Extração, purificação, caracterização estrutural e atividade antioxidante e antifadiga de pectinas obtidas da acerola (Malphigia emarginata)

Orientadora : Profª Drª Lucimara M.C. CordeiroCoorientador : Prof. Dr. Marcello IacominiDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 30/03/2017Inclui referênciasResumo: Malpighia emarginata é uma planta frutífera tropical, encontrada naturalmente nas ilhas do Caribe e na América do Sul, seu fruto comestível é conhecido como Acerola ou Barbados Cherry. Seus polissacarídeos foram obtidos por extrações aquosas, submetidas ao processo de congelamento e descongelamento e por ultrafiltração. Foram realizadas análises de composição monossacarídica, HPSEC, metilação e obtidos espectros de RMN da fração purificada (ACWS-01E). Os resultados apresentaram uma pectina rica em arabinana, com massa molar de 6.1 x 104 g/mol e constituída principalmente por uma homogalacturonana altamente metil-esterificada (DM= 86%) e arabinanas ramificadas. Estas últimas estão ancoradas em regiões de ramnogalacturonana do tipo I. A cadeia principal das arabinanas são constituídas por unidades de ?-Araf (1?5)-ligadas ramificadas somente em O-3. A potencial atividade antioxidante intracelular da fração ACWS-01E contra o stress oxidativo induzido pelo H2O2 em linhagem celular de fibroblasto murino (3T3) foi determinada através da sonda DCFH-DA. O tratamento com a fração ACWS-01E reduziu significativamente o efeito citotóxico induzido pelo H2O2, assim como os níveis de ROS. Estes resultados sugerem que ACWS-01E protegeu e aumentou a viabilidade das células NIH-3T3 após toxicidade induzida pelo H2O2 através da diminuição dos níveis intracelulares de ROS. Uma nova extração foi realizada para obter quantidade suficiente de amostra para avaliar atividades biológicas in vivo, da fração denominada ACWS. Esta nova fração apresentou 93% de carboidratos totais, massa molar relativa de 7,5 × 104 g/mol, ácido galacturônico, arabinose, galactose, xilose e ramnose numa relação molar de 52,1:32,4:7,2:4,8:3,5 e teve sua estrutura confirmada por análises de RMN. A atividade antifadiga da fração ACWS foi avaliada utilizando o Weight load swim test. ACWS foi administrada via oral em doses de 50 mg/kg, 100 mg/kg e 200 mg/kg durante 28 dias. Foram determinados parâmetros bioquímicos plasmáticos, respiração de fibras musculares esqueléticas permeabilizadas e dosados níveis de GSH e lipoperoxidação (LPO) em diferentes áreas do cérebro (córtex pré-frontal, hipocampo, estriado e hipotálamo). ACWS prolongou o tempo de natação, aumentou os níveis plasmáticos de glucose, triglicérideos, lactato e os níveis de GSH no hipocampo em todas as doses testadas. A capacidade respiratória mitocondrial do músculo esquelético foi aumentada nas doses média e alta de ACWS. Este estudo fornece uma forte evidência de que a suplementação de polissacarídeos pécticos da M. emarginata tem atividade antifadiga, pode modificar a cinética da mobilização de substratos energéticos (carboidratos e gorduras) e a capacidade respiratória do músculo esquelético, bem como o status antioxidante no hipocampo dos animais. Palavras-chave: Malpighia emarginata, pectina, atividade antioxidante intracelular, atividade antifadiga.Abstract: Malpighia emarginata is a tropical fruit plant, found naturally in the Caribbean islands and South America that produces an edible fruit known as acerola or Barbados Cherry. Its polysaccharides were obtained by aqueous extraction, submitted to a freezing and thawing process and ultrafiltration. A homogeneous fraction (ACWS- 01E) was analyzed by sugar composition, HPSEC, methylation and NMR spectroscopy analyses. The results showed an arabinan-rich pectic polysaccharide, with 6.1 x 104 g/mol and formed mainly by a high methyl esterified (DM= 86%) homogalacturonan and branched arabinan. This latter is anchored in type I rhamnogalacturonan regions. The main chain of arabinan consisted of (1?5)-linked ?-Araf, branched only at O-3. The potential ACWS-01E intracellular antioxidant activity against H2O2-induced oxidative stress in murine fibroblast cell line (3T3) was determined by DCFH-DA assay. The treatment with ACWS-01E significantly reduced H2O2-induced cytotoxic effect and the levels of ROS. These findings suggested that ACWS-01E protected and improved NIH 3T3 cell viability from H2O2-induced toxicity by decreasing intracellular levels of ROS. A new extraction was performed to obtain sufficient amount of sample of ACWS fraction to perform biological activities in vivo. This fraction presented 93% of total carbohydrate, relative molecular weight of 7.5 × 104 g/mol, galacturonic acid, arabinose, galactose, xylose and rhamnose in 52.1:32.4:7.2:4.8:3.5 molar ratio and had its structure confirmed by NMR analysis. The anti-fatigue activity of ACWS was evaluated using the weight load swim test on trained mice. ACWS was orally administered at doses of 50mg/kg, 100mg/kg and 200mg/kg for 28 days. Plasma biochemical parameters, respiration of permeabilized skeletal muscle fibers, and GSH levels and lipoperoxidation (LPO) in the brain (prefrontal cortex, hippocampus, striatum and hypothalamus) were determined. ACWS could lengthen the swimming time, increase the plasma levels of glucose, triglycerides, lactate, and the GSH levels in the hippocampus at all tested doses. The mitochondrial respiratory capacity of the skeletal muscle was increased at middle and high ACWS dose. This study provides strong evidence that M. emarginata pectic polysaccharide supplementation have anti-fatigue activity, can modify the kinetics of energy substrates (carbohydrate and fat) mobilization and the respiratory capacity of the skeletal muscle, as well the antioxidant status in the hippocampus of ACWS treated animals. Keywords: Pectin; Malpighia emarginata; intracellular antioxidant activity, antifatigue activity

Comparative histology of the human and teleost fish thymus / Histologia Comparativa de timo de humanos e peixes teleósteos

Thymus is considered a key component of the vertebrates’ immune system. It is an organ that is only found in these animals whose development may be accompanied through the evolutionary scale, being considered as a facilitator and regulator in the interaction of lymphoid cells and lymphoid organs. In this study not only a morphological but also functional homology were demonstrated, in that it affects the immune system, of the humans and teleost fish thymus. The material of study was composed of the thymus tissue samples of humans who were donated by the Department of Pathology of Hospital Parmenio Piñero, Buenos Aires Argentina belonging to two patients with ages between 6 and 8 years, as well as specimens of fish from different origins. The thymic tissue samples were submitted to histological analysis, immunohistochemistry and transmission electron microscopy. Through the data shown here it is possible to consider that, both in fish as in humans, there are two tracks in the modulation of the immune response, an afferent pathway that begins with the presentation of the antigen and an efferent pathway through which  the result of the lymphocytes, antibodies stimulation  or other effector mechanisms are canalized. In these two phases both in humans and in fish, a mixed population of lymphocytes, the differentiation of lymphocytes in the thymus and the T4 lymphocytes production, play a fundamental role in the success of the immune response. Keywords:

Extração, purificação, caracterização estrutural e atividade antioxidante e antifadiga de pectinas obtidas da acerola (Malphigia emarginata)

Orientadora : Profª Drª Lucimara M.C. CordeiroCoorientador : Prof. Dr. Marcello IacominiDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 30/03/2017Inclui referênciasResumo: Malpighia emarginata é uma planta frutífera tropical, encontrada naturalmente nas ilhas do Caribe e na América do Sul, seu fruto comestível é conhecido como Acerola ou Barbados Cherry. Seus polissacarídeos foram obtidos por extrações aquosas, submetidas ao processo de congelamento e descongelamento e por ultrafiltração. Foram realizadas análises de composição monossacarídica, HPSEC, metilação e obtidos espectros de RMN da fração purificada (ACWS-01E). Os resultados apresentaram uma pectina rica em arabinana, com massa molar de 6.1 x 104 g/mol e constituída principalmente por uma homogalacturonana altamente metil-esterificada (DM= 86%) e arabinanas ramificadas. Estas últimas estão ancoradas em regiões de ramnogalacturonana do tipo I. A cadeia principal das arabinanas são constituídas por unidades de ?-Araf (1?5)-ligadas ramificadas somente em O-3. A potencial atividade antioxidante intracelular da fração ACWS-01E contra o stress oxidativo induzido pelo H2O2 em linhagem celular de fibroblasto murino (3T3) foi determinada através da sonda DCFH-DA. O tratamento com a fração ACWS-01E reduziu significativamente o efeito citotóxico induzido pelo H2O2, assim como os níveis de ROS. Estes resultados sugerem que ACWS-01E protegeu e aumentou a viabilidade das células NIH-3T3 após toxicidade induzida pelo H2O2 através da diminuição dos níveis intracelulares de ROS. Uma nova extração foi realizada para obter quantidade suficiente de amostra para avaliar atividades biológicas in vivo, da fração denominada ACWS. Esta nova fração apresentou 93% de carboidratos totais, massa molar relativa de 7,5 × 104 g/mol, ácido galacturônico, arabinose, galactose, xilose e ramnose numa relação molar de 52,1:32,4:7,2:4,8:3,5 e teve sua estrutura confirmada por análises de RMN. A atividade antifadiga da fração ACWS foi avaliada utilizando o Weight load swim test. ACWS foi administrada via oral em doses de 50 mg/kg, 100 mg/kg e 200 mg/kg durante 28 dias. Foram determinados parâmetros bioquímicos plasmáticos, respiração de fibras musculares esqueléticas permeabilizadas e dosados níveis de GSH e lipoperoxidação (LPO) em diferentes áreas do cérebro (córtex pré-frontal, hipocampo, estriado e hipotálamo). ACWS prolongou o tempo de natação, aumentou os níveis plasmáticos de glucose, triglicérideos, lactato e os níveis de GSH no hipocampo em todas as doses testadas. A capacidade respiratória mitocondrial do músculo esquelético foi aumentada nas doses média e alta de ACWS. Este estudo fornece uma forte evidência de que a suplementação de polissacarídeos pécticos da M. emarginata tem atividade antifadiga, pode modificar a cinética da mobilização de substratos energéticos (carboidratos e gorduras) e a capacidade respiratória do músculo esquelético, bem como o status antioxidante no hipocampo dos animais. Palavras-chave: Malpighia emarginata, pectina, atividade antioxidante intracelular, atividade antifadiga.Abstract: Malpighia emarginata is a tropical fruit plant, found naturally in the Caribbean islands and South America that produces an edible fruit known as acerola or Barbados Cherry. Its polysaccharides were obtained by aqueous extraction, submitted to a freezing and thawing process and ultrafiltration. A homogeneous fraction (ACWS- 01E) was analyzed by sugar composition, HPSEC, methylation and NMR spectroscopy analyses. The results showed an arabinan-rich pectic polysaccharide, with 6.1 x 104 g/mol and formed mainly by a high methyl esterified (DM= 86%) homogalacturonan and branched arabinan. This latter is anchored in type I rhamnogalacturonan regions. The main chain of arabinan consisted of (1?5)-linked ?-Araf, branched only at O-3. The potential ACWS-01E intracellular antioxidant activity against H2O2-induced oxidative stress in murine fibroblast cell line (3T3) was determined by DCFH-DA assay. The treatment with ACWS-01E significantly reduced H2O2-induced cytotoxic effect and the levels of ROS. These findings suggested that ACWS-01E protected and improved NIH 3T3 cell viability from H2O2-induced toxicity by decreasing intracellular levels of ROS. A new extraction was performed to obtain sufficient amount of sample of ACWS fraction to perform biological activities in vivo. This fraction presented 93% of total carbohydrate, relative molecular weight of 7.5 × 104 g/mol, galacturonic acid, arabinose, galactose, xylose and rhamnose in 52.1:32.4:7.2:4.8:3.5 molar ratio and had its structure confirmed by NMR analysis. The anti-fatigue activity of ACWS was evaluated using the weight load swim test on trained mice. ACWS was orally administered at doses of 50mg/kg, 100mg/kg and 200mg/kg for 28 days. Plasma biochemical parameters, respiration of permeabilized skeletal muscle fibers, and GSH levels and lipoperoxidation (LPO) in the brain (prefrontal cortex, hippocampus, striatum and hypothalamus) were determined. ACWS could lengthen the swimming time, increase the plasma levels of glucose, triglycerides, lactate, and the GSH levels in the hippocampus at all tested doses. The mitochondrial respiratory capacity of the skeletal muscle was increased at middle and high ACWS dose. This study provides strong evidence that M. emarginata pectic polysaccharide supplementation have anti-fatigue activity, can modify the kinetics of energy substrates (carbohydrate and fat) mobilization and the respiratory capacity of the skeletal muscle, as well the antioxidant status in the hippocampus of ACWS treated animals. Keywords: Pectin; Malpighia emarginata; intracellular antioxidant activity, antifatigue activity

Mechanobiological regulation of early stage bone repair

Each year in the United States alone, several hundred thousand people suffer skeletal fractures that do not heal from the original treatment, resulting in non-union. To improve patient outcomes, there is a clinical need for therapeutic strategies that stimulate bone repair. The skeleton dynamically adapts its structure and composition to mechanical loads, and controlled loading via rehabilitation represents a non-pharmacologic target with the potential to stimulate endogenous bone regeneration. The primary objectives of this thesis were to develop technical approaches to longitudinally monitor dynamic mechanical cues during bone healing and elucidate how specific magnitudes promote repair. Our overall hypothesis was that moderate mechanical stimulation exerted via periodic walking could enhance bone regeneration. To test this hypothesis, we engineered a fully implantable wireless strain sensor platform that enabled real-time non-invasive monitoring of mechanical cues in a pre-clinical model of skeletal repair. We discovered that early-stage strain magnitudes correlated with significantly improved healing outcomes. We also observed that osteogenic mechanical loading exerted effects on early stage biological processes that precede mineralization, including immune cytokine signaling and angiogenesis. At the conclusion of the experiments, we attained a deeper understanding of how specific mechanical cues regulate bone repair, and established a novel sensor platform to further investigate mechanobiology. The knowledge gained by this thesis aids the development of integrative therapeutic strategies that stimulate bone repair via functional rehabilitation. In addition, the technological outcomes of this thesis serve as foundational support for the expanded development of implantable medical sensor technologies with broad implications to enhance diagnostics, therapeutic development, and interventional surveillance.Ph.D

Desenvolvimento ontogênico do rim, timo e baço e expressão fenotípica dos receptores CD3 e CD4 em linfócitos do bijupirá Rachycentron canadum

Dissertação(mestrado)- Universidade Federal do Rio Grande, Programa de Pós-Graduação em Aqüicultura, Instituto de Oceanografia, 2012.O bijupirá Rachycentron canadum, apresenta várias características favoráveis para a aquicultura, como alta taxa de crescimento, bons coeficientes de eficiência alimentar e carne de excelente qualidade, entre outras. No presente estudo foi realizada uma análise do sistema imune do bijupirá através de técnicas de histologia e imunohistoquímica. A ontogenia dos órgãos imunocompetentes (rim anterior, timo e baço) em larvas e juvenis de bijupirá, desde a eclosão até 53 dias após a eclosão (dae), foi realizada através da análise histológica. O rim foi o primeiro órgão linfohematopoiético a aparecer, presente no 1º dia após eclosão (dae) (3,8 ± 0,04mm), o surgimento do baço foi no 5º dae (4,8 ± 0,2mm) e no 7º dae (5,4 ± 0,2 mm) o timo; conforme análise os órgãos linfóides tornaram-se evidente com o avanço da idade do peixe. Foi possível também estabelecer a presença de receptores específicos de linfócitos através da imunomarcação com anticorpo monoclonal anti-CD3 e anti-CD4. Foi encontrado no timo os primeiros receptores linfocitários CD3 ao 7º dae com 27% mm² e 99% mm² de tecido tímico aos 53 dae (154 ± 4,6mm). A expressão fenotípica dos receptores CD3 no rim foi destacada no 8º dae (6,5 ± 0,1mm) com uma expressão de 10% mm² e 32% mm² de tecido renal aos 53 dae. A imunomarcação dos receptores linfocitários CD4 foi destacada inicialmente no timo com 7 dae, com 5% mm² e aos 53 dae com 63% mm² de linfócitos imunomarcados com anti-CD4. No Rim, a população de linfócitos T4 foi registrada primeiramente aos 13º dae (12,4 ± 0,7 mm) com 9% mm² e aos 53 dae com 28% mm² da população linfocitária CD4 do tecido renal, definindo o desenvolvimento funcional do sistema específico, associada a capacidade da memória imunológica. Também foi possível estabelecer que ocorre uma repovoação de linfócitos T no rim anterior, os linfócitos que migram do rim anterior para o timo e adquirem receptores específicos de células T, retornando ao rim anterior e mantendo suas atividades imunes. O estudo dos mecanismos do sistema imune são importantes para o sucesso de um cultivo, pois as doenças são uma das principais causas de perdas econômicas na aquicultura em todo mundo.The cobia Rachycentron canadum has several desirable traits for aquaculture, most importantly a rapid growth rate, good feed conversion ratio and good flesh quality. In the present study, the immune system of cobia was evaluated through histology and immunohistochemistry. Ontogeny of immunocompetent organs (head kidney, thymus and spleen) in cobia larvae and juveniles from hatching to 53 days after hatching (dah) was histologically described. The first lymphohematopoietic organ to appear was the kidney, at 1 dah (3.8 ± 0.04 mm), followed by the spleen at 5 dah (4.8 ± 0.2 mm) and the thymus at 7 dah (5.4 ± 0.2 mm); the lymphoid organs became evident as the fish grew older. It was also possible to establish the presence of specific lymphocyte receptors through immunolabeling with the monoclonal antibodies anti-CD3 and anti-CD4. The first evidence of CD3 lymphocyte receptors was found at 7 dah with 27% mm² of thymic tissue and at 8 dah (6.5 ± 0.1 mm) in the kidney, expressed in 10% of the kidney tissue. Initially, 5% mm2 of lymphocytes with CD4 lymphocyte receptors were initially immunolabeled in the thymus. In the kidney, T4 lymphocyte population was registered to be present at 13 dah (12.4 ± 0.7 mm) with 9% mm², defining the functional development of the specific system, associated to immunological memory capacity It was also possible to establish a repopulation of T lymphocytes in the head kidney; lymphocytes migrate from the head kidney to the thymus and acquire specific T-cell receptors, returning to the head kidney and maintaining their immune activities. The knowledge about the immune system mechanisms is important for farming activities, as diseases are the major causes of economic losses in global aquaculture

Pulse granulomas detected in peritoneum of a wild rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, with acanthocephalan infections

Pulse granulomas (PG) are reactions to particles of food that are characterized by clusters of small to medium-sized hyaline rings. This report describes a case of multiple pulse granulomas, found adhering to the visceral and parietal peritoneum of the abdominal wall of a wild rainbow trout. This was associated with fistulae, involving the gastrointestinal tract, resulting from deep penetration of acanthocephalans into the intestinal wall

Hemangioma esclerosante mandibular em Paralichthys orbignyanus: relato de caso

RESUMO Neste trabalho, descreveu-se o primeiro caso de hemangioma esclerosante registrado em um exemplar adulto do linguado Paralichthys orbignyanus. Produzido a partir de reprodução artificial, o peixe em questão tinha aproximadamente 10 anos de idade e fazia parte de um plantel de reprodutores. Ao ser retirado do tanque, notou-se a presença de lesão mandibular com escoriações e focos hemorrágicos. Amostras do tumor foram coletadas da mandíbula para análise histopatológica. Microscopicamente foi observada uma proliferação de numerosos vasos sanguíneos rodeados por um estroma conectivo denso. A etiologia dessa neoplasia é desconhecida, mas o fato de o exemplar ter permanecido por muitos anos em cativeiro pode ter contribuído para o surgimento desse tipo de lesão, devido aos choques mecânicos contra a parede do tanque que acontecem esporadicamente

Moderate pathogenic effect of Ligophorus uruguayense (Monogenoidea, Ancyrocephalidae) in juvenile mullet Mugil liza (Actinopterygii, Mugilidae) from Brazil

ABSTRACT Monogenoidea pathogenic activity can elicit various histological responses in fish. Species of Ligophorus are specific parasites of mullets, and its relationship with host fish may result in a moderate pathogenic action. In order to ascertain this relationship, estuarine mullets (Mugil liza) were collected in an estuary, reared in laboratory, for three weeks, and forwarded for histological and parasitological analyses. Ligophorus uruguayense (Monogenoidea) infestation in the gills of the mullets was identified. The severe infestation by only one species of Monogenoidea may result from the specificity of these parasites to mullets. Mullets submitted to histological analysis exhibited respiratory epithelium detachment; mild, moderate and severe hyperplasia of the respiratory epithelium; atrophy; and telangiectasia of the gills. This is the first study reporting that mullets highly infested by Monogenoidea can show mild (100%) to severe (20%) gill changes with a distinct frequency of occurrence. Because of the high prevalence of mild alterations observed, it is possible to accept that L. uruguayense is moderately pathogenic to M. liza, even during high prevalence and intensity of infestation, as a result of its specificity

Characterization of Cell-Type-Specific Drug Transport and Resistance of Breast Cancers Using Tumor-Microenvironment-on-Chip

Heterogeneous response and resistance of cancer cells to chemotherapeutic drugs pose a significant challenge for successful cancer treatments. In this study, an integrated experimental and theoretical analysis of cellular drug transport was developed. The experimental platform, called tumor-microenvironment-on-chip (T-MOC), is a microfluidic platform where cancer cells were cultured within a three-dimensional extracellular matrix perfused with interstitial fluid. Three types of human breast cancer cell lines (MCF-7, MDA-MB-231, and SUM-159PT) were cultured on this T-MOC platform, and their drug response and resistance to doxorubicin were characterized by time-lapse quantitative fluorescence microscopy. To study the effects of nanoparticle-mediated drug delivery, the transport and action of doxorubicin encapsulated nanoparticles were also examined. Based on the experimental data obtained, a theoretical model was developed to quantify and ultimately predict the cellular transport processes of drugs cell-type specifically. The results demonstrate that the cellular drug transport can be cell-type-specifically quantified by rate constants representing the uptake and efflux of doxorubicin across the cellular membrane