Deciphering the Theobroma cacao self-incompatibility system: from genomics to diagnostic markers for self-compatibility

Cocoa self-compatibility is an important yield factor and has been described as being controlled by a late gameto-sporophytic system expressed only at the level of the embryo sac. It results in gametic non-fusion and involves several loci. In this work, we identified two loci, located on chromosomes 1 and 4 (CH1 and CH4), involved in cocoa self-incompatibility by two different processes. Both loci are responsible for gametic selection, but only one (the CH4 locus) is involved in the main fruit drop. The CH1 locus acts prior to the gamete fusion step and independently of the CH4 locus. Using fine-mapping and genome-wide association studies, we focused analyses on restricted regions and identified candidate genes. Some of them showed a differential expression between incompatible and compatible reactions. Immunolocalization experiments provided evidence of CH1 candidate genes expressed in ovule and style tissues. Highly polymorphic simple sequence repeat (SSR) diagnostic markers were designed in the CH4 region that had been identified by fine-mapping. They are characterized by a strong linkage disequilibrium with incompatibility alleles, thus allowing the development of efficient diagnostic markers predicting self-compatibility and fruit setting according to the presence of specific alleles or genotypes. SSR alleles specific to self-compatible Amelonado and Criollo varieties were also identified, thus allowing screening for self-compatible plants in cocoa populations. (Résumé d'auteur

Contribution à l’étude des déterminants génétiques et biochimiques des arômes des cacaos fins d’Equateur : Le Nacional, de la diversité aromatique de sa population d’origine jusqu’à sa domestication récente

Theobroma cacao is a tree native to the Latin America humid tropical regions. It is cultivated for its beans, which are used to produce chocolate. The Nacional variety, native to Ecuador, is a fine cocoa variety known for its floral and spicy aromas, called "Arriba" flavour. The genetic and biochemical determinants of the development of its flavours remain poorly understood. The work of this thesis focused on the study of the genetic and biochemical determinants of the aromas of Ecuadorian fine cocoa in order to contribute to the knowledge in this area.The first part of the study was carried out using a population of modern Nacional cocoa trees, which is the variety of Nacional currently grown in Ecuador. Association studies were carried out on the whole genome and focused on the analysis of volatile compounds related to floral and fruity aromas (fresh and dried fruits) contained in the beans before and after roasting, as well as on the results of sensory analyses of liquors. This first study showed that the floral aromas of Nacional were mainly synthesized through two biosynthetic pathways: the monoterpene biosynthetic and the L-phenylalanine degradation pathways. The results related to fruity flavours highlighted five major metabolic pathways: the monoterpene biosynthetic pathway, the degradation of L-phenylalanine, sugars, fatty acids and proteins pathways. Candidate genes encoding enzymes involved in these metabolic pathways were identified in the corresponding association areas.The modern Nacional variety is the result of several generations of crosses between Trinitarios (hybrids between Amelonado and Criollo) and the ancestral Nacional, so, involving three contracted ancestors. The effect of this recent domestication stage on the aromas of the modern Nacional variety was studied. Using genotyping data from the 3 reference ancestors and GWAS results for all quality traits (volatile and non-volatile compounds, sensory analysis); it was possible to determine the origin of the alleles with a positive effect on aroma in the different association areas. This study showed that all founders contributed alleles favourable to the synthesis of quality aromas (floral, fruity ...) but also to the synthesis of defects (bitterness, astringency…). We were able to show that the association zones linked to favourable aromas and those linked to defects were not genetically linked. It is therefore possible to select the areas of interest for the flavours while counter-selecting the areas that bring defects.The second part of this study focused on the analysis of the flavours of a population of cocoa trees native to Amazonia, and to the area of origin of the Nacional ancestral variety. In this study, GWAS analyses were also performed on all the quality traits analysed previously. Ninety seven candidate genes, are common to both populations analysed. New volatile compounds and new association zones were also detected, showing the greater diversity and aromatic richness of these new genetic resources and their interest in the creation of new aromatic varieties adapted to the Amazon.Finally, a GWAS study on non-volatile compounds, sensory traits linked to bitterness and astringency, as well as fat and protein contents, was also carried out on the two populations. Candidate genes linked to the caffeine biosynthetic pathway and that of polyphenols, or linked to the fatty acid biosynthesis pathway have been observed in the association areas.Theobroma cacao est un arbre originaire des régions tropicales humides d’Amérique latine. Il est cultivé pour ses fèves qui permettent la production de chocolat. Le Nacional, originaire d’Equateur, est une variété de cacao fin connue pour ses arômes floraux et épicées, appelée saveur « Arriba ». Les mécanismes de la synthèse de ses arômes restent peu connus. Les travaux de cette thèse ont porté sur l’étude des déterminants génétiques et biochimiques des arômes des cacaos fins équatoriens afin d’initier de contribuer aux connaissances dans ce domaine.Une première partie de l’étude a été réalisée à partir d’une population de cacaoyer de type Nacional moderne, qui est la variété de Nacional actuellement cultivée. Des études d’associations ont été réalisées sur l’ensemble du génome (GWAS) et ont porté sur l’analyse des composés volatils relatifs aux arôme floraux et fruités (fruits frais et fruits secs) contenus dans les fèves, avant et après torréfaction, ainsi que, sur des résultats d’analyses sensorielles de liqueurs. Cette première étude a pu montrer que les arômes floraux du Nacional étaient principalement synthétisés grâce à deux voies de biosynthèse: celle des monoterpènes et la voie de dégradation du L-phénylalanine. Les résultats relatifs aux arômes fruités ont permis de mettre en lumière cinq voies métaboliques majeures: la voie de biosynthèse des monoterpènes, les voies de dégradations du L-phénylalanine, des sucres, des acides gras et des protéines. Des gènes candidats codant pour des enzymes impliqués dans ces voies métaboliques ont été identifiés dans les zones d’associations correspondantes.La variété Nacional moderne est issue de diverses générations de croisements entre des Trinitario (hybrides Amelonado/Criollo) et le Nacional ancestral, mettant ainsi en jeu 3 ancêtres contrastés. L’effet de cette étape de domestication récente sur les arômes de la variété Nacional moderne a été étudié. Grâce aux données de génotypage des trois ancêtres de référence et aux résultats des GWAS portant sur l’ensemble des caractères de qualité (composés volatils et non-volatils, analyses sensorielles), il a été possible de déterminer l’origine des allèles ayant un effet positif sur les arômes dans les différentes zones d’associations. Cette étude a montré que l’ensemble des ancêtres fondateurs ont apporté des allèles favorables à la synthèse d’arômes de qualité (floraux, fruités, …) mais aussi à la synthèse de défauts (amertume, astringence, …). Nous avons pu montrer que les zones d’associations en lien avec les arômes de qualité et celles avec les défauts n’étaient pas liées génétiquement. Il est donc possible de sélectionner les zones d’intérêts pour les arômes tout en contre-sélectionnant les zones apportant des défauts.La deuxième partie de cette étude a porté sur l’analyse des arômes d’une population de cacaoyers natifs d’Amazonie et issus de la zone d’origine de la variété Nacional ancestral. Dans cette étude, des analyses GWAS ont également été effectuées sur l’ensemble des caractères de qualité analysés précédemment. Quatre vingt dix sept gènes candidats sont communs aux deux populations analysées. De nouveaux composés volatils ainsi que de nouvelles zones d’associations ont également été détectées montrant ainsi une plus grande diversité et richesse aromatique de ces nouvelles ressources génétiques et leur intérêt pour la création de nouvelles variétés aromatiques adaptées à l’Amazonie.Enfin, une étude GWAS sur les composés non-volatils, les caractères sensoriels liés à l’amertume et à l’astringence, ainsi que la teneur en matière grasse et en protéines, a également été réalisée sur les deux populations. Des gènes candidats en lien avec la voie de biosynthèse de la caféine et celle des polyphénols, ou en lien avec la voie de biosynthèse des acides gras ont pu être observés dans les zones d’associations

Contribution to the study of the genetic and biochemical determinants of Ecuadorian fine cocoa : Nacional, from the aromatic diversity of its original population to its recent domestication

Theobroma cacao est un arbre originaire des régions tropicales humides d’Amérique latine. Il est cultivé pour ses fèves qui permettent la production de chocolat. Le Nacional, originaire d’Equateur, est une variété de cacao fin connue pour ses arômes floraux et épicées, appelée saveur « Arriba ». Les mécanismes de la synthèse de ses arômes restent peu connus. Les travaux de cette thèse ont porté sur l’étude des déterminants génétiques et biochimiques des arômes des cacaos fins équatoriens afin d’initier de contribuer aux connaissances dans ce domaine.Une première partie de l’étude a été réalisée à partir d’une population de cacaoyer de type Nacional moderne, qui est la variété de Nacional actuellement cultivée. Des études d’associations ont été réalisées sur l’ensemble du génome (GWAS) et ont porté sur l’analyse des composés volatils relatifs aux arôme floraux et fruités (fruits frais et fruits secs) contenus dans les fèves, avant et après torréfaction, ainsi que, sur des résultats d’analyses sensorielles de liqueurs. Cette première étude a pu montrer que les arômes floraux du Nacional étaient principalement synthétisés grâce à deux voies de biosynthèse: celle des monoterpènes et la voie de dégradation du L-phénylalanine. Les résultats relatifs aux arômes fruités ont permis de mettre en lumière cinq voies métaboliques majeures: la voie de biosynthèse des monoterpènes, les voies de dégradations du L-phénylalanine, des sucres, des acides gras et des protéines. Des gènes candidats codant pour des enzymes impliqués dans ces voies métaboliques ont été identifiés dans les zones d’associations correspondantes.La variété Nacional moderne est issue de diverses générations de croisements entre des Trinitario (hybrides Amelonado/Criollo) et le Nacional ancestral, mettant ainsi en jeu 3 ancêtres contrastés. L’effet de cette étape de domestication récente sur les arômes de la variété Nacional moderne a été étudié. Grâce aux données de génotypage des trois ancêtres de référence et aux résultats des GWAS portant sur l’ensemble des caractères de qualité (composés volatils et non-volatils, analyses sensorielles), il a été possible de déterminer l’origine des allèles ayant un effet positif sur les arômes dans les différentes zones d’associations. Cette étude a montré que l’ensemble des ancêtres fondateurs ont apporté des allèles favorables à la synthèse d’arômes de qualité (floraux, fruités, …) mais aussi à la synthèse de défauts (amertume, astringence, …). Nous avons pu montrer que les zones d’associations en lien avec les arômes de qualité et celles avec les défauts n’étaient pas liées génétiquement. Il est donc possible de sélectionner les zones d’intérêts pour les arômes tout en contre-sélectionnant les zones apportant des défauts.La deuxième partie de cette étude a porté sur l’analyse des arômes d’une population de cacaoyers natifs d’Amazonie et issus de la zone d’origine de la variété Nacional ancestral. Dans cette étude, des analyses GWAS ont également été effectuées sur l’ensemble des caractères de qualité analysés précédemment. Quatre vingt dix sept gènes candidats sont communs aux deux populations analysées. De nouveaux composés volatils ainsi que de nouvelles zones d’associations ont également été détectées montrant ainsi une plus grande diversité et richesse aromatique de ces nouvelles ressources génétiques et leur intérêt pour la création de nouvelles variétés aromatiques adaptées à l’Amazonie.Enfin, une étude GWAS sur les composés non-volatils, les caractères sensoriels liés à l’amertume et à l’astringence, ainsi que la teneur en matière grasse et en protéines, a également été réalisée sur les deux populations. Des gènes candidats en lien avec la voie de biosynthèse de la caféine et celle des polyphénols, ou en lien avec la voie de biosynthèse des acides gras ont pu être observés dans les zones d’associations.Theobroma cacao is a tree native to the Latin America humid tropical regions. It is cultivated for its beans, which are used to produce chocolate. The Nacional variety, native to Ecuador, is a fine cocoa variety known for its floral and spicy aromas, called "Arriba" flavour. The genetic and biochemical determinants of the development of its flavours remain poorly understood. The work of this thesis focused on the study of the genetic and biochemical determinants of the aromas of Ecuadorian fine cocoa in order to contribute to the knowledge in this area.The first part of the study was carried out using a population of modern Nacional cocoa trees, which is the variety of Nacional currently grown in Ecuador. Association studies were carried out on the whole genome and focused on the analysis of volatile compounds related to floral and fruity aromas (fresh and dried fruits) contained in the beans before and after roasting, as well as on the results of sensory analyses of liquors. This first study showed that the floral aromas of Nacional were mainly synthesized through two biosynthetic pathways: the monoterpene biosynthetic and the L-phenylalanine degradation pathways. The results related to fruity flavours highlighted five major metabolic pathways: the monoterpene biosynthetic pathway, the degradation of L-phenylalanine, sugars, fatty acids and proteins pathways. Candidate genes encoding enzymes involved in these metabolic pathways were identified in the corresponding association areas.The modern Nacional variety is the result of several generations of crosses between Trinitarios (hybrids between Amelonado and Criollo) and the ancestral Nacional, so, involving three contracted ancestors. The effect of this recent domestication stage on the aromas of the modern Nacional variety was studied. Using genotyping data from the 3 reference ancestors and GWAS results for all quality traits (volatile and non-volatile compounds, sensory analysis); it was possible to determine the origin of the alleles with a positive effect on aroma in the different association areas. This study showed that all founders contributed alleles favourable to the synthesis of quality aromas (floral, fruity ...) but also to the synthesis of defects (bitterness, astringency…). We were able to show that the association zones linked to favourable aromas and those linked to defects were not genetically linked. It is therefore possible to select the areas of interest for the flavours while counter-selecting the areas that bring defects.The second part of this study focused on the analysis of the flavours of a population of cocoa trees native to Amazonia, and to the area of origin of the Nacional ancestral variety. In this study, GWAS analyses were also performed on all the quality traits analysed previously. Ninety seven candidate genes, are common to both populations analysed. New volatile compounds and new association zones were also detected, showing the greater diversity and aromatic richness of these new genetic resources and their interest in the creation of new aromatic varieties adapted to the Amazon.Finally, a GWAS study on non-volatile compounds, sensory traits linked to bitterness and astringency, as well as fat and protein contents, was also carried out on the two populations. Candidate genes linked to the caffeine biosynthetic pathway and that of polyphenols, or linked to the fatty acid biosynthesis pathway have been observed in the association areas

Contribution à l’étude des déterminants génétiques et biochimiques des arômes des cacaos fins d’Equateur : Le Nacional, de la diversité aromatique de sa population d’origine jusqu’à sa domestication récente

Theobroma cacao is a tree native to the Latin America humid tropical regions. It is cultivated for its beans, which are used to produce chocolate. The Nacional variety, native to Ecuador, is a fine cocoa variety known for its floral and spicy aromas, called "Arriba" flavour. The genetic and biochemical determinants of the development of its flavours remain poorly understood. The work of this thesis focused on the study of the genetic and biochemical determinants of the aromas of Ecuadorian fine cocoa in order to contribute to the knowledge in this area.The first part of the study was carried out using a population of modern Nacional cocoa trees, which is the variety of Nacional currently grown in Ecuador. Association studies were carried out on the whole genome and focused on the analysis of volatile compounds related to floral and fruity aromas (fresh and dried fruits) contained in the beans before and after roasting, as well as on the results of sensory analyses of liquors. This first study showed that the floral aromas of Nacional were mainly synthesized through two biosynthetic pathways: the monoterpene biosynthetic and the L-phenylalanine degradation pathways. The results related to fruity flavours highlighted five major metabolic pathways: the monoterpene biosynthetic pathway, the degradation of L-phenylalanine, sugars, fatty acids and proteins pathways. Candidate genes encoding enzymes involved in these metabolic pathways were identified in the corresponding association areas.The modern Nacional variety is the result of several generations of crosses between Trinitarios (hybrids between Amelonado and Criollo) and the ancestral Nacional, so, involving three contracted ancestors. The effect of this recent domestication stage on the aromas of the modern Nacional variety was studied. Using genotyping data from the 3 reference ancestors and GWAS results for all quality traits (volatile and non-volatile compounds, sensory analysis); it was possible to determine the origin of the alleles with a positive effect on aroma in the different association areas. This study showed that all founders contributed alleles favourable to the synthesis of quality aromas (floral, fruity ...) but also to the synthesis of defects (bitterness, astringency…). We were able to show that the association zones linked to favourable aromas and those linked to defects were not genetically linked. It is therefore possible to select the areas of interest for the flavours while counter-selecting the areas that bring defects.The second part of this study focused on the analysis of the flavours of a population of cocoa trees native to Amazonia, and to the area of origin of the Nacional ancestral variety. In this study, GWAS analyses were also performed on all the quality traits analysed previously. Ninety seven candidate genes, are common to both populations analysed. New volatile compounds and new association zones were also detected, showing the greater diversity and aromatic richness of these new genetic resources and their interest in the creation of new aromatic varieties adapted to the Amazon.Finally, a GWAS study on non-volatile compounds, sensory traits linked to bitterness and astringency, as well as fat and protein contents, was also carried out on the two populations. Candidate genes linked to the caffeine biosynthetic pathway and that of polyphenols, or linked to the fatty acid biosynthesis pathway have been observed in the association areas.Theobroma cacao est un arbre originaire des régions tropicales humides d’Amérique latine. Il est cultivé pour ses fèves qui permettent la production de chocolat. Le Nacional, originaire d’Equateur, est une variété de cacao fin connue pour ses arômes floraux et épicées, appelée saveur « Arriba ». Les mécanismes de la synthèse de ses arômes restent peu connus. Les travaux de cette thèse ont porté sur l’étude des déterminants génétiques et biochimiques des arômes des cacaos fins équatoriens afin d’initier de contribuer aux connaissances dans ce domaine.Une première partie de l’étude a été réalisée à partir d’une population de cacaoyer de type Nacional moderne, qui est la variété de Nacional actuellement cultivée. Des études d’associations ont été réalisées sur l’ensemble du génome (GWAS) et ont porté sur l’analyse des composés volatils relatifs aux arôme floraux et fruités (fruits frais et fruits secs) contenus dans les fèves, avant et après torréfaction, ainsi que, sur des résultats d’analyses sensorielles de liqueurs. Cette première étude a pu montrer que les arômes floraux du Nacional étaient principalement synthétisés grâce à deux voies de biosynthèse: celle des monoterpènes et la voie de dégradation du L-phénylalanine. Les résultats relatifs aux arômes fruités ont permis de mettre en lumière cinq voies métaboliques majeures: la voie de biosynthèse des monoterpènes, les voies de dégradations du L-phénylalanine, des sucres, des acides gras et des protéines. Des gènes candidats codant pour des enzymes impliqués dans ces voies métaboliques ont été identifiés dans les zones d’associations correspondantes.La variété Nacional moderne est issue de diverses générations de croisements entre des Trinitario (hybrides Amelonado/Criollo) et le Nacional ancestral, mettant ainsi en jeu 3 ancêtres contrastés. L’effet de cette étape de domestication récente sur les arômes de la variété Nacional moderne a été étudié. Grâce aux données de génotypage des trois ancêtres de référence et aux résultats des GWAS portant sur l’ensemble des caractères de qualité (composés volatils et non-volatils, analyses sensorielles), il a été possible de déterminer l’origine des allèles ayant un effet positif sur les arômes dans les différentes zones d’associations. Cette étude a montré que l’ensemble des ancêtres fondateurs ont apporté des allèles favorables à la synthèse d’arômes de qualité (floraux, fruités, …) mais aussi à la synthèse de défauts (amertume, astringence, …). Nous avons pu montrer que les zones d’associations en lien avec les arômes de qualité et celles avec les défauts n’étaient pas liées génétiquement. Il est donc possible de sélectionner les zones d’intérêts pour les arômes tout en contre-sélectionnant les zones apportant des défauts.La deuxième partie de cette étude a porté sur l’analyse des arômes d’une population de cacaoyers natifs d’Amazonie et issus de la zone d’origine de la variété Nacional ancestral. Dans cette étude, des analyses GWAS ont également été effectuées sur l’ensemble des caractères de qualité analysés précédemment. Quatre vingt dix sept gènes candidats sont communs aux deux populations analysées. De nouveaux composés volatils ainsi que de nouvelles zones d’associations ont également été détectées montrant ainsi une plus grande diversité et richesse aromatique de ces nouvelles ressources génétiques et leur intérêt pour la création de nouvelles variétés aromatiques adaptées à l’Amazonie.Enfin, une étude GWAS sur les composés non-volatils, les caractères sensoriels liés à l’amertume et à l’astringence, ainsi que la teneur en matière grasse et en protéines, a également été réalisée sur les deux populations. Des gènes candidats en lien avec la voie de biosynthèse de la caféine et celle des polyphénols, ou en lien avec la voie de biosynthèse des acides gras ont pu être observés dans les zones d’associations

Two Main Biosynthesis Pathways Involved in the Synthesis of the Floral Aroma of the Nacional Cocoa Variety

International audienceTheobroma cacao is the only source that allows the production of chocolate. It is of major economic importance for producing countries such as Ecuador, which is the third-largest cocoa producer in the world. Cocoa is classified into two groups: bulk cocoa and aromatic fine flavour cocoa. In contrast to bulk cocoa, fine flavour cocoa is characterised by fruity and floral notes. One of the characteristics of Nacional cocoa, the emblematic cocoa of Ecuador, is its aromatic ARRIBA flavour. This aroma is mainly composed of floral notes whose genetic and biochemical origin is not well-known. This research objective is to study the genetic and biochemical determinism of the floral aroma of modern Nacional cocoa variety from Ecuador. Genome-Wide Association Study (GWAS) was conducted on a population of 152 genotypes of cocoa trees belonging to the population variety of modern Nacional. Genome-Wide Association Study was conducted by combining SSR and SNP genotyping, assaying biochemical compounds (in roasted and unroasted beans), and sensory evaluations from various tastings. This analysis highlighted different areas of association for all types of traits. In a second step, a search for candidate genes in these association zones was undertaken, which made it possible to find genes potentially involved in the biosynthesis pathway of the biochemical compound identified in associations. Our results show that two biosynthesis pathways seem to be mainly related to the floral note of Nacional cocoa: the monoterpene biosynthesis pathway and the L-phenylalanine degradation pathway. As already suggested, the genetic background would therefore appear as largely explaining the floral note of cocoa

Integration of GWAS, metabolomics, and sensorial analyses to reveal novel metabolic pathways involved in cocoa fruity aroma GWAS of fruity aroma in Theobroma cacao

International audienceNacional is a variety of cocoa tree known for its "Arriba" aroma characterised mainly by fruity, floral, and spicy aromatic notes. In this study, the genetic basis of the fruity aroma of modern Nacional cocoa was investigated. GWAS studies have been conducted on biochemical and sensorial fruity traits and allowed to identify a large number of association zones. These areas are linked to both the volatile compounds known to provide fruity flavours and present in the beans before and after roasting, and to the fruity notes detected by sensorial analysis. Five main metabolic pathways were identified as involved in the fruity traits of the Nacional population: the protein degradation pathway, the sugar degradation pathway, the fatty acid degradation pathway, the monoterpene pathway, and the L-phenylalanine pathway. Candidate genes involved in the biosynthetic pathways of volatile compounds identified in association areas were detected for a large number of associations.Keyword

A cluster of Ankyrin and Ankyrin-TPR repeat genes is associated with panicle branching diversity in rice.

The number of grains per panicle is an important yield-related trait in cereals which depends in part on panicle branching complexity. One component of this complexity is the number of secondary branches per panicle. Previously, a GWAS site associated with secondary branch and spikelet numbers per panicle in rice was identified. Here we combined gene capture, bi-parental genetic population analysis, expression profiling and transgenic approaches in order to investigate the functional significance of a cluster of 6 ANK and ANK-TPR genes within the QTL. Four of the ANK and ANK-TPR genes present a differential expression associated with panicle secondary branch number in contrasted accessions. These differential expression patterns correlate in the different alleles of these genes with specific deletions of potential cis-regulatory sequences in their promoters. Two of these genes were confirmed through functional analysis as playing a role in the control of panicle architecture. Our findings indicate that secondary branching diversity in the rice panicle is governed in part by differentially expressed genes within this cluster encoding ANK and ANK-TPR domain proteins that may act as positive or negative regulators of panicle meristem's identity transition from indeterminate to determinate state

Collection of native Theobroma cacao L. accessions from the Ecuadorian Amazon highlights a hotspot of cocoa diversity

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Variability and genetic determinants of cocoa aromas in trees native to South Ecuadorian Amazonia

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