誘電詠動を用いたT4ファージ捕集におけるインピーダンス定量計測

近年、多剤耐性菌の増加による食中毒や院内感染が深刻化している。多剤耐性菌とは、多くの抗菌薬(抗生物質)に耐性を持つ細菌のことである。本菌は、長期間の薬剤使用などを原因として出現する。これらは、抗生物質が効かないため、治療が困難となるだけでなく、抗生物質による治療を受け続けることで体内の常在性細菌も減少させる。ただし、現状のまま、抗生物質の使用量を減らすと重症化する恐れがある。そのため、根本的に抗生物質を使用しない新たな治療技術の開発が必須となっている。ファージセラピーは、細菌へ特異的に寄生するバクテリオファージを用いて標的病原菌のみを殺滅する方法である。本手法では、常在性細菌に影響を与えないことや病原菌が存在すれば生体内でファージが自動的に増殖するといった長所がある。実際、MRSA(メチシリン耐性黄色ブドウ球菌)感染症や皮膚病の処置に用いられている。ただし、商用薬剤として使用するためには、当該ファージを一定濃度以上に精製濃縮する必要がある。そこで、著者は誘電泳動(dielectrophoresis: DEP)法に着目した。DEPとは、不均一電界中で物体が分極し、電界勾配に沿って泳動する現象である。これまでの研究において、微生物の構造に起因する電気定数の変化が精製濃縮量に大きく依存することが定量的に示された。本研究では、非球形のモデルウイルスとして複雑な外部構造を有するT4ファージウイルス(以下、T4ファージ)を捕集対象とした。捕集数の周波数依存性からDEPによる効率的な捕集条件の精査を以下のように行った。顕微鏡を用いた蛍光観察によるリアルタイムでの捕集状況の確認(定性評価)、プラーク法と呼ばれる培養法による生物学的計測(定量評価)及び誘電詠動インピーダンス計測(Dielectrophoretic Impedance Measurement: DEPIM)法による迅速な菌密度計測(定量評価)である。DEPIM法とは、細菌郡橋絡による電極間インピーダンスの変化から菌密度を測定する方法である。ただし、DEPIM法における菌捕捉時の電気定数変化は複雑であるため、等価回路による簡易モデルを構築し、各周波数でのファージ捕集数に対するコンダクタンス変化を数値的に検証した。また、媒質及びファージの導電率依存性についても検証した。検証実験では、DEPマイクロデバイスを用いて、4\u27,6-Diamidino-2-phenylindole(DAPI)で蛍光染色したT4ファージを捕集した。懸濁液の菌濃度は1.5×10^7PFU/ml、導電率は7μS/cmとした。手順としては、流量2.4ml/hで送液し、振幅20Vppの交流電圧を印加した。なお、印加周波数は10kHz-1MHzの範囲で変化させた。各評価方法における捕集ファージ数に対する周波数依存性について以下に述べる。蛍光観察では、電圧印加時のみ電極間において捕集が確認された。100kHzにおける蛍光強度は、10kHz、50kHz、500kHz及び1MHzと比較して大きく、捕集領域全面での電極間捕集が顕著となることが示された。捕集状況として、下流域での捕集数が増加した。流れによりT4ファージが下流域へスライドしており、T4ファージへの誘電詠動力は流体圧力と同程度であると推察される。プラーク法では、100kHzで捕集ファージ数が最大となり、50kHz以下及び500kHz以上で捕集数が著しく低下した。本傾向は、Madiyar et al.(2013)の実験結果と同様である。電極部における濃縮率は23.9倍となり、一般的手法と同程度の濃縮性能が得られた。DEPIM法でも、100kHzにおいて最大のコンダクタンス増加が確認され、50kHz及び500kHzでは増加量の低下が見られた。10kHz及び1MHzでは、捕集数が非常に少なかったため、コンダクタンスの変化を確認できなかった。蛍光画像から得られた捕集配置と培養法及びDEPIM法による捕集総数の評価から、T4ファージは低周波数域に捕集ピークが存在すると言える。また、複雑な形状及び構造を有しているため、高周波数域で誘電泳動力が強く作用する球状ウイルスと異なる捕集特性を示したと考えられる。等価回路モデルによる解析結果は以下の通りである。菌体の導電率を0.32S/m、媒質の導電率を0.1mS/mとし、周波数を10kHz-10MHz、捕集数を10^3-10^個に変化させた。各周波数において、低捕集数ではコンダクタンスが10μS付近で一定であるが10^7個を境(分岐点)に10kHzでは減少し、その他周波数では一度増加した後に低下した。周波数とともにコンダクタンスは増加した。実験において、蛍光観察及びプラーク法では、100及び500kHzの捕集数の差が顕著であったが、DEPIM法では微小だった。原因として、電極の保護膜がキャパシタとして働くことで、周波数が高いほど電極間コンダクタンスが増加しやすいことが考えられる。また、媒質の導電率を1から10mS/mへと増加させると、分岐点及び最大値は高捕集数側ヘシフトした。更に、低捕集数時のコンダクタンスは、低周波数域では減少し、高周波数域では増加した。一方、菌体の導電率を変化させると低捕集数側では変化がなかった。高捕集数側では、導電率の増加に伴い、分岐点及び最大値が低捕集数側ヘシフトし、媒質の導電率変化とは逆の特性が確認された。以上より、DEPによるT4ファージの捕集する効率的条件の精査を行い、低周波数域に捕集ピークがあることを明らかにした。また、等価回路の簡易モデルを用いて、DEPIM法の定量評価に向けた基礎検証ができた。今後、電極部の改善による捕集量の増大を図ることで医療へ実応用が期待される。首都大学東京, 2016-03-25, 修士（工学）首都大学東

De Novo Mutations in GNAO1, Encoding a Gαo Subunit of Heterotrimeric G Proteins, Cause Epileptic Encephalopathy

Heterotrimeric G proteins, composed of α, β, and γ subunits, can transduce a variety of signals from seven-transmembrane-type receptors to intracellular effectors. By whole-exome sequencing and subsequent mutation screening, we identified de novo heterozygous mutations in GNAO1, which encodes a Gαo subunit of heterotrimeric G proteins, in four individuals with epileptic encephalopathy. Two of the affected individuals also showed involuntary movements. Somatic mosaicism (approximately 35% to 50% of cells, distributed across multiple cell types, harbored the mutation) was shown in one individual. By mapping the mutation onto three-dimensional models of the Gα subunit in three different complexed states, we found that the three mutants (c.521A>G [p.Asp174Gly], c.836T>A [p.Ile279Asn], and c.572_592del [p.Thr191_Phe197del]) are predicted to destabilize the Gα subunit fold. A fourth mutant (c.607G>A), in which the Gly203 residue located within the highly conserved switch II region is substituted to Arg, is predicted to impair GTP binding and/or activation of downstream effectors, although the p.Gly203Arg substitution might not interfere with Gα binding to G-protein-coupled receptors. Transient-expression experiments suggested that localization to the plasma membrane was variably impaired in the three putatively destabilized mutants. Electrophysiological analysis showed that Gαo-mediated inhibition of calcium currents by norepinephrine tended to be lower in three of the four Gαo mutants. These data suggest that aberrant Gαo signaling can cause multiple neurodevelopmental phenotypes, including epileptic encephalopathy and involuntary movements

The Quiescent Intracluster Medium in the Core of the Perseus Cluster

Clusters of galaxies are the most massive gravitationally-bound objects in the Universe and are still forming. They are thus important probes of cosmological parameters and a host of astrophysical processes. Knowledge of the dynamics of the pervasive hot gas, which dominates in mass over stars in a cluster, is a crucial missing ingredient. It can enable new insights into mechanical energy injection by the central supermassive black hole and the use of hydrostatic equilibrium for the determination of cluster masses. X-rays from the core of the Perseus cluster are emitted by the 50 million K diffuse hot plasma filling its gravitational potential well. The Active Galactic Nucleus of the central galaxy NGC1275 is pumping jetted energy into the surrounding intracluster medium, creating buoyant bubbles filled with relativistic plasma. These likely induce motions in the intracluster medium and heat the inner gas preventing runaway radiative cooling; a process known as Active Galactic Nucleus Feedback. Here we report on Hitomi X-ray observations of the Perseus cluster core, which reveal a remarkably quiescent atmosphere where the gas has a line-of-sight velocity dispersion of 164+/-10 km/s in a region 30-60 kpc from the central nucleus. A gradient in the line-of-sight velocity of 150+/-70 km/s is found across the 60 kpc image of the cluster core. Turbulent pressure support in the gas is 4% or less of the thermodynamic pressure, with large scale shear at most doubling that estimate. We infer that total cluster masses determined from hydrostatic equilibrium in the central regions need little correction for turbulent pressure.Comment: 31 pages, 11 Figs, published in Nature July

A liver-derived secretory protein, selenoprotein P, causes insulin resistance

金沢大学医薬保健研究域医学系The liver may regulate glucose homeostasis by modulating the sensitivity/resistance of peripheral tissues to insulin, by way of the production of secretory proteins, termed hepatokines. Here, we demonstrate that selenoprotein P (SeP), a liver-derived secretory protein, causes insulin resistance. Using serial analysis of gene expression (SAGE) and DNA chip methods, we found that hepatic SeP mRNA levels correlated with insulin resistance in humans. Administration of purified SeP impaired insulin signaling and dysregulated glucose metabolism in both hepatocytes and myocytes. Conversely, both genetic deletion and RNA interference-mediated knockdown of SeP improved systemic insulin sensitivity and glucose tolerance in mice. The metabolic actions of SeP were mediated, at least partly, by inactivation of adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK). In summary, these results demonstrate a role of SeP in the regulation of glucose metabolism and insulin sensitivity and suggest that SeP may be a therapeutic target for type 2 diabetes. © 2010 Elsevier Inc

Inverse Correlation between Serum Levels of Selenoprotein P and Adiponectin in Patients with Type 2 Diabetes

Background: We recently identified selenoprotein P (SeP) as a liver-derived secretory protein that causes insulin resistance in the liver and skeletal muscle; however, it is unknown whether and, if so, how SeP acts on adipose tissue. The present study tested the hypothesis that SeP is related to hypoadiponectinemia in patients with type 2 diabetes. Methodology/Principal Findings: We compared serum levels of SeP with those of adiponectin and other clinical parameters in 36 patients with type 2 diabetes. We also measured levels of blood adiponectin in SeP knockout mice. Circulating SeP levels were positively correlated with fasting plasma glucose (r = 0.35, P = 0.037) and negatively associated with both total and high-molecular adiponectin in patients with type 2 diabetes (r = 20.355, P = 0.034; r = 20.367, P = 0.028). SeP was a predictor of both total and high-molecular adiponectin, independently of age, body weight, and quantitative insulin sensitivity index (b = 20.343, P = 0.022; b = 20.357, P = 0.017). SeP knockout mice exhibited an increase in blood adiponectin levels when fed regular chow or a high sucrose, high fat diet. Conclusions/Significance: These results suggest that overproduction of liver-derived secretory protein SeP is connected with hypoadiponectinemia in patients with type 2 diabetes

Efficient oxidation of alcohols electrochemically mediated by azabicyclo-N-oxyls

Preparation of azabicyclo-N-oxyls and the electrochemical oxidation of alcohols using them as mediators have been exploited. This oxidation was applicable to a transformation of sterically hindered secondary alcohols into the corresponding ketones in high yields