Die erste funktionelle Charakterisierung einer eukaryot kodierten Bilin Lyase

Das Nukleomorph Genom der Cryptophyte Guillardia theta stellt ein Modell für nukleäre Kompaktierung dar und ist eines der kleinsten bekannten eukaryoten Genome. Seine 30 Gene für plastidäre Proteine werden als ein Grund für die derzeitige Erhaltung des Nukleomorphs angesehen. Die Charakterisierung der bislang funktionell unbekannten plastidären Proteine ist daher von höchstem Interesse. Im Rahmen dieser Arbeit konnte das auf Chromosom 1 des Nukleomorphs kodierte Protein Orf222 als funktionelles Ortholog einer spezifischen Bilin Lyase eines Cyanobakteriums charakterisiert werden. Auch konnte durch die Komplementation gezeigt werden, dass einzig ein fehlendes Bilin für den komplexen Phänotyp einer Insertionsmutante verantwortlich ist. Das cryptophytische Protein Orf222 fungiert im heterologen System des Cyanobakteriums Synechocystis sp. PCC6803 als Lyase für die Ligation eines Phycocyanobilins an Position Cystein-155 der Phycocyanin β-Untereinheit. Im homologen System der Cryptophyte ist trotz der abweichenden Pigmentkomposition, deren Lokalisation und Organisation eine Lyase-Funktion zu postulieren. Dort kommt es demnach durch das Protein Orf222 zur Ligation eines Phycoerythrocyanins an die homologe Position Cystein-158 der Phycoerythrin β-Untereinheit. Das Protein Orf222, nunmehr als CpeT zu bezeichnen, zeigt durch die funktionelle Aktivität im heterologen System eine eindeutige Regioselektivität in Bezug auf die homologe Cystein-Bindestelle, aber deutlich weniger Spezifizierung auf das jeweilige Bilin und das Apoprotein. Dies ist charakteristisch für cyanobakterielle monomere T-Typ Lyasen, zu welchen das Protein nun gezählt werden kann. Phylogenetische Analysen zeigen eine engere Verwandtschaft des Proteins Orf222 mit homologen Proteinen aus anderen Cryptophyten und Rhodophyten als mit cyanobakteriellen oder pflanzlichen Vertretern. Die cyanobakteriellen Vertreter lassen sich in vier monophyletische Gruppen einteilen, welche mit einem spezifischen Biliprotein und dem genetischen Kontext des jeweiligen Gens in Korrelation steht. Das Nukleomorph-kodierte CpeT (Orf222) Protein aus Guillardia theta stellt die erste funktionell charakterisierte Bilin Lyase eines eukaryoten Organismus dar und leistet einen weiteren Beitrag zur Aufklärung Nukleomorph-kodierter Proteine

Complementation of a phycocyanin-bilin lyase from Synechocystis sp. PCC 6803 with a nucleomorph-encoded open reading frame from the cryptophyte Guillardia theta

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Cryptophytes are highly compartmentalized organisms, expressing a secondary minimized eukaryotic genome in the nucleomorph and its surrounding remnant cytoplasm, in addition to the cell nucleus, the mitochondrion and the plastid. Because the members of the nucleomorph-encoded proteome may contribute to essential cellular pathways, elucidating nucleomorph-encoded functions is of utmost interest. Unfortunately, cryptophytes are inaccessible for genetic transformations thus far. Therefore the functions of nucleomorph-encoded proteins must be elucidated indirectly by application of methods in genetically accessible organisms.</p> <p>Results</p> <p>Orf222, one of the uncharacterized nucleomorph-specific open reading frames of the cryptophyte <it>Guillardia theta</it>, shows homology to <it>slr</it>1649 of <it>Synechocystis </it>sp. PCC 6803. Recently a further homolog from <it>Synechococcus </it>sp. PCC 7002 was characterized to encode a phycocyanin-β155-bilin lyase. Here we show by insertion mutagenesis that the <it>Synechocystis </it>sp. PCC 6803 <it>slr</it>1649-encoded protein also acts as a bilin lyase, and additionally contributes to linker attachment and/or stability of phycobilisomes. Finally, our results indicate that the phycocyanin-β155-bilin lyase of <it>Synechocystis </it>sp. PCC 6803 can be complemented <it>in vivo </it>by the nucleomorph-encoded open reading frame <it>orf</it>222.</p> <p>Conclusion</p> <p>Our data show that the loss of phycocyanin-lyase function causes pleiotropic effects in <it>Synechocystis </it>sp. PCC 6803 and indicate that after separating from a common ancestor protein, the phycoerythrin lyase from <it>Guillardia theta </it>has retained its capacity to couple a bilin group to other phycobiliproteins. This is a further, unexpected example of the universality of phycobiliprotein lyases.</p

General Protein Diffusion Barriers Create Compartments within Bacterial Cells

In eukaryotes, the differentiation of cellular extensions such as cilia or neuronal axons depends on the partitioning of proteins to distinct plasma membrane domains by specialized diffusion barriers. However, examples of this compartmentalization strategy are still missing for prokaryotes, although complex cellular architectures are also widespread among this group of organisms. This study reveals the existence of a protein-mediated membrane diffusion barrier in the stalked bacterium Caulobacter crescentus. We show that the Caulobacter cell envelope is compartmentalized by macromolecular complexes that prevent the exchange of both membrane and soluble proteins between the polar stalk extension and the cell body. The barrier structures span the cross-sectional area of the stalk and comprise at least four proteins that assemble in a cell-cycle-dependent manner. Their presence is critical for cellular fitness because they minimize the effective cell volume, allowing faster adaptation to environmental changes that require de novo synthesis of envelope proteins

Mitochondrial damage by α-synuclein causes cell death in human dopaminergic neurons

Evolving concepts on Parkinson's disease (PD) pathology suggest that α-synuclein (aSYN) promote dopaminergic neuron dysfunction and death through accumulating in the mitochondria. However, the consequence of mitochondrial aSYN localisation on mitochondrial structure and bioenergetic functions in neuronal cells are poorly understood. Therefore, we investigated deleterious effects of mitochondria-targeted aSYN in differentiated human dopaminergic neurons in comparison with wild-type (WT) aSYN overexpression and corresponding EGFP (enhanced green fluorescent protein)-expressing controls. Mitochondria-targeted aSYN enhanced mitochondrial reactive oxygen species (ROS) formation, reduced ATP levels and showed severely disrupted structure and function of the dendritic neural network, preceding neuronal death. Transmission electron microscopy illustrated distorted cristae and many fragmented mitochondria in response to WT-aSYN overexpression, and a complete loss of cristae structure and massively swollen mitochondria in neurons expressing mitochondria-targeted aSYN. Further, the analysis of mitochondrial bioenergetics in differentiated dopaminergic neurons, expressing WT or mitochondria-targeted aSYN, elicited a pronounced impairment of mitochondrial respiration. In a pharmacological compound screening, we found that the pan-caspase inhibitors QVD and zVAD-FMK, and a specific caspase-1 inhibitor significantly prevented aSYN-induced cell death. In addition, the caspase inhibitor QVD preserved mitochondrial function and neuronal network activity in the human dopaminergic neurons overexpressing aSYN. Overall, our findings indicated therapeutic effects by caspase-1 inhibition despite aSYN-mediated alterations in mitochondrial morphology and function

A Single Peroxisomal Targeting Signal Mediates Matrix Protein Import in Diatoms

Peroxisomes are single membrane bound compartments. They are thought to be present in almost all eukaryotic cells, although the bulk of our knowledge about peroxisomes has been generated from only a handful of model organisms. Peroxisomal matrix proteins are synthesized cytosolically and posttranslationally imported into the peroxisomal matrix. The import is generally thought to be mediated by two different targeting signals. These are respectively recognized by the two import receptor proteins Pex5 and Pex7, which facilitate transport across the peroxisomal membrane. Here, we show the first in vivo localization studies of peroxisomes in a representative organism of the ecologically relevant group of diatoms using fluorescence and transmission electron microscopy. By expression of various homologous and heterologous fusion proteins we demonstrate that targeting of Phaeodactylum tricornutum peroxisomal matrix proteins is mediated only by PTS1 targeting signals, also for proteins that are in other systems imported via a PTS2 mode of action. Additional in silico analyses suggest this surprising finding may also apply to further diatoms. Our data suggest that loss of the PTS2 peroxisomal import signal is not reserved to Caenorhabditis elegans as a single exception, but has also occurred in evolutionary divergent organisms. Obviously, targeting switching from PTS2 to PTS1 across different major eukaryotic groups might have occurred for different reasons. Thus, our findings question the widespread assumption that import of peroxisomal matrix proteins is generally mediated by two different targeting signals. Our results implicate that there apparently must have been an event causing the loss of one targeting signal even in the group of diatoms. Different possibilities are discussed that indicate multiple reasons for the detected targeting switching from PTS2 to PTS1

Die erste funktionelle Charakterisierung einer eukaryot kodierten Bilin Lyase

Das Nukleomorph Genom der Cryptophyte Guillardia theta stellt ein Modell für nukleäre Kompaktierung dar und ist eines der kleinsten bekannten eukaryoten Genome. Seine 30 Gene für plastidäre Proteine werden als ein Grund für die derzeitige Erhaltung des Nukleomorphs angesehen. Die Charakterisierung der bislang funktionell unbekannten plastidären Proteine ist daher von höchstem Interesse. Im Rahmen dieser Arbeit konnte das auf Chromosom 1 des Nukleomorphs kodierte Protein Orf222 als funktionelles Ortholog einer spezifischen Bilin Lyase eines Cyanobakteriums charakterisiert werden. Auch konnte durch die Komplementation gezeigt werden, dass einzig ein fehlendes Bilin für den komplexen Phänotyp einer Insertionsmutante verantwortlich ist. Das cryptophytische Protein Orf222 fungiert im heterologen System des Cyanobakteriums Synechocystis sp. PCC6803 als Lyase für die Ligation eines Phycocyanobilins an Position Cystein-155 der Phycocyanin β-Untereinheit. Im homologen System der Cryptophyte ist trotz der abweichenden Pigmentkomposition, deren Lokalisation und Organisation eine Lyase-Funktion zu postulieren. Dort kommt es demnach durch das Protein Orf222 zur Ligation eines Phycoerythrocyanins an die homologe Position Cystein-158 der Phycoerythrin β-Untereinheit. Das Protein Orf222, nunmehr als CpeT zu bezeichnen, zeigt durch die funktionelle Aktivität im heterologen System eine eindeutige Regioselektivität in Bezug auf die homologe Cystein-Bindestelle, aber deutlich weniger Spezifizierung auf das jeweilige Bilin und das Apoprotein. Dies ist charakteristisch für cyanobakterielle monomere T-Typ Lyasen, zu welchen das Protein nun gezählt werden kann. Phylogenetische Analysen zeigen eine engere Verwandtschaft des Proteins Orf222 mit homologen Proteinen aus anderen Cryptophyten und Rhodophyten als mit cyanobakteriellen oder pflanzlichen Vertretern. Die cyanobakteriellen Vertreter lassen sich in vier monophyletische Gruppen einteilen, welche mit einem spezifischen Biliprotein und dem genetischen Kontext des jeweiligen Gens in Korrelation steht. Das Nukleomorph-kodierte CpeT (Orf222) Protein aus Guillardia theta stellt die erste funktionell charakterisierte Bilin Lyase eines eukaryoten Organismus dar und leistet einen weiteren Beitrag zur Aufklärung Nukleomorph-kodierter Proteine

The Human Antimicrobial Protein Bactericidal/Permeability-Increasing Protein (BPI) Inhibits the Infectivity of Influenza A Virus

In addition to their well-known antibacterial activity some antimicrobial peptides and proteins (AMPs) display also antiviral effects. A 27 aa peptide from the N-terminal part of human bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) previously shown to harbour antibacterial activity inhibits the infectivity of multiple Influenza A virus strains (H1N1, H3N2 and H5N1) the causing agent of the Influenza pneumonia. In contrast, the homologous murine BPI-peptide did not show activity against Influenza A virus. In addition human BPI-peptide inhibits the activation of immune cells mediated by Influenza A virus. By changing the human BPIpeptide to the sequence of the mouse homologous peptide the antiviral activity was completely abolished. Furthermore, the human BPI-peptide also inhibited the pathogenicity of the Vesicular Stomatitis Virus but failed to interfere with HIV and measles virus. Electron microscopy indicate that the human BPI-peptide interferes with the virus envelope and at high concentrations was able to destroy the particles completely