Comparison of two devices and two breathing patterns for exhaled breath condensate sampling.

Analysis of exhaled breath condensate (EBC) is a noninvasive method to access the epithelial lining fluid of the lungs. Due to standardization problems the method has not entered clinical practice. The aim of the study was to assess the comparability for two commercially available devices in healthy controls. In addition, we assessed different breathing patterns in healthy controls with protein markers to analyze the source of the EBC. EBC was collected from ten subjects using the RTube and ECoScreen Turbo in a randomized crossover design, twice with every device--once in tidal breathing and once in hyperventilation. EBC conductivity, pH, surfactant protein A, Clara cell secretory protein and total protein were assessed. Bland-Altman plots were constructed to display the influence of different devices or breathing patterns and the intra-class correlation coefficient (ICC) was calculated. The volatile organic compound profile was measured using the electronic nose Cyranose 320. For the analysis of these data, the linear discriminant analysis, the Mahalanobis distances and the cross-validation values (CVV) were calculated. Neither the device nor the breathing pattern significantly altered EBC pH or conductivity. ICCs ranged from 0.61 to 0.92 demonstrating moderate to very good agreement. Protein measurements were greatly influenced by breathing pattern, the device used, and the way in which the results were reported. The electronic nose could distinguish between different breathing patterns and devices, resulting in Mahalanobis distances greater than 2 and CVVs ranging from 64% to 87%. EBC pH and (to a lesser extent) EBC conductivity are stable parameters that are not influenced by either the device or the breathing patterns. Protein measurements remain uncertain due to problems of standardization. We conclude that the influence of the breathing maneuver translates into the necessity to keep the volume of ventilated air constant in further studies

pH in exhaled breath condensate and nasal lavage as a biomarker of air pollution-related inflammation in street traffic-controllers and office-workers

OBJECTIVE: To utilize low-cost and simple methods to assess airway and lung inflammation biomarkers relatedto air pollution.METHODS: A total of 87 male, non-smorking, healthy subjects working as street traffic-controllers or office-workers were examined to determine carbon monoxide in ixhaled breath and to measure the pH in nasal lavage fluid and exhaled breath condensate. Air pollution exposure was measured by particulate matter concentration, and data were obtained from fixed monitoring stations (8-h work intervals per day, during the 5 consecutive days prior to the study).RESULTS: Exhaled carbon monoxide was two-fold greater in traffic-controllers than in office-workers. The mean pH values were 8.12 in exhaled breath condensate and 7.99 in nasal lavage fluid in office-workers; these values concentrations in both substrates, however, Il-aB and IL-8 were elevated in nasal lavage fluid compared with exhaled breath condensate. The particulate matter concentration weas greater at the workplace of traffic-controllers compared with that of office-workers.CONCLUSION: The pH values of nasal lavage fluid and exhaled breath condensate are important, robust, easy to measure and reproducible biomarkers that can be used to monitor occupational exposure to air pollution. Additionally, traffic-controllers are at an increased risk of airway and lung inflammation during their occupational activities compared with office-workers

The effects of smoking and smoking cessation on nasal mucociliary clearance, mucus properties and inflammation

OBJECTIVE: The aim of the present study was to assess nasal mucociliary clearance, mucus properties and inflammation in smokers and subjects enrolled in a Smoking Cessation Program (referred to as quitters). METHOD: A total of 33 subjects with a median (IQR) smoking history of 34 (20-58) pack years were examined for nasal mucociliary clearance using a saccharine transit test, mucus properties using contact angle and sneeze clearability tests, and quantification of inflammatory and epithelial cells, IL-6 and IL-8 concentrations in nasal lavage fluid. Twenty quitters (mean age: 51 years, 9 male) were assessed at baseline, 1 month, 3 months and 12 months after smoking cessation, and 13 smokers (mean age: 52 years, 6 male) were assessed at baseline and after 12 months. Clinicaltrials.gov: NCT02136550. RESULTS: Smokers and quitters showed similar demographic characteristics and morbidities. At baseline, all subjects showed impaired nasal mucociliary clearance (mean 17.6 min), although 63% and 85% of the quitters demonstrated significant nasal mucociliary clearance improvement at 1 month and 12 months, respectively. At 12 months, quitters also showed mucus sneeze clearability improvement (∼26%), an increased number of macrophages (2-fold) and no changes in mucus contact angle or cytokine concentrations. CONCLUSION: This study showed that smoking cessation induced early improvements in nasal mucociliary clearance independent of mucus properties and inflammation. Changes in mucus properties were observed after only 12 months of smoking cessation

pH in exhaled breath condensate and nasal lavage as a biomarker of air pollution-related inflammation in street traffic-controllers and office-workers

OBJECTIVE: To utilize low-cost and simple methods to assess airway and lung inflammation biomarkers related to air pollution. METHODS: A total of 87 male, non-smoking, healthy subjects working as street traffic-controllers or office-workers were examined to determine carbon monoxide in exhaled breath and to measure the pH in nasal lavage fluid and exhaled breath condensate. Air pollution exposure was measured by particulate matter concentration, and data were obtained from fixed monitoring stations (8-h work intervals per day, during the 5 consecutive days prior to the study). RESULTS: Exhaled carbon monoxide was two-fold greater in traffic-controllers than in office-workers. The mean pH values were 8.12 in exhaled breath condensate and 7.99 in nasal lavage fluid in office-workers; these values were lower in traffic-controllers (7.80 and 7.30, respectively). Both groups presented similar cytokines concentrations in both substrates, however, IL-1β and IL-8 were elevated in nasal lavage fluid compared with exhaled breath condensate. The particulate matter concentration was greater at the workplace of traffic-controllers compared with that of office-workers. CONCLUSION: The pH values of nasal lavage fluid and exhaled breath condensate are important, robust, easy to measure and reproducible biomarkers that can be used to monitor occupational exposure to air pollution. Additionally, traffic-controllers are at an increased risk of airway and lung inflammation during their occupational activities compared with office-workers.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina Department of PathologyUniversidade de São Paulo Faculdade de Medicina Department of PhysiotherapyPhilipps University Department of PulmonologyLeiden University Medical Center Department of PulmonologyUniversidade Federal de São Paulo (UNIFESP) School of Medicine Department of PneumologyPneumology Division Pneumology DivisionInstituto do Coracao Instituto do CoracaoUniversidade de São Paulo Faculdade de MedicinaUniversidade de São Paulo Faculdade de Medicina Department of Internal MedicineUniversidade de São Paulo Public Health Faculty Department of EpidemiologyUniversidade de São Paulo Institute of Mathematics and StatisticsUNIFESP, School of Medicine Department of PneumologyFAPESP: 07/51605-9FAPESP: 09/50056-7CNPq: 555.223/06-0SciEL

Detection of volatile organic compounds as potential novel biomarkers for chorioamnionitis - proof of experimental models

Background: Histologic chorioamnionitis is only diagnosed postnatally which prevents interventions. We hypothesized that volatile organic compounds (VOCs) in the amniotic fluid might be useful biomarkers for chorioamnionitis and that VOC profiles differ between amnionitis of different origins. Methods: Time-mated ewes received intra-amniotic injections of media or saline (controls), or live Ureaplasma parvum serovar 3 (Up) 14, 7 or 3d prior to c-section at day 124 gestational age (GA). 100 μg recombinant ovine IL-1α was instilled at 7, 3 or 1d prior to delivery. Headspace VOC profiles were measured from amniotic fluids at birth using ion mobility spectrometer coupled with multi-capillary columns. Results: 127 VOC peaks were identified. 27 VOCs differed between samples from controls and Up- or IL-1α induced amnionitis. The best discrimination between amnionitis by Up vs. IL-1α was reached by 2-methylpentane, with a sensitivity/specificity of 96/95% and a positive predictive value/negative predictive values of 96 and 95%. The concentration of 2-methylpentane in VOCs peaked 7d after intra-amniotic instillation of Up. Discussion: We established a novel method to study headspace VOC profiles of amniotic fluids. VOC profiles may be a useful tool to detect and to assess the duration of amnionitis induced by Up. 2-methylpentane was previously described in the exhalate of women with pre-eclampsia and might be a volatile biomarker for amnionitis. Amniotic fluids analyzed by ion mobility spectrometry coupled with multi-capillary columns may provide bedside diagnosis of amnionitis and understanding inflammatory mechanisms during pregnancy

Die Effekte der Augmentationstherapie auf systemische sowie pulmonale Inflammationsmarker beim hereditären alpha1-Antitrypsinmangel

Hintergrund: α1-Antitrypsin (AAT), auch als α1-Proteinase-Inhibitor oder SERPINA1 bezeichnet, ist ein im menschlichen Blutplasma vorkommendes Protein, welches eine wichtige Funktion im Proteasen-Antiproteasen Verhältnis erfüllt. Bei entsprechender genetischer Voraussetzung kommt es zu verminderter AAT Sekretion der Leber und damit zu einem Mangel an AAT im Plasma. Der AAT-Mangel (AATM) prädisponiert zu einer früh einsetzenden und schnell voranschreitenden chronisch obstruktiven Lungenerkrankung (COPD) mit Lungenemphysem und entzündlichen Lebererkrankungen. Die einzige spezifische Therapie für den AATM stellt die Substitution mit humanem AAT dar. Der Nutzen der Substitutionstherapie ist mangels eindeutigen Nachweises der Wirksamkeit in prospektiv randomisierten Studien weiterhin Gegenstand der Diskussion. Sowohl die immunmodulatorische Funktion des AAT wie auch die Rolle der bei an AATM erkrankten Patienten vermehrt auftretenden AAT-Polymere sind bisher nur unzureichend verstanden. Ziel: Ziel dieser Arbeit war es systemische sowie lokale Inflammationsmarker bei Patienten mit hereditärem AATM in vivo als auch in vitro zu evaluieren und deren Reaktion auf die Substitution mit AAT zu untersuchen. Hierdurch sollten die antiinflammatorischen sowie die immunologischen Effekte des AAT untersucht werden. Zudem sollte der Einfluss der Substitutionstherapie mit der kommerziell erhältlichen Form Prolastin™ auf die Bildung von AAT-Polymeren erfasst und deren potentiell proinflammatorische Effekte in vitro evaluiert werden. Methoden: Es wurden 24 AATM Patienten mit nachgewiesenem PiZZ Genotyp in die Studie eingeschlossen. 12 Patienten erhielten eine wöchentliche Substitutionstherapie mit humanem AAT und 12 erhielten keine Substitution mit AAT. Serum und EBC Proben wurden vor Substitution, 2 Stunden danach und an Tag 3 nach Substitution mit AAT bei den augmentierten Patienten gewonnen. Es erfolgte die Bestimmung des totalen sowie polymeren AAT im Serum und der Zytokine/Chemokine und des C-reaktiven Proteins (CRP) im Serum und Atemwegskondensat (Exhaled Breath Condensate, EBC). Für die in vitro Versuche wurden neutrophile Granulozyten von 12 PiZZ homozygoten Spendern sowie primäre humane Bronchialepithelzellen mit den verschiedenen AAT-Fraktionen stimuliert und die Zytokine/Chemokine bestimmt. Ergebnisse: Die gemessenen AAT Spiegel sind nach Substitution von AAT signifikant höher als vor Substitution. Die AAT Konzentrationen fallen an Tag 3 nach Substitution, bleiben jedoch signifikant höher als vor Substitution. Nicht substituierte Patienten haben signifikant niedrigere AAT Spiegel als substituierte Patienten. Bei substituierten Patienten sind die Polymerkonzentrationen nach Substitution signifikant höher. IL-8 und MCP-1, aber auch IL-6, TNF und VEGF zeigen im Serum nach Substitution signifikante Schwankungen. Bei nicht augmentierten Patienten werden höhere IL-8 und niedrigere MCP-1 Werte beobachtet. Im EBC werden signifikant höhere CRP Konzentrationen bei den nicht substituierten Patienten gemessen. Im Zellversuch zeigt sich nach Stimulation mit Prolastin™ und Polymeren eine signifikant niedrigere IL-8 Sekretion der NG im Vergleich zu Monomeren. Die gemessenen IL-8 Konzentrationen nach Stimulation mit Monomer sind signifikant höher als die der Kontrolle. Bei der Stimulation der primären humanen Bronchialepithelzellen zeigen die verschiedenen Fraktionen des AAT keine unterschiedlichen Effekte auf die Sekretion von IL-6, IL-8 und MCP-1. Schlussfolgerung: Neben seiner Funktion im Proteasen-Antiproteasen Verhältnis zeigt AAT auch eine Funktion in der Regulation des Immunsystems. Der Einfluss des substituierten AAT auf die Zytokine IL-8 und MCP-1 lässt auf eine Funktion bei der Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten und Monozyten schließen. Im Vergleich der nicht substituierten mit den substituierten Patienten deuten die gemessenen höheren CRP Spiegel im EBC als auch die IL-8 Konzentrationen im Serum auf einen antiinflammatorischen Effekt des augmentierten AAT hin. Im Zuge der Substitution kommt es zu einem Anstieg der AAT-Polymere im Serum. Bei Stimulation der NG mit den verschiedenen AAT-Fraktionen zeigen sich unterschiedliche Wirkungen, wobei sich die nachweisbare Wirkung der hochmolekularen AAT Fraktion ähnlich wie Prolastin™ verhält. Eine toxische Wirkung von nicht modifizierten AAT-Polymeren auf humane Bronchialepithelzellen konnte in dieser Arbeit nicht nachgewiesen werden

Divergente Effekte der Substitutionstherapie auf polymorph-nukleäre Granulozyten beim hereditären α1-Antitrypsinmangel

Hintergrund: α1-Antitrypsin (AAT) ist ein im Körper ubiquitär vorkommendes Akute- Phase-Glykoprotein das neben seiner Aufgabe als Antiprotease wichtige immunmodulatorische Funktionen erfüllt. Bei Patienten mit vererbtem α1-Antitrypsinmangel (AATM) kommt es aufgrund der relativ verringerten Serumkonzentration zu einer Unterschreitung des protektiven Antiproteasespiegels. Im langfristigen Krankheitsverlauf kommt es bei diesen Patienten häufig zu einer systemischen Inflammation und dem progredienten Fortschreiten eines panazinären Lungenemphysems, das dem Krankheitsbild der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung stark ähnelt. Als Hauptproduzenten der gewebedestruierenden Proteasen stehen die polymorph-nukleären Granulozyten (PMN) im Fokus des emphysematischen Umbaus. Im Rahmen aktueller Studien werden weitere Effekte dieser Zellen am pathophysiologischen Prozess untersucht. Die einzige spezifische Therapie ist die wöchentliche Substitution mit humanem AAT. Aufgrund der bisher unzureichenden Datenlage zur klinischen Wirksamkeit steht die Substitutionstherapie in der Literatur noch immer im Mittelpunkt der Diskussion. Ziel: Ziel dieser Dissertation war es, die Effekte der Substitutionstherapie mit Prolastin® in Bezug auf die Aktivierung der PMNs in Patienten mit AATM zu untersuchen. Im Umkehrschluss sollten die Auswirkungen des hohen systemischen, inflammatorischen Potentials auf das infundierte AAT beobachtet werden. Methoden: Für die Studie wurden die PMN-Degranulationsmarker Matrix-Metalloproteinase-9 (MMP-9) und Myeloperoxidase (MPO) im Serum von 22 AATM-Patienten mit nachgewiesenem PI*ZZ-Genotyp direkt vor sowie zwei Stunden bzw. drei Tage nach der Infusion analysiert. Bei einem Patienten gelang die Verlaufsbeobachtung der Marker über eine Woche. Zusätzlich erfolgte die Bestimmung der unterschiedlichen AAT-Fraktionen im Serum der Patienten. Um die direkten Auswirkungen von Prolastin® und oxidiertem AAT beobachten zu können, wurden für die ex vivo Versuche PMNs von acht Patienten direkt vor und zwei Stunden nach Infusion isoliert. Anschließend wurden diese Zellen für vier Stunden mit Prolastin® bzw. chemisch oxidiertem AAT (oxAATc) stimuliert und die Effekte auf die Freisetzung von MMP-9, MPO und Interleukin-8 bzw. die neutrophile Adhäsion beobachtet. Die nachfolgenden Untersuchungen wurden mit den Werten nicht-substituierter AATM-Patienten bzw. gesunder Probanden verglichen. Ergebnisse: Zwei Stunden nach Infusion zeigten substituierte Patienten eine kurzzeitige Aktivierung der PMNs in Form einer Degranulation von MMP-9 und MPO parallel zum AAT-Serumanstieg. Am dritten Tag lagen beide Marker unter dem Niveau nicht-substituierter Patienten. Zusätzlich lagen sowohl die MPO, als auch die MMP-9-Serumspiegel an Tag 3 unterhalb der Ausgangswerte vor Substitution; im Falle von MPO war dieser Unterschied auch statistisch signifikant. Die Wochenverläufe bestätigten den Trend einer niedrigeren PMN-Aktivierung gegen Mitte der Woche. In den weiteren Serumanalysen zeigte sich eine nach Infusion gemessene Komplexierung und Oxidation des infundierten AATs, die sich auch im Wochenverlauf bestätigte. In den ex vivo Versuchen konnte bei allen Probandengruppen eine vermehrte PMN-Aktivität in Form einer Freisetzung von MMP-9, MPO und IL-8 durch die Stimulation von Prolastin® und oxAATc beobachtet werden. Prolastin® und oxAATc unterschieden sich in diesem Fall nicht voneinander. Die neutrophile Adhäsion zeigte sich im Allgemeinen keine Veränderung durch Stimulation mit Prolastin® oder oxAATc. Schlussfolgerung: Die MMP-9- und MPO-Degranulation deutet auf eine, zumindest kurzzeitige, infusionsbedingte Aktivierung der PMNs hin. Der anschließend relevante Abfall bis Tag 3 und darüber hinaus lässt indessen auf einen längerfristig anti-inflammatorischen Effekt der Substitutionstherapie schließen. Die Gründe für die kurzzeitige Aktivierung der PMNs sind zum jetzigen Zeitpunkt noch nicht vollständig geklärt. Die Ergebnisse lassen auf pleiotrope Effekte der Substitutionstherapie mit Prolastin® schließen. Das infundierte AAT scheint nach Infusion, zumindest teilweise, bei systemischer Inflammation zu oxidieren und höhermolekulare Komplexe zu bilden. OxAAT hat, abgesehen vom Verlust der Antiproteasefunktion und verglichen mit Prolastin®, keine zusätzlich krankheitsfördernden, immunologischen Effekte auf die PMNs in ihrer zentralen pathophysiologischen Rolle