Interview with Eloise Kloke

Assistant Chancellor Administration, 1964Digitized 2013 by Avant Productions, Inc

Entwicklung von SIVsmmPBj- und HIV-2-abgeleiteten lentiviralen Vektoren für einen effizienten gp91phox-Gentransfer in Monozyten

SIVsmmPBj-derived lentiviral vectors are capable of efficient primary human monocyte transduction, a capacity which is linked to the viral accessory protein Vpx. To enable novel gene therapy approaches targeting monocytes, in this thesis it was aimed to generate enhanced lentiviral vectors that meet the required standards for clinical applications with respect to gene transfer efficiency and safety. The vectors were tested for their suitability in a relevant therapeutic gene transfer approach. At first, it was investigated whether vectors derived from another Vpx-carrying lentivirus reveal the same capacity for monocyte transduction as SIVsmmPBj-derived vectors. A transduction experiment using HIV-2-derived vectors in comparison to PBj-derived vectors revealed a comparable transduction capacity, thus disproving the assumed uniqueness of the PBj vectors. The further generation and analysis of expression constructs for the vpx genes of HIV-2 and SIVmac demonstrated a similar functionality in monocyte transduction as the Vpx of PBj. As VpxPBj, both Vpx proteins facilitated monocyte transduction of a vpx-deficient PBj-derived vector system. For the generation of enhanced SIVsmmPBj and HIV-2 vector systems, only the transfer vectors were optimized, since the packaging vectors available already meet current standards. At first, several modifications were introduced into an available preliminary PBj-derived transfer vector by conventional cloning. The modifications included insertions of cPPT/CTS and WPRE as well as the deletions of the remaining pol sequence, the second exons of tat end rev, and the U3-region within the 3’LTR to generate a SIN vector. Thus, beside safety enhancement, the vector titers were also increased from 9.1x105 TU/ml achieved after concentration with the initial transfer vector up to 1.1x107 TU/ml with the final transfer vector. The PBj vector retained its capability of monocyte transduction when supplemented with Vpx. This conventional method of vector enhancement is time-consuming and may result in only sub-optimal vectors, since it depends on the presence of restriction sites which may not allow deletion of all needless sequences. Moreover, mutations may accumulate during the high number of cloning and amplification steps. Therefore, a new and easier method for lentiviral transfer vector generation was conceived. Three essential segments of the viral genome (5‘ LTR, RRE, ΔU3-3’ LTR) are amplified on the template of the lentiviral wild-type genome and fused by Fusion-PCR. Further necessary elements namely the cPPT/CTS-element, MCS, and PPT are included into the resulting vector by extension of the nucleotide primers used for the PCRs. The amplified and fused vector-scaffold can easily be integrated into a plasmid backbone, followed by insertion of the expression cassette of choice. By applying this approach, two novel lentiviral transfer vectors, based on the non-human SIVsmmPBj and the human HIV-2, were derived. Vector titers achieved for PBj and HIV-2 vectors supplemented with Vpx reached up to 4.0x108 TU/ml and 5.4x108 TU/ml, respectively. The capacity for monocyte transduction was maintained. Thus, safe and efficient, state of the art HIV-2- and PBj-derived vector systems are now available for future gene therapy strategies. Finally, the new vectors were used to set up an approach for gene correction of gp91phox-deficient monocytes for the treatment of X-linked chronic granulomatous disease (xCGD). The administration of autologous, gene-corrected monocytes to counteract systemic and acute infections could lead to a decreased infection load, dissolve granulomas and therefore improve the survival rate of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) which is the current treatment of choice for this disease. First, methods for analysis of gp91phox function were established. Next, they were employed to demonstrate the capacity of monocytes, obtained from healthy humans or mice, for phagocytosis, oxidative burst, and Staphylococcus aureus killing. The in vivo half-life of murine monocytes in the bloodstream and their distribution to specific tissues was determined. Lastly, HIV-1 vectors were used to transfer the gp91phox gene into monocytes from gp91phox-deficient mice. This resulted in the successful restoration of the oxidative burst ability in the cells. In summary, the general suitability of the new vectors for treatment of CGD by monocyte transduction was demonstrated. The results of the mouse experiments provide the foundation for future challenge experiments to evaluate the capability of gene-corrected monocytes to kill off microbes in vivo.Vektoren, die vom simianen Immundefizienzvirus (SIV) smmPBj abgeleitet sind, besitzen die Fähigkeit primäre humane Monozyten zu transduzieren. Diese Fähigkeit ist von dem viralen Protein Vpx abhängig. Da Monozyten ein attraktives Ziel für die Gentherapie darstellen, sollten sichere und effiziente lentivirale Vektorsysteme konstruiert werden, die den Ansprüchen klinischer Applikationen gerecht werden. Anschließend sollten die Vektoren in die Entwicklung einer neuen potentiellen Anwendungsmöglichkeit integriert werden. Zunächst wurde untersucht, ob auch Vektorensysteme anderer Lentiviren, die ebenfalls ein vpx-Gen besitzen, zur Transduktion von Monozyten in der Lage sind. Es stellte sich heraus, dass HIV-2-abgeleitete Vektoren die gleiche Transduktionsfähigkeit wie PBj-abgeleitete Vektoren besitzen, was die bis dahin angenommene Einzigartigkeit der PBj-Vektoren widerlegt. Zudem wurde für die Vpx-Proteine von SIVmac und HIV-2 gezeigt, dass sie wie VpxPBj eine Transduktion von Monozyten durch PBj-abgeleitete Vektoren ermöglichen. Zur Herstellung von PBj- und HIV-2-abgeleiteten Vektoren wurden optimierte Transfervektoren generiert. Verpackungsvektoren waren für beide Vektorsysteme bereits verfügbar. In einem ersten Schritt wurde zunächst durch aufeinanderfolgende Klonierungsschritte der bereits vorhandene, einfache PBj-Transfervektor verbessert. Hierbei wurden sowohl Verbesserungen vorgenommen, die wichtig für die Sicherheit des Systems sind (self-inactivating (SIN)-Konfiguration, Minimierung der viralen Sequenzen) als auch Elemente integriert, die die Vektorproduktion und damit die Effizienz des Gentransfers verbessern (central polypurine tract / central termination sequence (cPPT/CTS), woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element (WPRE)). Mit den graduellen Verbesserungen der PBj-abgeleiteten Transfervektoren war es möglich den Titer im Vergleich zum Ausgangskonstrukt von 9,1x105 TU/ml auf 1,1x107 TU/ml nach Konzentration zu steigern. Generell ist eine sukzessive Optimierung von Transfervektoren aufgrund vieler notwendiger Klonierungsschritte und oft fehlender Restriktionsschnittstellen sehr aufwändig und kompliziert. Durch die eingeschränkten Restriktionsmöglichkeiten können überflüssige virale Sequenzen oft nicht einfach entfernt werden. Diese Probleme konnten in dieser Arbeit durch die Entwicklung einer Klonierungsstrategie, die die Herstellung von lentiviralen Transfervektoren stark vereinfacht, gelöst werden. Hierbei werden drei essentielle Segmente (5‘-LTR, RRE, ΔU3-3’ LTR) des Transfervektors, ausgehend von der viralen Wildtypsequenz, mittels PCR amplifiziert. Alle weiteren notwendigen Elemente, wie cPPT/CTS oder PPT, werden über Verlängerungen der verwendeten PCR-Primer integriert. Die Primer enthalten zudem komplementäre Sequenzen, durch welche die drei Segmente anschließend durch die Methode der Fusions-PCR verknüpft werden können. Das entstandene PCR-Fragment kann dann in ein bakterielles Plasmid integriert und eine Expressionskassette eingefügt werden. Mit dieser neuen Methode der Generation von Transfervektoren wurden von HIV-2- und SIVsmmPBj-abgeleitete Vektoren mit Titern bis zu 5,4x108 TU/ml bzw. 4,0x108 TU/ml generiert. Für alle optimierten Vektoren wurde die Fähigkeit, Monozyten in Abhängigkeit vom vpx-Gen effizient zu transduzieren, erhalten. Somit sind neue HIV-2- und PBj-abgeleitete lentivirale Vektoren entwickelt worden, die einen hohen Grad an Sicherheit und Effizienz für den Gentransfer in Monozyten aufweisen. Folglich konnte eine neue potentielle Anwendungsmöglichkeit für diese Vektoren entwickelt werden. Diese beruht auf der Gen-Korrektur von gp91phox-defizienten Monozyten zur Behandlung der X-chromosomal gebundenen Form der Septischen Granulomatose. Eine Reinfusion von autologen, gp91phox-korrigierten Monozyten könnte einen antibakteriellen und antimykotischen Effekt im Patienten zeigen und wäre so möglicherweise in der Lage akute Infektionsphasen einzuschränken oder vorhandene Granulome aufzulösen. Dies könnte zusätzlich die statistische Überlebensrate der gegenwärtig bevorzugten Therapie der Hämatopoetischen Stammzelltransplantation verbessern. Hierfür wurden zunächst verschiedene Methoden zur Analyse von murinen und humanen Monozyten etabliert und mit ihrer Hilfe die Fähigkeit der Phagozytose, des Oxidativen Burst sowie ein moderates Staphylococcus aureus „Killing“ in vitro bestätigt. Zusätzlich wurde die Biodistribution und die Halbwertszeit von Maus-Monozyten bestimmt. Daraufhin wurde das gp91phox-Gen in Monozyten von gp91phox-Knock-out-Mäusen ex vivo transferiert. Hierfür mussten HIV-1-Vektoren eingesetzt werden, da sich die in dieser Arbeit konstruierten HIV-2- oder SIVsmmPBj-Vektoren als ineffizient zur Transduktion von Maus-Monozyten erwiesen haben. Für eine zukünftige Anwendung am Menschen kämen umgekehrt nur die neuen Vektoren in Frage. Mit den HIV-1-Vektoren konnte das korrekte gp91phox-Gen in murine Monozyten eingebracht und die Fähigkeit zum „Oxidativen-Burst“ wiederhergestellt werden. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass in dieser Arbeit sichere und effiziente lentivirale Vektoren für den Gentransfer in primäre Monozyten generiert wurden. Die Analyse humaner und muriner Monozyten und Experimente zur Übertragung des gp91phox-Gens lassen erwarten, dass die Korrektur von gp91phox-defizienten Monozyten hilfreich für die Therapie der Septischen Granulomatose sein könnte, und dass das gp91phox-Knock-out-Mausmodell zur Erprobung dieses Ansatzes geeignet ist

Microsaccades under monocular viewing conditions

Among the eye movements during fixation, the function of small saccades occuring quite commonly at fixation is still unclear. It has been reported that a substantial number of these microsaccades seem to occur in only one of the eyes. The aim of the present study is to investigate microsaccades in monocular stimulation conditions. Although this is an artificial test condition which does not occur in natural vision, this monocular presentation paradigm allows for a critical test of a presumptive monocular mechanism of saccade generation. Results in these conditions can be compared with the normal binocular stimulation mode. We checked the statistical properties of microsaccades under monocular stimulation conditions and found no indication for specific interactions for monocularly detected small saccades, which might be present if they were based on a monocular physiological activation mechanism

Auslegung von Bauteilreinigungsanlagen mit Hilfe eines Fachinformationssystems

In der vorliegenden Arbeit wird ein internetbasiertes Fachinformationssystem für die industrielle Bauteilreinigung vorgestellt, welches eine gezielte Anwendung des hinterlegten Fachwissens auf spezifische Einsatzfälle erlaubt und dem Konstrukteur einfach zu handhabende Werkzeuge zur Verfügung stellt, die ihn bei der Planung und Konzeption von Reinigungsanlagen unterstützen. Das System ist unter der World-Wide-Web-Adresse 'www.bauteilreinigung.de' öffentlich zugänglich.Zunächst wird der Stand der Technik im Bereich der industriellen Bauteilreinigung dargestellt. Im nächsten Schritt wird ein Anforderungsprofil für Reinigungsanlagen entwickelt, welches hilft, alle zur Grobauslegung einer Reinigungsanlage relevanten Daten zu erfassen und sinnvoll zu quantifizieren. In einem Ordnungsschema für das 'Reinigen' wird eine strukturierte Einteilung sämtlicher derzeit in der industriellen Praxis eingesetzten Reinigungsverfahren entsprechend dem vorherrschenden Wirkprinzip vorgenommen. Im Bereich der Reinigungsmittel werden acht Gruppen mit grundlegend verschiedenen Eigenschaften und Einsatzgebieten unterschieden. Ein rechnergestütztes Vorbewertungssystem bewertet die einzelnen Reinigungsverfahren und -mittel im Hinblick auf konkrete Aufgabenstellungen und gibt dem Konstrukteur so eine Entscheidungsgrundlage für die Vorauswahl. Das für die Feinbewertung der verbliebenen Lösungsvarianten erforderliche tiefer gehende Fachwissen hinsichtlich der Reinigungstechnik stellt eine Wissensbasis zur Verfügung, die dem Konstrukteur auch konkrete Hilfestellung bei der Prozessauslegung und Anlagengestaltung gibt. Falls die Reinigungsanlage nicht selbst konstruiert, sondern von einem Fremdanbieter zugekauft werden soll, erlaubt eine Anbieterdatenbank eine gezielte Vermittlung geeigneter Kontakte. Abschließend werden Leitregeln für die reinigungsgerechte Bauteilgestaltung abgeleitet, welche dem Konstrukteur helfen sollen, bereits im frühen Stadium der Produktentstehung potentielle Schwierigkeiten hinsichtlich der späteren Reinigung zu erkennen und zu vermeiden

IL-2 Therapy Diminishes Renal Inflammation and the Activity of Kidney-Infiltrating CD4+ T Cells in Murine Lupus Nephritis

An acquired deficiency of interleukin-2 (IL-2) and related disturbances in regulatory T cell (Treg) homeostasis play an important role in the pathogenesis of systemic lupus erythematosus (SLE). Low-dose IL-2 therapy was shown to restore Treg homeostasis in patients with active SLE and its clinical efficacy is currently evaluated in clinical trials. Lupus nephritis (LN), a challenging organ manifestation in SLE, is characterized by the infiltration of pathogenic CD4+ T cells into the inflamed kidney. However, the role of the Treg-IL-2 axis in the pathogenesis of LN and the mode of action of IL-2 therapy in the inflamed kidneys are still poorly understood. Using the (NZB × NZW) F1 mouse model of SLE we studied whether intrarenal Treg are affected by a shortage of IL-2 in comparison with lymphatic organs and whether and how intrarenal T cells and renal inflammation can be influenced by IL-2 therapy. We found that intrarenal Treg show phenotypic signs that are reminiscent of IL-2 deprivation in parallel to a progressive hyperactivity of intrarenal conventional CD4+ T cells (Tcon). Short-term IL-2 treatment of mice with active LN induced an expansion the intrarenal Treg population whereas long-term IL-2 treatment reduced the activity and proliferation of intrarenal Tcon, which was accompanied by a clinical and histological amelioration of LN. The association of these immune pathologies with IL-2 deficiency and their reversibility by IL-2 therapy provides important rationales for an IL-2-based immunotherapy of LN.DFG, SFB 650, Zelluläre Ansätze zur Suppression unerwünschter Immunreaktionen - From Bench to Bedsid

The manifesto as an instrument of the systematic control of reception in the architecture and design discourse

In der vorliegenden Arbeit werden Manifestäußerungen des Design- und Architekturdiskurses im situativen, medialen, institutionellen und historischen Kontext untersucht. Auf Grundlage einer Analyse der Etymologie und der Ideengeschichte des Manifestes wird anhand ausgewählter Beispiele die These belegt, dass das Medium vor allem der gezielten Rezeptionssteuerung im Diskurs dient. Darüber hinaus wird die Fähigkeit und Bedeutung des Manifestes als Spiegel vergangener und gegenwärtiger, aber auch als Wegbereiter zukünftiger Diskurse analysiert und Entwicklungen des Manifestes hinsichtlich Stilistik, Inhalt, Funktion und Bedeutung im Design- und Architekturdiskurs dargestellt.This study examines manifestos from the design and architecture discourse in their situational, media, institutional and historical context. Based on an etymological analysis and on the manifesto’s history of ideas, the thesis uses selected examples to describe the manifesto as an instrument of the systematic control of reception in the discourse. In addition, the ability of the manifesto to mirror past and present discourses as well as to shape future discourses is shown. Also, the evolution of the manifesto regarding style, content, function and historical meaning will be analyzed

Insecticide resistance and vector status of Anopheles funestus and An. gambiae populations at a sugar estate in Mozambique

MSc (Med), Faculty of Health Sciences, University of the Witwatersrand, 2009Malaria is on the increase in Mozambique since 2001 and impacts primarily on children < 5 years of age. Insecticide resistance in the malaria vector mosquitoes is on the increase in Mozambique and Africa and is cause for serious concern. Maragra sugar estate is situated in close proximity to the nKomati river floodplain in a rural area in Mozambique and requires intense irrigation for cane growing and as a result provides extensive breeding sites for An. funestus and other mosquitoes. In the areas surrounding the estate there are two important vectors of malaria, Anopheles funestus group and An. gambiae complex. There is intense malaria transmission in the areas surrounding the sugar estate and the last entomological study on the vectors in the Manhica area was done in 1998. It was becoming increasingly urgent to identify to species level the vectors in this area and to monitor the insecticide resistance status of these vectors. Due to leakage (theft) of insecticides and a change by the National Malaria Control Programme (NMCP) to an insecticide to which the predominant vector is resistant, an entomological survey was carried out in this area from January 2009 to March 2009 to ascertain by Polymerase chain reaction (PCR) what species of malaria vectors were present inside and outside of the Maragra vector control area, their population levels and their vectorial status in these two areas. Insecticide resistance studies by insecticide exposure and the synergist piperonyl butoxide (pbo) were carried out using the World Health Organisation (WHO) bioassay method on collected An. funestus mosquitoes. This was done to establish this species resistance status to the four classes of insecticides recommended by the WHO for malaria vector control. The collections of An. arabiensis and An. merus that were identified were too few to carry out insecticide resistance tests on these two species. Enzyme linked v immuno-sorbent assay (ELISA) tests were undertaken to establish the vectorial capacity of Anopheles funestus and An. gambiae complex in this area. The predominant malaria vector species in this area is An. funestus s.s., with the secondary vector being An. arabiensis. An. funestus has a high vectorial capacity in this area and found to have a Plasmodium falciparum sporozoite rate of 6.02%. This is an increase in the sporozoite rate of 1.2% from 1998 when the last survey in this regard was carried out. Coupled with this increase is an increase in the An. funestus populations in this area since this time. One An. gambiae complex sample was found to be positive but the species is not known as this particular sample did not amplify on PCR. Anopheles funestus is highly resistant to synthetic pyrethroids and exhibits a lower level of resistance to bendiocarb, a carbamate insecticide in use at Maragra sugar estate. The synergist pbo mediates the resistance mechanism in both these insecticides indicating that the metabolic resistance mechanism present in this mosquito is strongly mediated by monooxygenase detoxification. The role of the medical entomologist is increasingly necessary and important in the monitoring of this resistance phenomenon in malaria vector mosquitoes, as is the role of the vector control programme manager in implementing and managing vector control programmes. The implication of cane sugar farming and its impact on vector production and malaria transmission is discussed. Insecticide resistance and the change by the NMCP to a synthetic pyrethroid to which the predominant vector of malaria is resistant is discussed

Vectorial status and insecticide resistance of Anopheles funestus from a sugar estate in southern Mozambique

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>The dual problems of rising insecticide resistance in the malaria vectors and increasing human malaria cases since 2001 in southern Mozambique are cause for serious concern. The selection of insecticides for use in indoor residual spraying (IRS) programmes is highly dependent on the extent to which local mosquitoes are susceptible to the approved classes of insecticides. The insecticide resistance status and role in malaria transmission of <it>Anopheles funestus </it>was evaluated at the Maragra Sugar Estate in southern Mozambique where an IRS vector control programme has been in operation for seven years using the carbamate insecticide bendiocarb.</p> <p>Results</p> <p>No <it>Anopheles </it>species were captured inside the sugar estate control area. <it>Anopheles funestus </it>group captured outside of the estate represented 90% (n = 475) of the total collections. Of the specimens identified to species by PCR (n = 167), 95% were <it>An. funestus s.s. </it>One <it>An. rivulorum </it>was identified and seven specimens did not amplify. The <it>Anopheles gambiae </it>complex was less abundant (n = 53) and of those identified (n = 33) 76% were <it>An. arabiensis </it>and 24% <it>An. merus</it>. Insecticide susceptibility tests showed that wild-caught and F-1 family <it>An. funestus </it>were resistant to deltamethrin (32.5% mortality) and lambda-cyhalothrin (14.6% mortality), less so to bendiocarb (71.5% mortality) and fully susceptible to both malathion and DDT (100%). Bendiocarb and pyrethroid resistance was nullified using 4% piperonyl butoxide (Pbo), strongly suggesting that both are mediated by P450 monooxygenase detoxification. ELISA tests <it>of An. funestus </it>for <it>Plasmodium falciparum</it>, gave a sporozoite rate of 6.02% (n = 166). One unidentified member of the <it>An. gambiae </it>complex tested positive for <it>P. falciparum </it>sporozoites.</p> <p>Conclusion</p> <p><it>Anopheles funestus </it>was found to be the most abundant and principle vector of malaria in this area, with members of the <it>An. gambiae </it>complex being secondary vectors. Despite the continual use of bendiocarb within the estate for seven years and the level of <it>An. funestus </it>resistance to this insecticide, the IVC programme is still effective against this and other <it>Anopheles </it>in that no vectors were found inside the control area. However, the Mozambique National Malaria Control Programme ceased the use of DDT and bendiocarb in this area of its operations in 2009, and replaced these insecticides with a pyrethroid which will increase insecticide resistance selection pressure and impact on control programmes such as the Maragra IVC.</p