Nuovi approcci terapici in modelli murini di neurodegenerazione di tipo Alzheimer

2010/2011La demenza di tipo Alzheimer (AD) rappresenta una delle principali patologie che affliggono la nostra società. Purtroppo, i trattamenti terapeutici oggi disponibili non sono in grado di bloccare l’inesorabile esito della malattia, ma solo di rallentarlo. Pertanto, lo studio di nuove strategie terapiche e la successiva validazione delle stesse sono obiettivi prioritari della ricerca, con robuste analisi da effettuare su modelli animali affidabili. Attualmente, nessuno dei modelli sperimentali di AD disponibili ricapitola in maniera soddisfacente i deficit funzionali e istopatologici propri della malattia. Molti studi si sono concentrati sulla deplezione del sistema colinergico del basal forebrain, associata classicamente ai deficit cognitivi; altri, facendo per lo più uso di animali transgenici, hanno investigato il possibile ruolo neurotossico del peptide β-amiloide, ottenendo tuttavia solo modeste alterazioni cognitive o neurochimiche. La disponibilità di un modello animale adeguato è pertanto fondamentale per valutare l’affidabilità di nuovi possibili approcci terapeutici. Negli ultimi anni diversi studi hanno dimostrato un importante coinvolgimento dei recettori sigma-1 nelle funzioni cognitive. Come risultato, sostanze agenti come agonisti dei recettori sigma-1 hanno attratto notevole interesse come promettenti composti ad azione pro-cognitiva. In particolare, i sigma-1 agonisti finora testati hanno manifestato efficacia variabile nel contrastare e migliorare, in vari modelli di malattia, il deficit mnemonico indotto da vari trattamenti. È possibile che questi ligandi migliorino l’apprendimento e la memoria attraverso un’azione diretta su propri recettori, espressi abbondantemente nelle regioni corticali e ippocampali implicate nei processi cognitivi, anche se non si può escludere una attivazione concomitante di altri recettori. Recenti studi hanno anche rilevato livelli anormali di proteina TDP 43, una ribonucleoproteina che contribuisce a formare aggregati proteici in pazienti colpiti da SLA, demenza frontotemporale e anche in pazienti con malattia di Alzheimer (più del 200% dei livelli normali). Alcune evidenze inoltre ritengono che un contributo importante all’insorgenza dei deficit cognitivi spaziali sia dovuto a una concomitante perdita di neuroni cerebellari. Tuttavia non è ancora non è noto se la lesione cerebellare sia sufficiente alla comparsa di questi deficit o se ci sia bisogno di un contemporaneo malfunzionamento di altri sistemi neuronali, come appunto quello colinergico basale affinché tali deficit divengano apparenti. Nel nostro laboratorio, abbiamo recentemente introdotto un modello murino che manifesta contemporaneamente alcune delle principali caratteristiche comportamentali e istopatologiche della malattia di Alzheimer. Lo scopo del lavoro è stato caratterizzare i deficit esibiti da tale modello, e su di esso testare diverse strategie terapiche. Per quest’ultimo scopo, sono stati impiegati due composti non commerciali di sintesi, denominati (-)-MR 22 e (±)PPCC, con azione agonista verso i recettori sigma-1 e la cui efficacia come neuroprottettori è già stata dimostrata in vitro, ma le cui possibili azioni pro-cognitive in vivo non sono note. Inoltre, dopo la caratterizzazione comportamentale e immunoistochimica, sono stati investigati i cambiamenti a livello molecolare di alcune sostanze chiave nello sviluppo della malattia quali APP, ChAT e TDP43, molecole il cui metabolismo è o sembra essere alterato in una situazione patologica di tipo Alzheimer. In particolare si è cercato di capire se la somministrazione dei sigma ligandi, oltre a migliorare la performance cognitiva, potesse normalizzare queste alterazioni proteiche. In esperimenti paralleli, si è iniziato a studiare il possibile coinvolgimento dei neuroni colinergici cerebellari nell’insorgenza dei deficit cognitivi spaziali in un modello murino di disfunzione cerebellare. Deplezioni colinergiche selettive e infusioni cerebrali localizzate di peptide amiloide 25-35 preaggregato e ligandi sigma sono state prodotte, separatamente o in congiunzione, in gruppi separati di ratti adulti, in modo da replicare i segni cognitivi e istopatologici della malattia e soprattutto investigare possibili interazioni tra i vari aspetti che potessero alterare, aggravandolo, il quadro generale. In tutti i soggetti studiati, frammenti di tessuto dell’ippocampo e della corteccia frontoparietale sono stati asportati e sottoposti a procedure di Western Blotting e RT PCR per valutare eventuali variazioni di mRNA e/o espressione proteica in seguito ai trattamenti. Le rimanenti porzioni sono state fissate ed utilizzate per analisi isto- ed immunoistochimiche. Gli animali con doppio trattamento (ossia lesione colinergica e infusione di amiloide) hanno presentato deficit di apprendimento e memoria spaziali superiori non solo rispetto ai controlli, ma anche ai gruppi che avevano ricevuto il trattamento singolo. A livello istochimico gli animali con doppia lesione presentavano una marcata deafferentazione colinergica corticale e ippocampale associata a gravi deplezioni neuronali nei nuclei d’origine e alla presenza di numerosi aggregati di proteina amiloide nelle regioni di iniezione. Con la tecnica del Western Blot, si è anche osservato che gli animali con doppia lesione esprimevano livelli aumentati del precursore proteico dell’amiloide (APP) non riscontrabili nei soggetti con trattamento singolo. Su tale modello, si è investigato il ruolo antiamnesico e neuroprotettivo di nuovi composti assimilabili alla famiglia degli agonisti dei recettori sigma-1. Negli esperimenti riportati nel presente lavoro, i composti (-)-MR 22 e (±)PPCC si sono rivelati efficaci nel migliorare le performance cognitive nei vari test impiegati, in particolare il primo è stato anche in grado di normalizzare anche l’espressione regionale di APP. L’azione di questi composti si esercita essenzialmente migliorando le performance degli animali durante i test comportamentali, mentre non appare modificata la morfologia tissutale e la deplezione tissutale degli animali trattati. Ulteriori esperimenti sono attualmente in corso. L’azione antiamnesica e neuroprotettiva indotta da (-)-MR 22 in vivo è interessante e in linea con recenti evidenze che attribuiscono un notevole potenziale terapeutico ai sigma-1 agonisti. Gli animali trattati infatti hanno esibito livelli di APP prossimi al normale; ciò suggerisce un ruolo del signaling sigma-1 nel promuovere meccanismi fisiologici di espressione e metabolismo di APP, inibendone la possibile azione citotossica. La RT-PCR per ChAT effettuata su omogenati di ippocampo ci ha dato una ulteriore conferma sulla avvenuta lesione colinergica in seguito alla somministrazione della tossina saporina. Mentre la stessa analisi per TDP43 sembra rilevare un effettivo aumento nella produzione dell’mRNA di questa proteina, perlomeno negli animali trattati con la tossina colinergica, anche se sono necessari ulteriori esperimenti per stabilire quale sia il reale apporto delle lesioni nei cambiamenti visti con la Real Time PCR. Gli animali trattati con l’immunotossina sia nei nuclei del forebrain basale sia in cervelletto mostrano evidenti deficit nelle performance dei test comportamentali di memoria spaziale rispetto agli animali lesionati solo in cervelletto o solo nei nuclei del forebrain basale, indicando un possibile coinvolgimento dei neuroni cerebellari nell’elaborazione delle informazioni di cognizione spaziale. Un altro approccio terapeutico che si intende testare in futuro è rappresentato dal trapianto, nelle aree cerebrali lesionate, di progenitori neurali di varia provenienza. Di tali cellule si studierà la capacità di integrazione anatomica e di promozione del recupero funzionale e di normalizzazione delle alterazioni istopatologiche. Un ulteriore approfondimento riguarda la natura della proteina amiloide da noi visualizzata nel tessuto cerebrale del ratto. Studi futuri serviranno ad appurare se, in presenza di una disfunzione colinergica, l’iniezione di proteina amiloide esogena preaggregata possa rappresentare l’innesco per un processo di reclutamento di Aβ endogena. Infine, verranno investigate le eventuali modificazioni che il modello di doppia lesione porterebbe al metabolismo della proteina tau. Se, cioè, la presenza della deplezione colinergica e l’aumentata espressione di APP, e quindi di aggregati di proteina beta-amiloide, portino effettivamente a uno squilibrio nel balance tra proteina tau fisiologicamente fosforilata e proteina tau iperfosforilata, a favore di quest’ultima.XXIV Cicl

Repositioning Of Tak-475 In Mevalonate Kinase Disease: Translating Theory Into Practice

Mevalonate Kinase Deficiency (MKD, OMIM #610377) is a rare autosomal recessive metabolic and inflammatory disease. In MKD, defective function of the enzyme mevalonate kinase (MK), due to a mutation in the MVK gene, leads to the shortage of mevalonate-derived intermediates, which results in unbalanced prenylation of proteins and altered metabolism of sterols. These defects lead to a complex multisystem inflammatory and metabolic syndrome. Although biologic therapies aimed at blocking the inflammatory cytokine interleukin-1 (IL-1) can significantly reduce inflammation, they cannot completely control the clinical symptoms that affects the nervous system. For this reason, MKD can still be considered an orphan drug disease. Cellular models for MKD can be obtained by biochemical inhibition of mevalonate-derived isoprenoids. Of note, these cells present an exaggerated response to inflammatory stimuli that can be reduced by treatment with zaragozic acid, an inhibitor of squalene synthase (SQS) able to increase the availability of isoprenoids intermediates upstream the enzymatic block. A similar action might be obtained by lapaquistat acetate (TAK-475, Takeda), a drug that underwent extensive clinical trials as a cholesterol lowering agent 10 years ago, with a good safety profile. Here we describe the preclinical evidence supporting the possible repositioning of TAK-475 from its originally intended use to the treatment of MKD and discuss its potential to modulate the mevalonate pathway in inflammatory diseases

Coenzyme Q deficiency causes impairment of the sulfide oxidation pathway

Coenzyme Q (CoQ) is an electron acceptor for sulfide‐quinone reductase (SQR), the first enzyme of the hydrogen sulfide oxidation pathway. Here, we show that lack of CoQ in human skin fibroblasts causes impairment of hydrogen sulfide oxidation, proportional to the residual levels of CoQ. Biochemical and molecular abnormalities are rescued by CoQ supplementation in vitro and recapitulated by pharmacological inhibition of CoQ biosynthesis in skin fibroblasts and ADCK3 depletion in HeLa cells. Kidneys of Pdss2kd/kd mice, which only have ~15% residual CoQ concentrations and are clinically affected, showed (i) reduced protein levels of SQR and downstream enzymes, (ii) accumulation of hydrogen sulfides, and (iii) glutathione depletion. These abnormalities were not present in brain, which maintains ~30% residual CoQ and is clinically unaffected. In Pdss2kd/kd mice, we also observed low levels of plasma and urine thiosulfate and increased blood C4‐C6 acylcarnitines. We propose that impairment of the sulfide oxidation pathway induced by decreased levels of CoQ causes accumulation of sulfides and consequent inhibition of short‐chain acyl‐CoA dehydrogenase and glutathione depletion, which contributes to increased oxidative stress and kidney failure

A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans

Development of an enzyme-linked immunosorbent assay to detect antibodies to the SARS-CoV-2 spike protein in human sera and plasma. Here, we describe a serological enzyme-linked immunosorbent assay for the screening and identification of human SARS-CoV-2 seroconverters. This assay does not require the handling of infectious virus, can be adjusted to detect different antibody types in serum and plasma and is amenable to scaling. Serological assays are of critical importance to help define previous exposure to SARS-CoV-2 in populations, identify highly reactive human donors for convalescent plasma therapy and investigate correlates of protection.Peer reviewe

Activation of LXRβ inhibits tumor respiration and is synthetically lethal with Bcl-xL inhibition

Liver-X-receptor (LXR) agonists are known to bear anti-tumor activity. However, their efficacy is limited and additional insights regarding the underlying mechanism are necessary. By performing transcriptome analysis coupled with global polar metabolite screening, we show that LXR agonists, LXR623 and GW3965, enhance synergistically the anti-proliferative effect of BH3 mimetics in solid tumor malignancies, which is predominantly mediated by cell death with features of apoptosis and is rescued by exogenous cholesterol. Extracellular flux analysis and carbon tracing experiments (U-13C-glucose and U-13C-glutamine) reveal that within 5 h, activation of LXRβ results in reprogramming of tumor cell metabolism, leading to suppression of mitochondrial respiration, a phenomenon not observed in normal human astrocytes. LXR activation elicits a suppression of respiratory complexes at the protein level by reducing their stability. In turn, energy starvation drives an integrated stress response (ISR) that up-regulates pro-apoptotic Noxa in an ATF4-dependent manner. Cholesterol and nucleotides rescue from the ISR elicited by LXR agonists and from cell death induced by LXR agonists and BH3 mimetics. In conventional and patient-derived xenograft models of colon carcinoma, melanoma, and glioblastoma, the combination treatment of ABT263 and LXR agonists reduces tumor sizes significantly stronger than single treatments. Therefore, the combination treatment of LXR agonists and BH3 mimetics might be a viable efficacious treatment approach for solid malignancies

Long-Lasting Efficacy of Radio Electric Asymmetric Conveyer Neuromodulation Treatment on Functional Dysmetria, an Adaptive Motor Behavior

BackgroundFluctuating asymmetry (FA) is widely defined as the deviation from perfect bilateral symmetry and is considered an epigenetic measure of environmental stress. Rinaldi and Fontani hypothesized that the FA morpho-functional changes originate from an adaptive motor behavior determined by functional alterations in the cerebellum and neural circuits, not caused by a lesion, but induced by environmental stress. They called this phenomenon functional dysmetria (FD). On this premise, they developed the radio electric asymmetric conveyer (REAC) technology, a neuromodulation technology aimed at optimizing the best neuro-psycho-motor strategies in relation to environmental interaction.AimsPrevious studies showed that specific REAC neuro postural optimization (NPO) treatment can induce stable FD recovery. This study aimed to verify the duration of the NPO effect in inducing the stable FD recovery over timeMaterials and methodsData were retrospectively collected from a population of 29,794 subjects who underwent a specific semiological FD assessment and received the NPO treatment, regardless of the pathology referred.ResultsThe analysis of the data collected by the various participants in the study led us to ascertain the disappearance of FD in 100% of the cases treated, with a stability of the result detected up to 18 years after the single administration of the REAC NPO treatment.ConclusionsThe REAC NPO neurobiological modulation treatment consisting of a single administration surprisingly maintains a very long efficacy in the correction of FD. This effect can be explained as the long-lasting capacity of the NPO treatment to induce greater functional efficiency of the brain dynamics as proven in previous studies

Pediatric patients with inflammatory bowel disease exhibit increased serum levels of proinflammatory cytokines and chemokines, but decreased circulating levels of macrophage inhibitory protein-1β, interleukin-2 and interleukin-17

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic and progressive inflammatory condition of the gastrointestinal tract. Although the causative events that lead to the onset of IBD are yet to be fully elucidated, deregulation of immune and inflammatory mechanisms are hypothesized to significantly contribute to this disorder. Since the onset of IBD is often during infancy, in the present study, the serum values of a large panel of cytokines and chemokines in pediatric patients (<18 years; n=26) were compared with age-matched controls (n=37). While elevations in the serum level of several proinflammatory and immune regulating cytokines were confirmed, such as interleukin (IL)-1β, IL-5, IL-7, interferon (IFN)-γ-inducible protein-10, IL-16, cutaneous T-cell-attracting chemokine, leukemia inhibitory factor, monokine induced by γ-IFN, IFN-α2 and IFN-γ, notably decreased levels of IL-2, IL-17 and macrophage inhibitory protein-1β were also observed. Therefore, while a number of proinflammatory cytokines exhibit increased levels in IBD patients, pediatric IBD patients may also exhibit certain aspects of a reduced immunological response

Alendronate, a double-edged sword acting in the mevalonate pathway

Aminobisphosphonate aledronate is a compound commonly used clinically for the treatment of osteoporosis and other bone diseases, as a result of it preventing bone resorption. However, in previous years it has also been used to obtain cellular and animal models of a rare genetic disorder termed Mevalonate Kinase Deficiency (MKD). MKD is caused by mutations affecting the mevalonate kinase enzyme, in the cholesterol pathway and alendronate can be used to biochemically mimic the genetic defect as it inhibits farnesyl pyrophosphate synthase in the same pathway. Despite evidence in favor of the inhibition exerted on the mevalonate pathway, there is at least one clinical case of MKD in which alendronate improved not only skeletal and bone fractures, as expected, but also MKD clinical features. Based on this finding, the present study assessed the anti‑inflammatory properties of this aminobisphosphonate in&nbsp;vitro. No anti‑inflammatory effects of alendronate were observed in the in&nbsp;vitro experiments. Since MKD lacks specific treatments, these results may assist scientists and physicians in making the decision as to the most suitable choice of therapeutic compounds for this neglected disease

Mouse model of mevalonate kinase deficiency: comparison of cytokines and chemokines profile with human patients

BACKGROUND: Mevalonate kinase deficiency (MKD) is a rare genetic autoinflammatory disease caused by blocking of the enzyme mevalonate kinase in the pathway of cholesterol and isoprenoids. The pathogenic mechanism originating an immune response in MKD patients has not been clearly understood. METHODS: We investigated the dysregulation of expression of selected cytokines and chemokines in the serum of MKD patients. The results have been compared with those observed in an MKD mouse model obtained by treating the mice with aminobisphosphonate, a molecule that is able to inhibit the cholesterol pathway, mimicking the genetic block characteristic of the disease. RESULTS: Interleukin (IL)-1β, IL-5, IL-6, IL-9, IL-17, granulocyte colony-stimulating factor, monocyte chemotactic protein-1, tumor necrosis factor-α, and IL-4 expression were dysregulated in sera from MKD patients and mice. Moreover, geraniol, an exogenous isoprenoid, when administered to MKD mice, restored cytokines and chemokines levels with values similar to those of untreated mice. CONCLUSION: Our findings, which were obtained in patients and a mouse model mimicking the human disease, suggest that these cytokines and chemokines could be MKD specific and that isoprenoids could be considered as potential therapeutic molecules. The mouse model, even if with some limitations, was robust and suitable for routine testing of potential MKD drugs