Physiopathologie du virus Chikungunya : RAW264.7, un modèle d’infection des macrophages murins

Abstract

Chikungunya virus (CHIKV) is a member of Alphavirus genus of the Togaviridae family transmitted by Aedes genus mosquitoes. Infection with CHIKV is known to cause human joint disorders like arthralgia or arthritis which can persist for years. During the 2005-2006 outbreaks, CHIKV was seen to be able to persist in synovial macrophages for several months or even years. Macrophages are innate immune cells that play an essential role during inflammation processes but also in other pathologic activities like angiogenesis. In the same time, CNS infections were evidenced, showing a paradigm shift of this virus from the group of arthritogenic „old world alphaviruses‟ to the encephalitic „new world alphaviruses‟ group. Our hypothesis is that the persistently CHIKV-infected macrophages can be polarized towards a chronic inflammatory response that may be harmful to neighboring cells of the connective tissue and contributing to arthritis. Approach: To decipher the engaged mechanisms, we developed a mouse macrophage cell line model (RAW264.7) of CHIKV infection and analyzed the virus replication and innate immune response engaged (cytokine, proangiogenic factor expression and programmed cell death). We also perform a comparative study with Sindbis virus (SINV), another member of the Alphavirus genus. Findings: In-vitro experiments revealed that less than 5% of RAW264.7 cells were infected, with a stable and constant production of intracellular virus particles, during the time course of infection (8-48hr). The capacity of the virus to replicate in macrophages was confirmed by the presence of positive and negative strands of the virus RNA (RT-qPCR) and dsRNA (immunofluorescence using the J2 antibody). However, no infective viral particles were release from the cells. Surprisingly, the infection did not translate into a robust type I IFN innate immune response (IFN-α/β and ISG56). TNF-α, GM-CSF and IL-6 expression were upregulated while IFN-γ, IL-1α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 or IL-17 expression could not be evidenced after CHIKV exposure (ELISA, FACS array). Also and in contrast to CLTT astrocyte cells (positive control), RAW264.7 infected-cells failed to mobilize apoptosis in order to control CHIKV infection. By comparison to RAW264.7 cells, SINV infection of macrophages clearly showed significant increase in PRRs like TLR-3, RIG-I and MDA5 as well as type I IFN innate immune molecules (IFNα4, PKR, ISG15/54/56) as well as signs of apoptosis. In addition, high expression of pro-angiogenic factors such as PDGFB was observed in CHIKV infected cells. These data clearly show that CHIKV can infect RAW macrophages which, in turn, failed to mount a protective interferon innate immune and apoptosis responses. These observations argue for the capacity of CHIKV to persist in macrophages. Moreover, the robust induced pro-inflammatory TNF-α and pro-angiogenic factors PDGFB may contribute to arthritis. We also showed that RAW macrophages responded differently to different virus of the same genus (CHIKV and SINV). The RAW264.7 mouse macrophage cell line model of CHIKV infection developed herein constitutes a new and validated tool to study the mechanism of viral/cell host interaction which could offer a better understanding of chronic pathologies associated with post-CHIKV infections.Le virus Chikungunya (CHIKV) est un membre du genre Alphavirus de la famille des Togaviridae, transmis par les moustiques du genre Aedes. L'infection par le CHIKV provoque des troubles articulaires comme l'arthrite ou des arthralgies qui peuvent persister durant des années. Au cours des épidémies de 2005-2006, il a été démontré que le CHIKV pouvait persister dans les macrophages synoviaux pendant plusieurs mois voire des années. Les macrophages sont des cellules du système immunitaires innées qui jouent un rôle essentiel dans les processus inflammatoires, mais aussi dans d'autres activités pathologiques tels que l'angiogenèse. Des infections du système nerveux central par le CHIKV ont également été mis en évidence, démontrant une extension des caractères arthritogèniques de ce virus du groupe des « alphavirus de l‟ancien monde» à celui des « alphavirus du nouveau monde» causant des encéphalites. Notre hypothèse de travail est que les macrophages infectés, de façon persistante par le CHIKV, sont polarisés vers une réponse inflammatoire chronique qui peut être néfaste envers les autres cellules du tissu conjonctif. Pour élucider les mécanismes mis en jeu, nous avons développé un modèle d‟infection par le CHIKV d‟une lignée cellulaire de macrophage murin (RAW264.7) et analysé la réplication du virus et la réponse immunitaire innée engagée (production/libération de cytokines, facteurs de l‟angiogenèse et mort cellulaire programmée). Une étude comparative avec un autre alphavirus (virus Sindbis, SINV), a également été réalisée. Les expériences menées in-vitro ont révélé que moins de 5% des cellules RAW264.7 sont infectées avec une production stable et constante de particules virales au cours du temps de l'infection (8-48h). La capacité du virus à se répliquer dans les macrophages a été confirmée par la présence des brins d‟ARN viraux positifs et négatifs (RT-qPCR) ainsi que des ARN doubles brins (immunofluorescence avec l‟anticorps J2). Cependant, aucune particule virale infectieuse ne semble être libérée par les cellules infectées. Étonnamment, l'infection ne se traduit pas par une réponse marquée IFN (IFN-α/β et ISG56). Une expression accrue de TNF-α, de GM-CSF et d‟IL-6 a été mis en évidence tandis que l'IFN-γ, l‟IL-1α, l‟IL-2, l‟IL-4, l‟IL-5, l‟IL-10 ou encore l‟IL-17 ne subissent aucune modulation de leur expression suite à l'exposition des macrophages au CHIKV (ELISA, FACS large). En outre, et contrairement aux cellules astrocytaires CLTT (contrôle positif), les cellules RAW264.7 infectées ne mobilisent pas les mécanismes de l‟apoptose afin de contrôler l'infection par le CHIKV. En comparaison avec les cellules RAW264.7, l'infection des macrophages par le virus SINV révèle une augmentation significative de l‟expression des PRRs tels que TLR-3, RIG-I et MDA5, de l‟IFN de type I (IFNα4, PKR, ISG15/54/56) ainsi que l‟activation de l'apoptose. En outre, l'expression élevée de facteurs pro-angiogéniques tels que PDGFB a été observée dans les cellules infectées par le CHIKV. Ces données montrent clairement que le CHIKV peut infecter les macrophages qui n‟engagent néanmoins pas, en retour, de réponse IFN ou les mécanismes de l'apoptose à même de contrôler l‟infection et pouvant de ce fait contribuer à la persistance du virus. Cependant, la robuste réponse pro-inflammatoire induite par le TNF-α et la production de facteurs pro-angiogénique tels que le PDGFB peuvent contribuer à l'arthrite. Nous avons également mis en évidence que les macrophages RAW peuvent réagir différemment aux virus du même genre (CHIKV et SINV). Le modèle d‟infection cellulaire de la lignée murine macrophagique RAW264.7 qui a été développé constitue un nouvel outil pour l‟étude de l‟interaction hôte/virus qui doit permettre d'une meilleure compréhension de certains mécanismes pathologiques associées aux infections chroniques post-CHIKV/Alphavirus