Structure, mécanisme et applications du ribozyme delta

Le virus de l'hépatite delta humaine possède un génome d'ARN circulaire simple brin de 1,7 kb. Durant sa réplication en cercle roulant, la coupure des copies multimériques en monomères est assurée par la présence de motifs autocatalytiques sur la molécule ( cis ). À partir de la séquence du motif autocatalytique antigénomique, il a été possible de générer un système où le ribozyme delta (domaine catalytique) a la capacité de couper un substrat en trans. L'activité catalytique des acides ribonucléiques (ARN) lui est assurée par sa structure tridimensionnelle dynamique. Les groupements 2'-OH sont parmi les artisans permettant l'adoption de la structure active et la catalyse. Ainsi, nous avons développé différents systèmes permettant d'étudier leur importance. Une première stratégie basée sur la synthèse d'oligonucléotides mixtes (ARN/ADN) a été développée. Limité par la longueur maximale de synthèse (40 nucléotides) des ribozymes mixtes ARN/ADN, le développement d'un ribozyme bimoléculaire a été nécessaire. Ce ribozyme bimoléculaire a permis l'identification d'un important groupement 2'-OH dans la catalyse par le ribozyme delta. Par contre, ce système possède des paramètres cinétiques différents du ribozyme delta unimoléculaire suggérant des différences dans l'adoption de leur structure active. Grâce à l'avancement de la technologie de la synthèse d'oligonucléotides mixtes (ARN/ADN), une seconde approche plus globale et rapide a été mise au point. Un ribozyme mixte contrôle composé de 26 désoxyribo- (spécialement les nucléotides des deux tiges structurales) et de 31 ribonucléotides (nucléotides formant le site catalytique) a été crée. Ce nouveau ribozyme mixte permet la coupure d'un petit substrat avec des paramètres cinétiques virtuellement identiques à ceux du même ribozyme constitué uniquement de ribonucléotides. Ainsi, par le remplacement de certains ribonucléotides (2'-OH) par des désoxyribonucléotides (2'-H), il a été possible d'établir la contribution des 57 groupements 2'-OH dans l'adoption et le maintien de la structure active du ribozyme delta antigénomique. Nos résultats démontrent que 10 groupements 2'OH sont importants pour permettre une bonne catalyse par le ribozyme delta. Puisque ces 2'-OH pourraient être impliqués dans la coordination d'ions bivalents nécessaires à la catalyse, les constantes de magnésium ont été mesurées.--Résumé abrégé par UMI

Gene Targeting in the Gram-Positive Bacterium Lactococcus lactis, Using Various Delta Ribozymes

The trans-acting antigenomic delta ribozyme, isolated from the human hepatitis delta virus, was shown to be highly stable and active in vitro, as well as in mammalian cell lines. However, the stability and gene-targeting competence of this small ribozyme have not been studied previously in bacterial cells. In this paper we describe the use of two variants of the trans-acting antigenomic delta ribozyme targeting the abundant EF-Tu mRNA in the industrially important gram-positive bacterium Lactococcus lactis. These two delta ribozyme variants were expressed at significant levels and were shown to be highly stable in vivo. The half-life of the EF-Tu mRNA was slightly but consistently reduced in the presence of the classical delta ribozymes (7 to 13%). In contrast, delta ribozymes harboring a specific on/off riboswitch (SOFA-delta ribozymes) targeting the same sites on the EF-Tu mRNA considerably reduced the half-life of this mRNA (22 to 47%). The rates of catalysis of the SOFA-delta ribozymes in L. lactis were similar to the rates determined in vitro, showing that this new generation of delta ribozymes was highly efficient in these bacterial cells. Clearly, SOFA-delta ribozymes appear to be an ideal means for development of gene inactivation systems in bacteria