NEJ2: Identifizierung und Charakterisierung eines neuen Proteins in Säugern und Saccharomyces cerevisiae, assoziiert mit Telomerstrukturen und der Nicht-Homologen Rekombination von DNA-Doppelstrangbrüchen

DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) sind die schwerwiegendsten Formen von DNA-Schäden. Unrepariert können sie zum Zelltod führen. Die Nicht-Homologe Rekombination (NHEJ) ist einer der beiden Hauptmechanismen zur Reparatur von DSB. Der DNA-Ligase IV/XRCC4-Komplex in Säugern bzw. der Dnl4/Lif1p-Komplex in Hefe ist für den zusammenführenden Schritt des NHEJ, aber auch für pathologisch bedingte Telomerfusionen verantwortlich. Diese Arbeit beschreibt die Identifikation und Charakterisierung des neuen humanen Proteins hNej2 und seines Hefeorthologs scNej2p, welches ursprünglich von unserer AG als Interaktionspartner von Lif1p identifiziert wurde. Im Kontrast zu anderen NHEJ-Faktoren, ist eine scnej2-Deletion letal, was auf weitere essentielle Funktionen des scNej2p in Hefen hindeutet. ScNej2p interferiert mit der Formation des Dnl4/Lif1p-Komplexes und Überexpression von scNej2p reduziert die NHEJ-Effizienz in Hefen. Wir konnten zeigen, dass NEJ2 in Eukaryonten konserviert vorliegt, es in humanen Zellen ubiquitär exprimiert wird und dass die Interaktion zwischen Nej2 mit dem humanen XRCC4 konserviert ist. Die Überexpression von hNej2 in humanen Zellen ist letal. Durch eine transiente Expression konnte ein punktförmiges Muster im Nukleus von humanen und Hefe-Zellen gezeigt werden, welches in beiden Organismen an das Muster von Telomer- assoziierten Proteinen erinnert. Wir konnten hNej2 durch Colokalisierungen mit Telomer- assoziierten Proteinen, wie TRF2 (Telomer Repeat Faktor) und Mre11 in humanen Fibroblasten und der Interaktion mit PinX1, einem Telomeraseinhibitor, mit Telomerstrukturen assoziieren. Durch die Colokalisierung von hNej2 und PML-Körperchen, welche eine Reihe von DNA-Reparaturfaktoren beherbergen und mit der DNA-Schadensantwort, der alternativen Verlängerung der Telomere und der zellulären Alterung in Zusammenhang gebracht werden, konnte Nej2 in die DSB-Reparatur eingeordnet werden. Zusammengefasst gibt es Evidenzen dafür, dass NEJ2 ein neuer NHEJ- und Telomer- assoziierter Faktor ist, welcher möglicherweise als Verbindungsstelle zwischen DSB-Reparatur und dem Telomermetabolismus agiert. Weitere Studien sind nötig, um zu prüfen, ob NEJ2 der Faktor ist, der unter normalen Bedingungen NHEJ- vermittelte Telomerfusionen von freien Telomeren verhindert

Conserved interactions of the splicing factor Ntr1/Spp382 with proteins involved in DNA double-strand break repair and telomere metabolism

The ligation of DNA double-strand breaks in the process of non-homologous end-joining (NHEJ) is accomplished by a heterodimeric enzyme complex consisting of DNA ligase IV and an associated non-catalytic factor. This DNA ligase also accounts for the fatal joining of unprotected telomere ends. Hence, its activity must be tightly controlled. Here, we describe interactions of the DNA ligase IV-associated proteins Lif1p and XRCC4 of yeast and human with the putatively orthologous G-patch proteins Ntr1p/Spp382p and NTR1/TFIP11 that have recently been implicated in mRNA splicing. These conserved interactions occupy the DNA ligase IV-binding sites of Lif1p and XRCC4, thus preventing the formation of an active enzyme complex. Consistently, an excess of Ntr1p in yeast reduces NHEJ efficiency in a plasmid ligation assay as well as in a chromosomal double-strand break repair (DSBR) assay. Both yeast and human NTR1 also interact with PinX1, another G-patch protein that has dual functions in the regulation of telomerase activity and telomere stability, and in RNA processing. Like PinX1, NTR1 localizes to telomeres and associates with nucleoli in yeast and human cells, suggesting a function in localized control of DSBR

Ntr1p overabundance affects NHEJ of linearized plasmid DNA transformed into yeast, or of chromosomal DNA double-strand breaks in different genetic backgrounds

<p><b>Copyright information:</b></p><p>Taken from "Conserved interactions of the splicing factor Ntr1/Spp382 with proteins involved in DNA double-strand break repair and telomere metabolism"</p><p></p><p>Nucleic Acids Research 2007;35(7):2321-2332.</p><p>Published online 27 Mar 2007</p><p>PMCID:PMC1874655.</p><p>© 2007 The Author(s)</p> () Wild-type (wt) or NHEJ-deficient Δ yeast strains constitutively producing full-length EGFP-tagged-Ntr1p from plasmid pUG36 (vector control) were transformed with equal amounts of digested or undigested plasmid pBTM116, which is a substrate for NHEJ (). Results are presented as relative transformation efficiencies (ratios of cut:uncut plasmid). EcoRI cut indicates 5′-overhangs, PstI cut indicates 3′-overhangs. Error bars represent one standard deviation, statistical significance (-values) by a two-tailed students -test is indicated. () Wild-type (wt), HR-deficient Δ, or NHEJ-deficient Δ strains constitutively producing full-length Ntr1p from plasmid pAS2–1. Chromosomal breaks were induced by additional expression of EcoRI or HO (GAL1-inducible) upon transformation of the respective expression vectors (). Results are presented as percentage of survival of cells carrying an NTR1-expressing vector or the respective control vector (pAS2-1) when grown on galactose containing medium. Error bars represent one standard deviation, -values of a two-tailed students -test are indicated

Yeast and human NTR1 co-localize with nucleolus- and telomere-associated proteins

<p><b>Copyright information:</b></p><p>Taken from "Conserved interactions of the splicing factor Ntr1/Spp382 with proteins involved in DNA double-strand break repair and telomere metabolism"</p><p></p><p>Nucleic Acids Research 2007;35(7):2321-2332.</p><p>Published online 27 Mar 2007</p><p>PMCID:PMC1874655.</p><p>© 2007 The Author(s)</p> () Intracellular localization of Ntr1p and co-localization with other proteins. Upper panel: EGFP-Ntr1p (green) localizes to the nucleus (DAPI, light blue) and forms foci. Middle panel: live cell images of CFP-Nop1p (red, false color) and EGFP-Ntr1p (green). Co-localizing signals are shown in yellow in the merge panel. Lower panel: confocal images of EGFP-Ntr1p (green) in fixed cells immunostained for Rap1p (red). DAPI staining of DNA is shown in blue. Co-localization between the two proteins is shown in yellow on the merge panel. () Intracellular localization of human NTR1 and TRF1. WI26 VA4 cells were co-transfected with expression constructs of ECFP-NTR1 (amino acids 289–580) and RFP-TRF1 (upper three panels). eCFP was used as a control (lower panel). Co-localization in confocal images is shown in yellow on the merge panel and telomeric co-localization is indicated by arrows