Oriented immobilization of peptide-N-glycosidase F on a monolithic support for glycosylation analysis

In this paper, we report on a novel oriented peptide-N-glycosidase F (PNGase F) immobilization approach onto methacrylate based monolithic support for rapid, reproducible and efficient release of the N-linked carbohydrate moieties from glycoproteins. The glutathione-S-transferase-fusion PNGase F (PNGase F-GST) was expressed in Escherichia coli using regular vector technology. The monolithic pore surface was functionalized with glutathione via a succinimidyl-6-(iodoacetyl-amino)-hexanoate linker and the specific affinity of GST toward glutathione was utilized for the oriented coupling. This novel immobilization procedure was compared with reductive amination technique commonly used for non-oriented enzyme immobilization via primary amine functionalities. Both coupling approaches were compared using enzymatic treatment of several glycoproteins, such as ribonuclease B, fetuin and immunoglobulin G followed by MALDI/MS and CE-LIF analysis of the released glycans. Orientedly immobilized PNGase F via GST-glutathione coupling showed significantly higher activity, remained stable for several months, and allowed rapid release of various types of glycans (high-mannose, core fucosylated, sialylated, etc.) from glycoproteins. Complete protein deglycosylation was obtained as fast as in several seconds when using flow-through immobilized microreactors

Kis vízfolyások és vízgyűjtőterületeik komplex vizsgálata az EU Vízügyi Keretirányelv tükrében = Komplex measurements of streams and their watershades in relation of EU Water Framework Directive

A Rákos, Morgó és Apátkúti patakoknál közösen (vízgazdálkodás, meteorológia, halfaunisztika és botanika szakemberei) és folyamatosan végeztünk vizsgálatokat. A terepi mintavételek kémiai eredményeire- mivel ez az összes szakterületnek fontos volt, felépítettünk egy saját adatbázist. A Morgó (Török) patakon elkészítettük az élőhely halak számára kedvezőbbé tételét célzó tervet, két alternatívával. A kutatás végére kialakult halfaunisztikai felméréseink segítettek a kedvezőbb változat kiválasztásában. Gödöllő Alsó-parki bukónál (Rákos patak) 4 évi folyamatos, heti 2 alkalommal mért vízállás adatsor áll rendelkezésre további elemzések céljából. A Morgó (Török patak) vízgyűjtőjén térinformatikával támogatott példát mutatunk be a lefolyási tényező megállapításának módszerére. Az EU VKI által 1. jelűnek nevezett egyik referenciaterületen (Morgó (Török patak) felső szakasza) sikerült élőhelyi összefüggések vizsgálatát elmélyíteni a különböző szakterületek között, csakúgy, mint a Sopron Hidegvízvölgyben lévő Rák pataknál, időközben nemzetközivé szélesítve a kutatást (cseh együttműködés). Elkészült egy írott anyag, melynek címe "Kis vízfolyások és vízgyűjtőterületeik problémája az EU VKI tükrében, Útmutató a vízgyűjtőfeltáráshoz". Az anyag első része egy segédlet a kutatás ill. tervezés részére, a második része kérdés-válasz formában, esettanulmányokkal alátámasztva elemzi a felmerült legfontosabb kérdéseket. Egyelőre nem publikus, kiadását tervezzük. | Parallel Water management, meteorological, fish faunistic and botanical surveys and assessment has been carried out on Rákos, Morgó and Apátkúti streams. Database was developed for storing our chemical monitoring results, which considered as very important parameters for each members of our consortium. Two versions of habitat restoration plans on the preference of fish fauna were designed. As the outcome of the fish monitoring the priority list could be set up and the best version could be selected. During the planning period the involvement of the stakeholders was successful. We were working with water level time serious measured at a dike in Gödöllő (Alsó-park). The gauging station has been operated manually for 4 years, taking data twice per week. At the territory delineated as the reference site for 1st type in B-system of WFD (at the upstream section of Morgó (also called Török) stream) interdisciplinary discussions could be formed as well as on Rák stream in Hidegvízvölgy in Sopron region. Meanwhile international involvement with onside and offsite discussions have been introduced through a Czech-Hungarian Science and Technology Project with fish experts from Charles University in Prague (Cz-14/2005). As a product "The proplematic tasks of small streams and their catchments in the light of the Water Framework Directive - Guidline for catchement assessment" - a "manual" is worked out

Apoptótikus sejtek fagocitózisát szabályozó folyamatok molekuláris mechanizmusa = Molecular mechanism in the regulation of the phagocytosis in apoptotic cells

A szervezetben naponta elhaló sok milliárd sejt hatékony eltávolítása a feltétele annak, hogy ne alakuljanak ki kóros gyulladásos és autoimmun kórképek. Kísérleteink segítségével számos eddig ismeretlen elemét tártuk fel az eltakarító rendszernek. Megállapítottuk, hogy a folyamat szabályozásában lényeges szerepet játszik a fehérjéket keresztkötő transzglutamináz enzim, annak hiányában autoimmun reakció jelenik meg. A transzglutamináz, amelynek új szubsztrátjait ismertük meg és aktivitásának mérésére igen érzékeny módszert dolgoztunk ki, szükséges a sejtek elhalását megelőző sejtéréshez is. Az idegrendszerben az eltakarító mechanizmusok zavara eredményeink szerint transzglutamináz által keresztkötött fehérje zárványok felszaporodáshoz vezet; meghatároztuk hogy milyen fehérjék mely oldalláncai vannak ilyenkor keresztkötve. Az általunk kifejlesztett apopto-fagocita Tachman Low Density Array segítségével párhuzamosan mérni lehet hogy az eltakarító folyamatban szerepet játszó gének kifejeződése hogyan van szabályozva; eredményeink azt mutatják, hogy az elhalt sejteket bekebelező fagociták különbséget tesznek a különböző módon elhalt sejtek között. | The effective removal of the many billions of cells dying in our body every day is necessary to prevent the development of inflammatory and autoimmune diseases. In our experiments several so far unknown elements of this clearance mechanism have been revealed. It has been determined that the protein crosslinking transglutaminase plays an important role in the regulation of this process and the lack of this enzyme leads to autoimmune reactions. The transglutaminase, of which we have found several novel substrates and developed a new activity assay, also plays an important role in the differentiation of cells preceeding their death. The dysregulation of the clearance mechanisms in the central nervous system leads to the accummulation of transglutaminase cross-linked protein aggregates; we have determined which proteins at which residue are crosslinked in these structures. A novel Tachman Low Density Array has been developed for the parallel measurement and study of the regulation of the expression level of those genes which play an important role in the clearance of apoptotic cells; our results show that the engulfing cells can differentiate among dying cells according to the way how their death occured

PH wave-front propagation in the urea-urease reaction

The urease-catalyzed hydrolysis of urea displays feedback that results in a switch from acid (pH ∼3) to base (pH ∼9) after a controllable period of time (from 10 to \u3e5000 s). Here we show that the spatially distributed reaction can support pH wave fronts propagating with a speed of the order of 0.1-1 mm min-1. The experimental results were reproduced qualitatively in reaction-diffusion simulations including a Michaelis-Menten expression for the urease reaction with a bell-shaped rate-pH dependence. However, this model fails to predict that at lower enzyme concentrations, the unstirred reaction does not always support fronts when the well-stirred reaction still rapidly switches to high pH. © 2012 by the Biophysical Society

Vertical distribution of zooplankton in a shallow peatland pond: the limiting role of dissolved oxygen

We investigated the diel vertical distribution patterns of microcrustacean zooplankton (Cladocera, Copepoda) in a shallow pond (max. depth: 70 cm) of the Öreg-turján peatland (Ócsa, Central Hungary) during three 24-h periods in July (19–20th), August (17–18th) and September (11–12th) 2011. Environmental variables showed remarkable vertical stratification. Oxygen concentration was close to zero in the entire water column from night until sunrise, while the lower strata (from 20 cm below the surface) were close to anoxic during all three diel cycles. It proved to be the main determinant of the vertical distribution of microcrustaceans. Accordingly, the highest proportion of individuals was present in the surface layer. Chlorophyll-a concentration and phytoplankton biomass were inversely distributed compared to zooplankton. Microcrustaceans (mainly Daphnia curvirostris) migrated to the middle layer only in August, which could be explained by a trade-off between food resources, dissolved oxygen (DO) and competition with littoral zooplankters. The diurnal density patterns of microcrustaceans suggested horizontal migration into the aquatic macrophytes during night, which could be a strategy to avoid Chaoborus predation. Our results show that strong vertical gradients of abiotic and biotic factors occur even in such shallow waterbodies. Among them, DO can maintain constant vertical aggregation of zooplankters by limiting their occurrence to the surface layers

A harmadik szinapszis. Molekuláris kölcsönhatások az elhaló sejtek és az azokat eltávolító makrofágok, dendritikus sejtek között. = The third synapsis. Molecular interactions between dying cells and macrophages or dendritic cells.

A tudományos iskola keretében új interdiszciplináris kutatási terület megteremtésére került sor az apoptótikus sejtek és az azokat eltávolító sejtek közötti harmadi szinapszis tanulmányozására. Megállapítottuk, hogy a transzglutamináz 2 (TG2) enzim szerepet játszik az apoptotikus sejtek eltávolításában, az enzim hiányában autoimmun kórkép alakúl ki. A TG2 bejuthat a sejmagba, sejtbiokémiai hatása összefügg génkifejeződés befolyásolásával. Alzheimer kórban a TG2 résztvesz kovalensen összekötött fehérje aggregátumok létrehozásában. A TG2 védőhatást fejt ki a sejtelhalással szemben májsejtekben és szívizomsejtekben G fehérje, ill. protein diszulfid izomeráz aktivitásával. A PPAR? szerepet játszik az apoptótikus sejteket eltávolító fagocitáló képesség kialakításában fokozva fagocitózis gének kifejeződését. A PPAR?, a retinoid receptor és az LXR receptor szignál utak összekapcsolódnak a makrofágok koleszterol szintjének szabályozásában. A PPAR? aktiváció hatására a dendritikus sejekből fokozott fagocitózisra, hatékony lipid prezentációra és iNKT aktivitásra képes alpopuláció alakul. Apopto-fagocita Taqman Low Density Array-t fejleszttünkl 94 gén mennyiségi kifejeződése vizsgálatára. Az autofágiával elhaló sejtek eltávolítása szintén fagocitózissal történik, specifikus gének indukálódnak. A dendritikus sejtek kölcsönhatása apoptótikus vagy nekrotikus sejtekkel alkalmas az immunválasz finom szabályozására. | In the supported Research School a new interdisciplinary research area has been developed to study the third synapse formed between apoptotic cells and those which engolfe them. It has been established that the transglutaminase 2 (TG2) enzyme plays an important role in the clearance of apoptotic cells, the lack of this enzyme leads to autoimmune disease. TG2 can enter the nucleus and its cell biochemical effects are related to modulation of gene expression and modification of the cytoskeleton. In Alzheimer's disease TG2 participates in the formation of covalently cross-linked protein aggregates. TG2 can protect hepatocytes and cardiomyocytes against apoptosis through its G protein and protein disulphide isomerase activities. PPARγ contributes to the development of phagocytic capacity of macrophages by inducing specific phagocytic genes. The PPARγ, rretinoid and LXR receptor signal pathways are interlinked in regulating cholesterol content of cells. Activation of PPARγ in dendritic cells leads to the development of a subpopulation with increased phagocytic capacity, effective lipid presentation and iNKT activity. An apopto-phagocytic Taqman Low Density array has been developed for quantitative measuring of 94 genes in parallel. Cells dying by autophagy are removed by the same mechanism as apoptotic cells while specific phagocytic genes are induced. Dendritic cells interacting with apoptotic cells can fine tune the immune system

Rapid interactome profiling by massive sequencing

We have developed a high-throughput protein expression and interaction analysis platform that combines cDNA phage display library selection and massive gene sequencing using the 454 platform. A phage display library of open reading frame (ORF) fragments was created from mRNA derived from different tissues. This was used to study the interaction network of the enzyme transglutaminase 2 (TG2), a multifunctional enzyme involved in the regulation of cell growth, differentiation and apoptosis, associated with many different pathologies. After two rounds of panning with TG2 we assayed the frequency of ORFs within the selected phage population using 454 sequencing. Ranking and analysis of more than 120 000 sequences allowed us to identify several potential interactors, which were subsequently confirmed in functional assays. Within the identified clones, three had been previously described as interacting proteins (fibronectin, SMOC1 and GSTO2), while all the others were new. When compared with standard systems, such as microtiter enzyme-linked immunosorbant assay, the method described here is dramatically faster and yields far more information about the interaction under study, allowing better characterization of complex systems. For example, in the case of fibronectin, it was possible to identify the specific domains involved in the interaction