse de travail est que les macrophages infectés, de façon persistante par le CHIKV, sont polarisés vers une réponse inflammatoire chronique qui peut être néfaste envers les autres cellules du tissu conjonctif. Pour élucider les mécanismes mis en jeu, nous avons développé un modèle d‟infection par le CHIKV d‟une lignée cellulaire de macrophage murin (RAW264.7) et analysé la réplication du virus et la réponse immunitaire innée engagée (production/libération de cytokines, facteurs de l‟angiogenèse et mort cellulaire programmée). Une étude comparative avec un autre alphavirus (virus Sindbis, SINV), a également été réalisée. Les expériences menées in-vitro ont révélé que moins de 5% des cellules RAW264.7 sont infectées avec une production stable et constante de particules virales au cours du temps de l'infection (8-48h). La capacité du virus à se répliquer dans les macrophages a été confirmée par la présence des brins d‟ARN viraux positifs et négatifs (RT-qPCR) ainsi que des ARN doubles brins (immunofluorescence avec l‟anticorps J2). Cependant, aucune particule virale infectieuse ne semble être libérée par les cellules infectées. Étonnamment, l'infection ne se traduit pas par une réponse marquée IFN (IFN-α/β et ISG56). Une expression accrue de TNF-α, de GM-CSF et d‟IL-6 a été mis en évidence tandis que l'IFN-γ, l‟IL-1α, l‟IL-2, l‟IL-4, l‟IL-5, l‟IL-10 ou encore l‟IL-17 ne subissent aucune modulation de leur expression suite à l'exposition des macrophages au CHIKV (ELISA, FACS large). En outre, et contrairement aux cellules astrocytaires CLTT (contrôle positif), les cellules RAW264.7 infectées ne mobilisent pas les mécanismes de l‟apoptose afin de contrôler l'infection par le CHIKV. En comparaison avec les cellules RAW264.7, l'infection des macrophages par le virus SINV révèle une augmentation significative de l‟expression des PRRs tels que TLR-3, RIG-I et MDA5, de l‟IFN de type I (IFNα4, PKR, ISG15/54/56) ainsi que l‟activation de l'apoptose. En outre, l'expression élevée de facteurs pro-angiogéniques tels que PDGFB a été observée dans les cellules infectées par le CHIKV. Ces données montrent clairement que le CHIKV peut infecter les macrophages qui n‟engagent néanmoins pas, en retour, de réponse IFN ou les mécanismes de l'apoptose à même de contrôler l‟infection et pouvant de ce fait contribuer à la persistance du virus. Cependant, la robuste réponse pro-inflammatoire induite par le TNF-α et la production de facteurs pro-angiogénique tels que le PDGFB peuvent contribuer à l'arthrite. Nous avons également mis en évidence que les macrophages RAW peuvent réagir différemment aux virus du même genre (CHIKV et SINV). Le modèle d‟infection cellulaire de la lignée murine macrophagique RAW264.7 qui a été développé constitue un nouvel outil pour l‟étude de l‟interaction hôte/virus qui doit permettre d'une meilleure compréhension de certains mécanismes pathologiques associées aux infections chroniques post-CHIKV/Alphavirus

Physiopathologie du virus Chikungunya : RAW264.7, un modèle d’infection des macrophages murins

Chikungunya virus (CHIKV) is a member of Alphavirus genus of the Togaviridae family transmitted by Aedes genus mosquitoes. Infection with CHIKV is known to cause human joint disorders like arthralgia or arthritis which can persist for years. During the 2005-2006 outbreaks, CHIKV was seen to be able to persist in synovial macrophages for several months or even years. Macrophages are innate immune cells that play an essential role during inflammation processes but also in other pathologic activities like angiogenesis. In the same time, CNS infections were evidenced, showing a paradigm shift of this virus from the group of arthritogenic „old world alphaviruses‟ to the encephalitic „new world alphaviruses‟ group. Our hypothesis is that the persistently CHIKV-infected macrophages can be polarized towards a chronic inflammatory response that may be harmful to neighboring cells of the connective tissue and contributing to arthritis. Approach: To decipher the engaged mechanisms, we developed a mouse macrophage cell line model (RAW264.7) of CHIKV infection and analyzed the virus replication and innate immune response engaged (cytokine, proangiogenic factor expression and programmed cell death). We also perform a comparative study with Sindbis virus (SINV), another member of the Alphavirus genus. Findings: In-vitro experiments revealed that less than 5% of RAW264.7 cells were infected, with a stable and constant production of intracellular virus particles, during the time course of infection (8-48hr). The capacity of the virus to replicate in macrophages was confirmed by the presence of positive and negative strands of the virus RNA (RT-qPCR) and dsRNA (immunofluorescence using the J2 antibody). However, no infective viral particles were release from the cells. Surprisingly, the infection did not translate into a robust type I IFN innate immune response (IFN-α/β and ISG56). TNF-α, GM-CSF and IL-6 expression were upregulated while IFN-γ, IL-1α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 or IL-17 expression could not be evidenced after CHIKV exposure (ELISA, FACS array). Also and in contrast to CLTT astrocyte cells (positive control), RAW264.7 infected-cells failed to mobilize apoptosis in order to control CHIKV infection. By comparison to RAW264.7 cells, SINV infection of macrophages clearly showed significant increase in PRRs like TLR-3, RIG-I and MDA5 as well as type I IFN innate immune molecules (IFNα4, PKR, ISG15/54/56) as well as signs of apoptosis. In addition, high expression of pro-angiogenic factors such as PDGFB was observed in CHIKV infected cells. These data clearly show that CHIKV can infect RAW macrophages which, in turn, failed to mount a protective interferon innate immune and apoptosis responses. These observations argue for the capacity of CHIKV to persist in macrophages. Moreover, the robust induced pro-inflammatory TNF-α and pro-angiogenic factors PDGFB may contribute to arthritis. We also showed that RAW macrophages responded differently to different virus of the same genus (CHIKV and SINV). The RAW264.7 mouse macrophage cell line model of CHIKV infection developed herein constitutes a new and validated tool to study the mechanism of viral/cell host interaction which could offer a better understanding of chronic pathologies associated with post-CHIKV infections.Le virus Chikungunya (CHIKV) est un membre du genre Alphavirus de la famille des Togaviridae, transmis par les moustiques du genre Aedes. L'infection par le CHIKV provoque des troubles articulaires comme l'arthrite ou des arthralgies qui peuvent persister durant des années. Au cours des épidémies de 2005-2006, il a été démontré que le CHIKV pouvait persister dans les macrophages synoviaux pendant plusieurs mois voire des années. Les macrophages sont des cellules du système immunitaires innées qui jouent un rôle essentiel dans les processus inflammatoires, mais aussi dans d'autres activités pathologiques tels que l'angiogenèse. Des infections du système nerveux central par le CHIKV ont également été mis en évidence, démontrant une extension des caractères arthritogèniques de ce virus du groupe des « alphavirus de l‟ancien monde» à celui des « alphavirus du nouveau monde» causant des encéphalites. Notre hypothèse de travail est que les macrophages infectés, de façon persistante par le CHIKV, sont polarisés vers une réponse inflammatoire chronique qui peut être néfaste envers les autres cellules du tissu conjonctif. Pour élucider les mécanismes mis en jeu, nous avons développé un modèle d‟infection par le CHIKV d‟une lignée cellulaire de macrophage murin (RAW264.7) et analysé la réplication du virus et la réponse immunitaire innée engagée (production/libération de cytokines, facteurs de l‟angiogenèse et mort cellulaire programmée). Une étude comparative avec un autre alphavirus (virus Sindbis, SINV), a également été réalisée. Les expériences menées in-vitro ont révélé que moins de 5% des cellules RAW264.7 sont infectées avec une production stable et constante de particules virales au cours du temps de l'infection (8-48h). La capacité du virus à se répliquer dans les macrophages a été confirmée par la présence des brins d‟ARN viraux positifs et négatifs (RT-qPCR) ainsi que des ARN doubles brins (immunofluorescence avec l‟anticorps J2). Cependant, aucune particule virale infectieuse ne semble être libérée par les cellules infectées. Étonnamment, l'infection ne se traduit pas par une réponse marquée IFN (IFN-α/β et ISG56). Une expression accrue de TNF-α, de GM-CSF et d‟IL-6 a été mis en évidence tandis que l'IFN-γ, l‟IL-1α, l‟IL-2, l‟IL-4, l‟IL-5, l‟IL-10 ou encore l‟IL-17 ne subissent aucune modulation de leur expression suite à l'exposition des macrophages au CHIKV (ELISA, FACS large). En outre, et contrairement aux cellules astrocytaires CLTT (contrôle positif), les cellules RAW264.7 infectées ne mobilisent pas les mécanismes de l‟apoptose afin de contrôler l'infection par le CHIKV. En comparaison avec les cellules RAW264.7, l'infection des macrophages par le virus SINV révèle une augmentation significative de l‟expression des PRRs tels que TLR-3, RIG-I et MDA5, de l‟IFN de type I (IFNα4, PKR, ISG15/54/56) ainsi que l‟activation de l'apoptose. En outre, l'expression élevée de facteurs pro-angiogéniques tels que PDGFB a été observée dans les cellules infectées par le CHIKV. Ces données montrent clairement que le CHIKV peut infecter les macrophages qui n‟engagent néanmoins pas, en retour, de réponse IFN ou les mécanismes de l'apoptose à même de contrôler l‟infection et pouvant de ce fait contribuer à la persistance du virus. Cependant, la robuste réponse pro-inflammatoire induite par le TNF-α et la production de facteurs pro-angiogénique tels que le PDGFB peuvent contribuer à l'arthrite. Nous avons également mis en évidence que les macrophages RAW peuvent réagir différemment aux virus du même genre (CHIKV et SINV). Le modèle d‟infection cellulaire de la lignée murine macrophagique RAW264.7 qui a été développé constitue un nouvel outil pour l‟étude de l‟interaction hôte/virus qui doit permettre d'une meilleure compréhension de certains mécanismes pathologiques associées aux infections chroniques post-CHIKV/Alphavirus

Physiopathologie du virus Chikungunya : RAW264.7, un modèle d’infection des macrophages murins

Le virus Chikungunya (CHIKV) est un membre du genre Alphavirus de la famille des Togaviridae, transmis par les moustiques du genre Aedes. L'infection par le CHIKV provoque des troubles articulaires comme l'arthrite ou des arthralgies qui peuvent persister durant des années. Au cours des épidémies de 2005-2006, il a été démontré que le CHIKV pouvait persister dans les macrophages synoviaux pendant plusieurs mois voire des années. Les macrophages sont des cellules du système immunitaires innées qui jouent un rôle essentiel dans les processus inflammatoires, mais aussi dans d'autres activités pathologiques tels que l'angiogenèse. Des infections du système nerveux central par le CHIKV ont également été mis en évidence, démontrant une extension des caractères arthritogèniques de ce virus du groupe des « alphavirus de l‟ancien monde» à celui des « alphavirus du nouveau monde» causant des encéphalites. Notre hypothèse de travail est que les macrophages infectés, de façon persistante par le CHIKV, sont polarisés vers une réponse inflammatoire chronique qui peut être néfaste envers les autres cellules du tissu conjonctif. Pour élucider les mécanismes mis en jeu, nous avons développé un modèle d‟infection par le CHIKV d‟une lignée cellulaire de macrophage murin (RAW264.7) et analysé la réplication du virus et la réponse immunitaire innée engagée (production/libération de cytokines, facteurs de l‟angiogenèse et mort cellulaire programmée). Une étude comparative avec un autre alphavirus (virus Sindbis, SINV), a également été réalisée. Les expériences menées in-vitro ont révélé que moins de 5% des cellules RAW264.7 sont infectées avec une production stable et constante de particules virales au cours du temps de l'infection (8-48h). La capacité du virus à se répliquer dans les macrophages a été confirmée par la présence des brins d‟ARN viraux positifs et négatifs (RT-qPCR) ainsi que des ARN doubles brins (immunofluorescence avec l‟anticorps J2). Cependant, aucune particule virale infectieuse ne semble être libérée par les cellules infectées. Étonnamment, l'infection ne se traduit pas par une réponse marquée IFN (IFN-α/β et ISG56). Une expression accrue de TNF-α, de GM-CSF et d‟IL-6 a été mis en évidence tandis que l'IFN-γ, l‟IL-1α, l‟IL-2, l‟IL-4, l‟IL-5, l‟IL-10 ou encore l‟IL-17 ne subissent aucune modulation de leur expression suite à l'exposition des macrophages au CHIKV (ELISA, FACS large). En outre, et contrairement aux cellules astrocytaires CLTT (contrôle positif), les cellules RAW264.7 infectées ne mobilisent pas les mécanismes de l‟apoptose afin de contrôler l'infection par le CHIKV. En comparaison avec les cellules RAW264.7, l'infection des macrophages par le virus SINV révèle une augmentation significative de l‟expression des PRRs tels que TLR-3, RIG-I et MDA5, de l‟IFN de type I (IFNα4, PKR, ISG15/54/56) ainsi que l‟activation de l'apoptose. En outre, l'expression élevée de facteurs pro-angiogéniques tels que PDGFB a été observée dans les cellules infectées par le CHIKV. Ces données montrent clairement que le CHIKV peut infecter les macrophages qui n‟engagent néanmoins pas, en retour, de réponse IFN ou les mécanismes de l'apoptose à même de contrôler l‟infection et pouvant de ce fait contribuer à la persistance du virus. Cependant, la robuste réponse pro-inflammatoire induite par le TNF-α et la production de facteurs pro-angiogénique tels que le PDGFB peuvent contribuer à l'arthrite. Nous avons également mis en évidence que les macrophages RAW peuvent réagir différemment aux virus du même genre (CHIKV et SINV). Le modèle d‟infection cellulaire de la lignée murine macrophagique RAW264.7 qui a été développé constitue un nouvel outil pour l‟étude de l‟interaction hôte/virus qui doit permettre d'une meilleure compréhension de certains mécanismes pathologiques associées aux infections chroniques post-CHIKV/Alphavirus.Chikungunya virus (CHIKV) is a member of Alphavirus genus of the Togaviridae family transmitted by Aedes genus mosquitoes. Infection with CHIKV is known to cause human joint disorders like arthralgia or arthritis which can persist for years. During the 2005-2006 outbreaks, CHIKV was seen to be able to persist in synovial macrophages for several months or even years. Macrophages are innate immune cells that play an essential role during inflammation processes but also in other pathologic activities like angiogenesis. In the same time, CNS infections were evidenced, showing a paradigm shift of this virus from the group of arthritogenic „old world alphaviruses‟ to the encephalitic „new world alphaviruses‟ group. Our hypothesis is that the persistently CHIKV-infected macrophages can be polarized towards a chronic inflammatory response that may be harmful to neighboring cells of the connective tissue and contributing to arthritis. Approach: To decipher the engaged mechanisms, we developed a mouse macrophage cell line model (RAW264.7) of CHIKV infection and analyzed the virus replication and innate immune response engaged (cytokine, proangiogenic factor expression and programmed cell death). We also perform a comparative study with Sindbis virus (SINV), another member of the Alphavirus genus. Findings: In-vitro experiments revealed that less than 5% of RAW264.7 cells were infected, with a stable and constant production of intracellular virus particles, during the time course of infection (8-48hr). The capacity of the virus to replicate in macrophages was confirmed by the presence of positive and negative strands of the virus RNA (RT-qPCR) and dsRNA (immunofluorescence using the J2 antibody). However, no infective viral particles were release from the cells. Surprisingly, the infection did not translate into a robust type I IFN innate immune response (IFN-α/β and ISG56). TNF-α, GM-CSF and IL-6 expression were upregulated while IFN-γ, IL-1α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 or IL-17 expression could not be evidenced after CHIKV exposure (ELISA, FACS array). Also and in contrast to CLTT astrocyte cells (positive control), RAW264.7 infected-cells failed to mobilize apoptosis in order to control CHIKV infection. By comparison to RAW264.7 cells, SINV infection of macrophages clearly showed significant increase in PRRs like TLR-3, RIG-I and MDA5 as well as type I IFN innate immune molecules (IFNα4, PKR, ISG15/54/56) as well as signs of apoptosis. In addition, high expression of pro-angiogenic factors such as PDGFB was observed in CHIKV infected cells. These data clearly show that CHIKV can infect RAW macrophages which, in turn, failed to mount a protective interferon innate immune and apoptosis responses. These observations argue for the capacity of CHIKV to persist in macrophages. Moreover, the robust induced pro-inflammatory TNF-α and pro-angiogenic factors PDGFB may contribute to arthritis. We also showed that RAW macrophages responded differently to different virus of the same genus (CHIKV and SINV). The RAW264.7 mouse macrophage cell line model of CHIKV infection developed herein constitutes a new and validated tool to study the mechanism of viral/cell host interaction which could offer a better understanding of chronic pathologies associated with post-CHIKV infections

Hepatitis C virus seroprevalence among patients enrolled at the opioid substitution therapy center in Bihar: A cross-sectional study.

Background and aimHepatitis C virus (HCV) infection poses a major public health challenge in Indian settings due to its huge population and easy transmissibility of HCV among individuals who inject drugs (PWID, which is increasing in India). The National AIDS Control Organization (NACO), India has started the Opioid Substitution Therapy (OST) centers to improve the health status of opioid dependent PWID and prevent the spread of HIV/AIDS among them. We conducted a cross-sectional study to find out the HCV sero-positive status and associated determinants in patients attending the OST centre in the ICMR-RMRIMS, Patna.Materials and methodsWe utilized the routinely collected (as a part of the National AIDS Control Program) and de-identified data from the OST center from 2014 to 2022 (N = 268). We abstracted the information for exposure variables (such as socio-demographic features and drug history) and outcome variable (HCV serostatus). The association of exposure variables with HCV serostatus was examined using robust Poisson regression.ResultsAll the enrolled participants were male and the prevalence of HCV seropositivity was 28% [95% confidence interval (CI): 22.7% - 33.8%)]. There was a rising prevalence of HCV seropositivity with number of years of injection use (p-trend 10 years and reported the maximum prevalence of HCV seropositivity (47.1%, 95% CI: 23.3%-70.8%). In adjusted analyses, being employed compared to unemployed patients [adjusted prevalence ratio (aPR) = 0.59; 95% CI: 0.38-0.89]; graduated patients compared to illiterate patients [aPR = 0.11; 95% CI: 0.02-0.78]; and patients with education up to higher secondary compared to illiterate patients [aPR = 0.64; 95% CI: 0.43-0.94] had significantly lesser HCV seropositivity. A-one year increase in injection use [aPR = 1.07; 95% CI: 1.04-1.10] was associated with 7% higher prevalence of HCV seropositivity.ConclusionsIn this OST center-based study of 268 PWIDs residing in Patna, ~28% of patients were HCV seropositive, which was positively associated with years of injection use, unemployment, and illiteracy. Our findings suggest that OST centers offer an opportunity to reach a high-risk difficult to reach group for HCV infection and thus support the notion of integrating HCV care into the OST or de-addiction centres

Mouse macrophage innate immune response to chikungunya virus infection

Abstract Background Infection with Chikungunya alphavirus (CHIKV) can cause severe arthralgia and chronic arthritis in humans with persistence of the virus in perivascular macrophages of the synovial membrane by mechanisms largely ill-characterized. Findings We herein analysed the innate immune response (cytokine and programmed cell death) of RAW264.7 mouse macrophages following CHIKV infection. We found that the infection was restrained to a small percentage of cells and was not associated with a robust type I IFN innate immune response (IFN-α4 and ISG56). TNF-α, IL-6 and GM-CSF expression were upregulated while IFN-γ, IL-1α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 or IL-17 expression could not be evidenced prior to and after CHIKV exposure. Although CHIKV is known to drive apoptosis in many cell types, we found no canonical signs of programmed cell death (cleaved caspase-3, -9) in infected RAW264.7 cells. Conclusion These data argue for the capacity of CHIKV to infect and drive a specific innate immune response in RAW264.7 macrophage cell which seems to be polarized to assist viral persistence through the control of apoptosis and IFN signalling.</p

Mouse macrophage innate immune response to Chikungunya virus infection

International audienceBACKGROUND: Infection with Chikungunya alphavirus (CHIKV) can cause severe arthralgia and chronic arthritis in humans with persistence of the virus in perivascular macrophages of the synovial membrane by mechanisms largely ill-characterized. FINDINGS: We herein analysed the innate immune response (cytokine and programmed cell death) of RAW264.7 mouse macrophages following CHIKV infection. We found that the infection was restrained to a small percentage of cells and was not associated with a robust type I IFN innate immune response (IFN-α4 and ISG56). TNF-α, IL-6 and GM-CSF expression were upregulated while IFN-γ, IL-1α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 or IL-17 expression could not be evidenced prior to and after CHIKV exposure. Although CHIKV is known to drive apoptosis in many cell types, we found no canonical signs of programmed cell death (cleaved caspase-3, -9) in infected RAW264.7 cells. CONCLUSION: These data argue for the capacity of CHIKV to infect and drive a specific innate immune response in RAW264.7 macrophage cell which seems to be polarized to assist viral persistence through the control of apoptosis and IFN signalling