Etablierung eines NSCLC-Modells zur Untersuchung der Rolle der p53 DNA Bindungskooperativität für Zellschicksalsentscheidungen in vitro und in vivo

Der Tumorsuppressor p53 fungiert als eine zelluläre Drehschreibe, die eine Vielzahl von Stresssignalen erkennt und weiterverarbeitet. Über eine enge Kontrolle des Zellzyklus und des Zustands des Genoms sichert p53 die genomische Integrität einer Zelle und entscheidet durch seine Funktion als Transkriptionsfaktor als Antwort auf zelluläre Stressoren über das Zellschicksal. Abhängig von Art und Ausmaß des Schadens, kann die Antwort von transientem Zellzyklusarrest mit Einleitung von DNA-Reparaturprogrammen über einen irreversiblen Zellzyklusstopp durch Seneszenz oder Differenzierung bis hin zur Entfernung der Zelle aus dem Organismus durch p53-vermittelte Apoptose reichen. Für die Auswahl von Zielgenen und damit das p53-abhängige Zellschicksal spielt die p53 DNA Bindungskooperativität eine entscheidende Rolle. p53 bindet als Tetramer kooperativ an die DNA. Die strukturelle Basis hierfür stellen intermolekulare Interaktionen zwischen den beiden gegensätzlich geladenen Aminosäureresten Glutamat 180 und Arginin 181 an der Helix H1 der DNA Bindungsdomänen von jeweils zwei p53 Monomeren dar. Mutationen an dieser Stelle können die Kooperativität und damit Bindungsaffinität von p53 an die DNA verringern bzw. erhöhen. Dies beeinflusst die Zielgenselektion, denn hohe Kooperativität erweitert das Zielgenspektrum auch auf Gene mit von der p53-Konsensussequenz abweichenden p53-responsiven Elementen. Während Zielgene, die in der Auslösung von Zellzyklusarrest involviert sind, meist kanonische p53 RE aufweisen und daher sowohl von niedrig- als auch hoch-kooperativem p53 transaktiviert werden können, finden sich in den Promotoren von Apoptose-fördernden Zielgenen weniger perfekte, niedrig-affine p53 Bindungsstellen, für deren Bindung daher hohe Kooperativität erforderlich ist. Der Einfluss der Bindungskooperativität auf das langfristige Proliferationsverhalten von Tumorzellen in vitro und in vivo konnte dabei bislang noch nicht vergleichend untersucht werden. Übergeordnetes Ziel dieser Arbeit war es daher, Zelllinien mit stabiler Expression von p53-Kooperativitätsmutanten zu etablieren, welche den Einfluss von Kooperativität auf das Zellschicksal abbilden und untersuchbar machen. Hierzu wurde ein induzierbares p53-Expressionssystem mit den verschiedenen Kooperativitätsmutanten kloniert, die das ganze Spektrum der H1-Helix-Interaktionsstärken – von aufgehoben bis über dem physiologischen Niveau liegend – abdecken. Das System wurde weiterhin mit einem Reporter versehen, um die p53 Expression überwachbar zu machen. Die entstehenden Fusionsproteine wurden korrekt exprimiert und übten erst nach Aktivierung p53-spezifische Effekte aus. Um eine optimale Vergleichbarkeit des Einflusses von Kooperativität auf das Zellschicksal herzustellen, wurde der Versuch unternommen, die p53 Konstrukte Endonuklease-vermittelt zielgerichtet in den Rag1 Genlokus p53-negativer H1299 Zellen zu integrieren. Dabei wird der zelluläre Reparaturmechanismus der homologen Rekombination ausgenutzt, um isogene Zelllinen zu generieren. Es zeigte sich eine sehr geringe Rekombinationsrate; zudem wiesen die positiv getesteten Klone unterschiedlich hohe p53-Proteinlevel und weiterhin keine induzierbare und effektive Aktivität von p53 auf. Daher eigneten sie sich nicht zur weiteren Untersuchung der Bindungskooperativität. Es lässt sich diskutieren, dass aufgrund verschiedener möglicher Gründe – z.B. dem epigenetischen Status des Rag1-Lokus oder Mutationen im DNA-Reparatursystem – Meganuklease-vermittelte zielgerichtete Integration in H1299 Zellen nur mit sehr geringer Effizienz möglich ist. Daraufhin wurden durch konventionelle Transfektion und Selektion Zelllinien mit stabiler Expression der p53-Fusionsproteine generiert. Diese zeigten eine gute Expression der Konstrukte und nach Aktivierung von p53 starke, p53- und kooperativitätsabhängige Effekte. So zeigte sich bei der Untersuchung der langfristigen Auswirkung der Kooperativität auf die Proliferation eine mit steigender Kooperativität reduzierte Proliferationskinetik. Da die Zellen nicht isogen zueinander waren, zeigte sich in manchen der verwendeten Klone ein Einfluss der unterschiedlichen Proteinlevel auf das Zellschicksal, welche teilweise den Einfluss der Bindungskooperativität maskierte. Andererseits konnte aber auch verdeutlicht werden, dass dieses Modell bei sorgsamer Auswahl der Klone den Einfluss der p53 DNA Bindungskooperativität sehr gut abbilden kann. Daher eignet es sich sehr für weitere Experimente. Die Mechanismen p53-vermittelter Zellschicksalsentscheidungen zu verstehen, ist von großer Bedeutung, weshalb die weitere Erforschung der Bindungskooperativität – als ein Modulator dieser Entscheidungen – vorangetrieben werden sollte. Als eine der Möglichkeiten für weitere Untersuchungen mit diesem Modell bieten sich Xenograft-Studien an

Management of Cerebral Venous Thrombosis Due to Adenoviral COVID-19 Vaccination

Objective Cerebral venous thrombosis (CVT) caused by vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia (VITT) is a rare adverse effect of adenovirus-based severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) vaccines. In March 2021, after autoimmune pathogenesis of VITT was discovered, treatment recommendations were developed. These comprised immunomodulation, non-heparin anticoagulants, and avoidance of platelet transfusion. The aim of this study was to evaluate adherence to these recommendations and its association with mortality. Methods We used data from an international prospective registry of patients with CVT after the adenovirus-based SARS-CoV-2 vaccination. We analyzed possible, probable, or definite VITT-CVT cases included until January 18, 2022. Immunomodulation entailed administration of intravenous immunoglobulins and/or plasmapheresis. Results Ninety-nine patients with VITT-CVT from 71 hospitals in 17 countries were analyzed. Five of 38 (13%), 11 of 24 (46%), and 28 of 37 (76%) of the patients diagnosed in March, April, and from May onward, respectively, were treated in-line with VITT recommendations (p < 0.001). Overall, treatment according to recommendations had no statistically significant influence on mortality (14/44 [32%] vs 29/55 [52%], adjusted odds ratio [OR] = 0.43, 95% confidence interval [CI] = 0.16-1.19). However, patients who received immunomodulation had lower mortality (19/65 [29%] vs 24/34 [70%], adjusted OR = 0.19, 95% CI = 0.06-0.58). Treatment with non-heparin anticoagulants instead of heparins was not associated with lower mortality (17/51 [33%] vs 13/35 [37%], adjusted OR = 0.70, 95% CI = 0.24-2.04). Mortality was also not significantly influenced by platelet transfusion (17/27 [63%] vs 26/72 [36%], adjusted OR = 2.19, 95% CI = 0.74-6.54). Conclusions In patients with VITT-CVT, adherence to VITT treatment recommendations improved over time. Immunomodulation seems crucial for reducing mortality of VITT-CVT. ANN NEUROL 2022Peer reviewe

Sex differences in cerebral venous sinus thrombosis after adenoviral vaccination against COVID-19

Introduction: Cerebral venous sinus thrombosis associated with vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia (CVST-VITT) is a severe disease with high mortality. There are few data on sex differences in CVST-VITT. The aim of our study was to investigate the differences in presentation, treatment, clinical course, complications, and outcome of CVST-VITT between women and men. Patients and methods: We used data from an ongoing international registry on CVST-VITT. VITT was diagnosed according to the Pavord criteria. We compared the characteristics of CVST-VITT in women and men. Results: Of 133 patients with possible, probable, or definite CVST-VITT, 102 (77%) were women. Women were slightly younger [median age 42 (IQR 28–54) vs 45 (28–56)], presented more often with coma (26% vs 10%) and had a lower platelet count at presentation [median (IQR) 50x109/L (28–79) vs 68 (30–125)] than men. The nadir platelet count was lower in women [median (IQR) 34 (19–62) vs 53 (20–92)]. More women received endovascular treatment than men (15% vs 6%). Rates of treatment with intravenous immunoglobulins were similar (63% vs 66%), as were new venous thromboembolic events (14% vs 14%) and major bleeding complications (30% vs 20%). Rates of good functional outcome (modified Rankin Scale 0-2, 42% vs 45%) and in-hospital death (39% vs 41%) did not differ. Discussion and conclusions: Three quarters of CVST-VITT patients in this study were women. Women were more severely affected at presentation, but clinical course and outcome did not differ between women and men. VITT-specific treatments were overall similar, but more women received endovascular treatment.</p

Sex differences in cerebral venous sinus thrombosis after adenoviral vaccination against COVID-19

Introduction: Cerebral venous sinus thrombosis associated with vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia (CVST-VITT) is a severe disease with high mortality. There are few data on sex differences in CVST-VITT. The aim of our study was to investigate the differences in presentation, treatment, clinical course, complications, and outcome of CVST-VITT between women and men. Patients and methods: We used data from an ongoing international registry on CVST-VITT. VITT was diagnosed according to the Pavord criteria. We compared the characteristics of CVST-VITT in women and men. Results: Of 133 patients with possible, probable, or definite CVST-VITT, 102 (77%) were women. Women were slightly younger [median age 42 (IQR 28–54) vs 45 (28–56)], presented more often with coma (26% vs 10%) and had a lower platelet count at presentation [median (IQR) 50x109/L (28–79) vs 68 (30–125)] than men. The nadir platelet count was lower in women [median (IQR) 34 (19–62) vs 53 (20–92)]. More women received endovascular treatment than men (15% vs 6%). Rates of treatment with intravenous immunoglobulins were similar (63% vs 66%), as were new venous thromboembolic events (14% vs 14%) and major bleeding complications (30% vs 20%). Rates of good functional outcome (modified Rankin Scale 0-2, 42% vs 45%) and in-hospital death (39% vs 41%) did not differ. Discussion and conclusions: Three quarters of CVST-VITT patients in this study were women. Women were more severely affected at presentation, but clinical course and outcome did not differ between women and men. VITT-specific treatments were overall similar, but more women received endovascular treatment.</p

Etablierung eines NSCLC-Modells zur Untersuchung der Rolle der p53 DNA Bindungskooperativität für Zellschicksalsentscheidungen in vitro und in vivo

Der Tumorsuppressor p53 fungiert als eine zelluläre Drehschreibe, die eine Vielzahl von Stresssignalen erkennt und weiterverarbeitet. Über eine enge Kontrolle des Zellzyklus und des Zustands des Genoms sichert p53 die genomische Integrität einer Zelle und entscheidet durch seine Funktion als Transkriptionsfaktor als Antwort auf zelluläre Stressoren über das Zellschicksal. Abhängig von Art und Ausmaß des Schadens, kann die Antwort von transientem Zellzyklusarrest mit Einleitung von DNA-Reparaturprogrammen über einen irreversiblen Zellzyklusstopp durch Seneszenz oder Differenzierung bis hin zur Entfernung der Zelle aus dem Organismus durch p53-vermittelte Apoptose reichen. Für die Auswahl von Zielgenen und damit das p53-abhängige Zellschicksal spielt die p53 DNA Bindungskooperativität eine entscheidende Rolle. p53 bindet als Tetramer kooperativ an die DNA. Die strukturelle Basis hierfür stellen intermolekulare Interaktionen zwischen den beiden gegensätzlich geladenen Aminosäureresten Glutamat 180 und Arginin 181 an der Helix H1 der DNA Bindungsdomänen von jeweils zwei p53 Monomeren dar. Mutationen an dieser Stelle können die Kooperativität und damit Bindungsaffinität von p53 an die DNA verringern bzw. erhöhen. Dies beeinflusst die Zielgenselektion, denn hohe Kooperativität erweitert das Zielgenspektrum auch auf Gene mit von der p53-Konsensussequenz abweichenden p53-responsiven Elementen. Während Zielgene, die in der Auslösung von Zellzyklusarrest involviert sind, meist kanonische p53 RE aufweisen und daher sowohl von niedrig- als auch hoch-kooperativem p53 transaktiviert werden können, finden sich in den Promotoren von Apoptose-fördernden Zielgenen weniger perfekte, niedrig-affine p53 Bindungsstellen, für deren Bindung daher hohe Kooperativität erforderlich ist. Der Einfluss der Bindungskooperativität auf das langfristige Proliferationsverhalten von Tumorzellen in vitro und in vivo konnte dabei bislang noch nicht vergleichend untersucht werden. Übergeordnetes Ziel dieser Arbeit war es daher, Zelllinien mit stabiler Expression von p53-Kooperativitätsmutanten zu etablieren, welche den Einfluss von Kooperativität auf das Zellschicksal abbilden und untersuchbar machen. Hierzu wurde ein induzierbares p53-Expressionssystem mit den verschiedenen Kooperativitätsmutanten kloniert, die das ganze Spektrum der H1-Helix-Interaktionsstärken – von aufgehoben bis über dem physiologischen Niveau liegend – abdecken. Das System wurde weiterhin mit einem Reporter versehen, um die p53 Expression überwachbar zu machen. Die entstehenden Fusionsproteine wurden korrekt exprimiert und übten erst nach Aktivierung p53-spezifische Effekte aus. Um eine optimale Vergleichbarkeit des Einflusses von Kooperativität auf das Zellschicksal herzustellen, wurde der Versuch unternommen, die p53 Konstrukte Endonuklease-vermittelt zielgerichtet in den Rag1 Genlokus p53-negativer H1299 Zellen zu integrieren. Dabei wird der zelluläre Reparaturmechanismus der homologen Rekombination ausgenutzt, um isogene Zelllinen zu generieren. Es zeigte sich eine sehr geringe Rekombinationsrate; zudem wiesen die positiv getesteten Klone unterschiedlich hohe p53-Proteinlevel und weiterhin keine induzierbare und effektive Aktivität von p53 auf. Daher eigneten sie sich nicht zur weiteren Untersuchung der Bindungskooperativität. Es lässt sich diskutieren, dass aufgrund verschiedener möglicher Gründe – z.B. dem epigenetischen Status des Rag1-Lokus oder Mutationen im DNA-Reparatursystem – Meganuklease-vermittelte zielgerichtete Integration in H1299 Zellen nur mit sehr geringer Effizienz möglich ist. Daraufhin wurden durch konventionelle Transfektion und Selektion Zelllinien mit stabiler Expression der p53-Fusionsproteine generiert. Diese zeigten eine gute Expression der Konstrukte und nach Aktivierung von p53 starke, p53- und kooperativitätsabhängige Effekte. So zeigte sich bei der Untersuchung der langfristigen Auswirkung der Kooperativität auf die Proliferation eine mit steigender Kooperativität reduzierte Proliferationskinetik. Da die Zellen nicht isogen zueinander waren, zeigte sich in manchen der verwendeten Klone ein Einfluss der unterschiedlichen Proteinlevel auf das Zellschicksal, welche teilweise den Einfluss der Bindungskooperativität maskierte. Andererseits konnte aber auch verdeutlicht werden, dass dieses Modell bei sorgsamer Auswahl der Klone den Einfluss der p53 DNA Bindungskooperativität sehr gut abbilden kann. Daher eignet es sich sehr für weitere Experimente. Die Mechanismen p53-vermittelter Zellschicksalsentscheidungen zu verstehen, ist von großer Bedeutung, weshalb die weitere Erforschung der Bindungskooperativität – als ein Modulator dieser Entscheidungen – vorangetrieben werden sollte. Als eine der Möglichkeiten für weitere Untersuchungen mit diesem Modell bieten sich Xenograft-Studien an

Characteristics and Outcomes of Patients with Cerebral Venous Sinus Thrombosis in SARS-CoV-2 Vaccine-Induced Immune Thrombotic Thrombocytopenia

Importance: Thrombosis with thrombocytopenia syndrome (TTS) has been reported after vaccination with the SARS-CoV-2 vaccines ChAdOx1 nCov-19 (Oxford-AstraZeneca) and Ad26.COV2.S (Janssen/Johnson & Johnson). Objective: To describe the clinical characteristics and outcome of patients with cerebral venous sinus thrombosis (CVST) after SARS-CoV-2 vaccination with and without TTS. Design, Setting, and Participants: This cohort study used data from an international registry of consecutive patients with CVST within 28 days of SARS-CoV-2 vaccination included between March 29 and June 18, 2021, from 81 hospitals in 19 countries. For reference, data from patients with CVST between 2015 and 2018 were derived from an existing international registry. Clinical characteristics and mortality rate were described for adults with (1) CVST in the setting of SARS-CoV-2 vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia, (2) CVST after SARS-CoV-2 vaccination not fulling criteria for TTS, and (3) CVST unrelated to SARS-CoV-2 vaccination. Exposures: Patients were classified as having TTS if they had new-onset thrombocytopenia without recent exposure to heparin, in accordance with the Brighton Collaboration interim criteria. Main Outcomes and Measures: Clinical characteristics and mortality rate. Results: Of 116 patients with postvaccination CVST, 78 (67.2%) had TTS, of whom 76 had been vaccinated with ChAdOx1 nCov-19; 38 (32.8%) had no indication of TTS. The control group included 207 patients with CVST before the COVID-19 pandemic. A total of 63 of 78 (81%), 30 of 38 (79%), and 145 of 207 (70.0%) patients, respectively, were female, and the mean (SD) age was 45 (14), 55 (20), and 42 (16) years, respectively. Concomitant thromboembolism occurred in 25 of 70 patients (36%) in the TTS group, 2 of 35 (6%) in the no TTS group, and 10 of 206 (4.9%) in the control group, and in-hospital mortality rates were 47% (36 of 76; 95% CI, 37-58), 5% (2 of 37; 95% CI, 1-18), and 3.9% (8 of 207; 95% CI, 2.0-7.4), respectively. The mortality rate was 61% (14 of 23) among patients in the TTS group diagnosed before the condition garnered attention in the scientific community and 42% (22 of 53) among patients diagnosed later. Conclusions and Relevance: In this cohort study of patients with CVST, a distinct clinical profile and high mortality rate was observed in patients meeting criteria for TTS after SARS-CoV-2 vaccination