Efeito de três FLA2s, (BaTX-I, BaTX-II e BaFLA2), isoladas do veneno da serpente Bothrops atrox, sobre a funcionalidade de macrófagos J774A.1 em cultura

Dissertação apresentada ao programa de Pós-graduação em Biologia Experimental da Universidade Federal de Rondônia, para obtenção do título de Mestre.As fosfolipases A2 (FLA2) são enzimas que catalisam a hidrólise da ligação acil-éster de fosfolipídios de membranas celulares na posição sn-2, liberando ácidos graxos e lisofosfolipídios. Os produtos desta reação podem, subsequentemente, serem utilizados para a síntese de eicosanóides com funções importantes em reações inflamatórias. No presente estudo investigamos os efeitos in vitro de duas miotoxinas básicas, BaTX-I, uma Asp-49 cataliticamente ativa e BaTX-II, uma Lys-49 homóloga inativa, e de uma miotoxina ácida, BaFLA2, também uma Asp-49 ativa cataliticamente, isoladas do veneno da serpente Bothrops atrox, sobre a ativação de macrófagos J774 A.1. Em concentrações não citotóxicas, as três toxinas não afetaram a capacidade de adesão e descolamento dos macrófagos. Apenas a BaTX-II, enzimaticamente inativa, aumentou a fagocitose mediada pelo receptor de complemento. Entretanto, as três toxinas, BaTX-I, BaTX-II e BaFLA2, induziram aumento na produção de ânion superóxido em macrófagos. Somente a BaTX-II aumentou o volume lisossomal dos macrófagos após 15 minutos de incubação. Aos 30 minutos, as três fosfolipases aumentaram este parâmetro, o que não foi observado no período de 60 minutos. Além disso, as três miotoxinas, BaTX-I, BaTX-II e BaFLA2, induziram a formação de corpúsculos lipídicos em macrófagos submetidos e não submetidos á fagocitose. Este resultado pode sugerir a função dos corpúsculos lipídicos como um reservatório de mediadores inflamatórios. Ainda, as toxinas BaTX-I e BaFLA2, foram capazes de aumentar a produção de TNF-α pelos macrófagos no período de 4 horas. A BaTX-II não exerceu este efeito no tempo estudado. Tomados em conjunto, os dados mostraram que, a despeito das diferenças na atividade catalítica, as três toxinas induziram eventos inflamatórios e o caráter ácido ou básico destas enzimas não parece contribuir para estes efeitos

Efeitos locais e sistêmicos de BdipTX-I, uma nova Fosfolipase A2 Lys-49 isolada do veneno da serpente Bothrops diporus

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biologia Experimental da Fundação Universidade Federal de Rondônia - UNIR para obtenção de Título de Mestre em Biologia Experimental. Orientadora: Dr.ª Juliana P. ZulianiO presente trabalho teve como objetivo isolar as fosfolipases A2 (PLA2) básicas do veneno da serpente Bothrops diporus (VBd), avaliar e comparar as atividades edematogênica e miotóxica, bem como, os efeitos sistêmicos provocados tanto pela PLA2 isolada quanto pelo VBd em camundongos Swiss. Para tanto, o VBd foi submetido à duas etapas cromatográficas, sendo uma de troca iônica e uma de fase reversa. As frações obtidas foram analisadas quanto ao peso molecular por SDS-PAGE em gel de poliacrilamida 12,5% e quanto à atividade enzimática por hemólise indireta e atividade sobre o ácido 4-nitro-(3-octanoiloxi) benzóico (4N3OAB). Desse processo, foram obtidas duas PLA2, sendo uma Asp-49 (BdipTX-II) e uma Lys-49 (BdipTX-I). BdipTX-I e VBd foram então avaliados quanto à atividade biológica: efeitos locais (edema e miotoxicidade) e sistêmicos (efeitos sobre as funções hepática e renal). Os resultados obtidos mostraram que a atividade edematogênica, avaliada considerando-se o aumento percentual no volume das patas inoculadas com VBd ou BdipTX-I com relação as patas controle, foi significativo em todas as doses testadas tanto para BdipTX-I quanto para VBd, observando-se um aumento significativo do edema a partir de 0,5 hora nas duas doses de VBd (5 e 20 μg/pata) e na de 20 μg/pata de BdipTX-I, com pico na 1 hora e decaindo nas 24 horas, efeito não observado na dose de 20 μg/pata de VBd. Quanto a miotoxicidade, avaliada pelo aumento dos níveis séricos de creatina quinase (CK), CK-MB e lactato desidrogenase (LDH), os dados obtidos mostraram que o efeito de VBd é mais proeminente do que o de BdipTX-I. Os efeitos sistêmicos causados a partir da lesão local foram avaliados pela dosagem de marcadores laboratoriais específicos. Sendo utilizados: AST, ALT, GGT e FAL para avaliar a função hepática; níveis de ureia e creatinina séricos e urinários, excreção de proteínas e cálcio na urina para avaliar o dano renal. Lesões cardíacas e hepáticas não foram confirmadas, apesar de ter havido elevações nos níveis de LDH e AST. Contudo, BdipTX-I e VBd foram capazes de induzir alterações renais no modelo experimental testado, ocasionando proteinúria (induzida tanto por BdipTX-I quanto por VBd), além de uremia (presente no efeito de VBd, mas não de BdipTX-I). Deste modo, estabelece-se que as ações sistêmicas da proteína e do veneno ocorrem de forma diferenciada. Fato que, provavelmente, está relacionado aos outros componentes presentes no VBd. Este estudo além de ter propiciado o isolamento de duas PLA2 inéditas para o VBd, também traz informações adicionais acerca dos efeitos sistêmicos induzidos tanto pelo veneno quanto pela PLA2 isolada

Efeito do fator neutralizante de Crotalus (CNF), isolado do plasma da serpente Crotalus durissus terrificus, sobre a funcionalidade de leucócitos humanos.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação: Mestrado em Biologia Experimental (PGBIOEXP) da Fundação Universidade Federal de Rondônia (UNIR) como requisito final para a obtenção do título de Mestre em Biologia Experimental. Orientadora: Prof. Dra. Juliana Pavan ZulianiO fator neutralizante de Crotalus (CNF) é um inibidor de fosfolipase A2 (FLA2), isolado do plasma do sangue da cascavel Sul Americana, Crotalus durissus terrificus. Esse inibidor neutraliza tanto a atividade letal quanto enzimática (FLA2) da crotoxina, a principal neurotoxina do veneno de C. d. terrificus. No presente estudo, foram investigados os efeitos do CNF sobre a funcionalidade de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) e neutrófilos humanos. As células foram obtidas de doadores sadios através do método de gradiente de densidade. Foram avaliadas a viabilidade e proliferação, através da redução do MTT. A produção de citocinas foi mensurada realizando-se ensaio imunoenzimático. Adicionalmente, a liberação de mieloperoxidase (MPO) foi mensurada pelo consumo de peróxido, e a geração de ânion superóxido foi avaliada através da redução do NBT. O CNF não apresentou toxicidade sobre PBMCs e neutrófilos humanos. Em concentração não tóxica, o CNF, em PBMCs, atua estimulando a liberação de TNF-á, porém, não estimula a produção de IL-10 e IL-2 e não afeta a proliferação celular. Além disso, não induz liberação de ânion superóxido, mas inibe a produção de ânion superóxido quando estimulada pela crotoxina. Em neutrófilos, o CNF não induz a liberação tanto de MPO quanto de ânion superóxido, porém induz a produção de IL-8. Esses dados mostram a influência do CNF na função de PBMCs, por induzir a produção de TNF-á, e de neutrófilos, por estimular a produção de IL-8

Efeito da L-Aminoácido Oxidase isolada do veneno da serpente Calloselasma rhodostoma na função de neutrófilos humanos

Tese apresentada à Fundação Universidade Federal de Rondônia, como requisito para obtenção do título de Doutor em Biologia Experimental no Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental. Orientado: Adriana Silva Pontes Orientador: Prof.ª Dr.ª Juliana Pavan ZulianiO veneno de serpentes consiste em uma mistura complexa de proteínas, peptídeos, lipídios, polissacarídeos e substâncias químicas inorgânicas. Polipeptídeos e proteínas estão presentes em maiores proporções, chegando a 90-95% do seu peso seco. Dentre os constituintes proteicos do venenos temos as metaloproteases, fosfodilesterases, hialuronidase, fosfolipases A2 (PLA2) e L-aminoácido oxidase (LAAO). A LAAO é uma enzima que se encontra amplamente distribuída em várias espécies de seres vivos. Além de peçonhas de serpentes, a enzima foi identificada em insetos, fungos e em plantas. Esta proteína desperta um grande interesse na área científica por apresentar efeitos de oxidação sobre diversos patógenos, como fungos e vírus e, sobre várias linhagens celulares. Parte desses efeitos é creditado ao peróxido de hidrogênio, gerado na reação oxidativa dessa enzima. Estudos anteriores realizados por Pontes et al. (2014) demonstraram a capacidade da LAAO, isolada do veneno da serpente Calloselasma rhodostoma, em ativar neutrófilos humanos isolados. Vale ressaltar que esta foi à primeira descrição desse efeito. No presente estudo, a LAAO não apresentou toxicidade sobre os neutrófilos. Nas concentrações de 50 e 100 μg/ mL, a toxina estimulou a migração dos neutrófilos, inibida pelo tratamento com Wortimanina (inibidor da PI3K) e SB 202190 (inibidor da p38 MAPK). Também, foi capaz de estimular a produção de espécies reativas do oxigênio seguido de degranulação, fagocitose de partículas de zimosan e liberação de mieloperoxidase pelos neutrófilos. Além disso, a LAAO estimulou estas células a liberar citocinas proinflamatórias como a IL-8, após 3 horas e, a IL-6, após 1 hora de incubação. Os mediadores lipídicos, prostaglandina E2 e o leucotrieno B4 foram detectados após 1 e 2 horas de incubação com a LAAO, respectivamente. A LAAO também foi capaz de estimular a formação e liberação de NETs, durante a 1ª hora de incubação. Este estudo permitiu uma melhor compreensão do mecanismo de ação da LAAO sobre neutrófilos, possibilitando novas perspectivas para sua utilização como modelo molecular no estudo de processos fisiopatológicos e para o desenvolvimento de novos fármacos

Efeito do veneno bruto e de duas fosfolipases a2 (balttx-i – lys49 e balttx-ii – asp49) isoladas do veneno da serpente bothrops alternatus sobre a funcionalidade de macrófagos peritoneais murinos elicitados

Dissertação apresentada ao programa de Pós-graduação em Biologia Experimental da Universidade Federal de Rondônia, para obtenção do título de Mestre.Os venenos de serpentes da família Viperidae consistem em uma complexa mistura de proteínas, peptídeos, lipídios, polissacarídeos e substâncias inorgânicas. Várias miotoxinas, com características estruturais de fosfolipases A2 (FLA2s), foram isoladas dos venenos serpentes da família Viperidae. Os venenos contêm FLA2s, que apresentam homologia estrutural com as de mamíferos. Essas enzimas, por hidrolizarem fosfolipídio de membrana, liberam ácido araquidônico, precursor de eicosanóides, segundos mensageiros de processos fisiológicos e fisiopatológicos. Por catalizarem essas reações, as fosfolipases possuem importantes funções em vários processos biológicos, através da formação de segundos mensageiros que exercem ações biológicas importantes e transdução de sinais celulares. Desse modo este estudo teve por objetivo avaliar o efeito de duas FLA2s, isoladas do veneno de Bothrops alternatus, a miotoxina BaltTX-I, uma Lys-49 catalíticamente inativa e a BaltTX-II, uma Asp-49 enzimaticamente ativa, bem como o veneno bruto sobre a funcionalidade de macrófagos peritoneais in vitro. Os resultados obtidos demonstraram que o tanto o veneno quanto as toxinas não interferem na capacidade de adesão e no com o descolamento dos macrófagos. Além disso, o veneno e a toxina BaltTX-I, mas não a BaltTX-II, nas concentrações de 6, 3 e 1,5 µg/mL induziram o aumento da taxa de fagocitose via receptor de complemento após uma hora de incubação. Adicionalmente foi avaliada a participação da proteína kinase C (PKC) na fagocitose via receptor de complemento. A inibição da PKC, pelo pré-tratamento dos macrófagos com estaurosporina, aboliu a fagocitose induzida pelo veneno e pela BaltTX-I. Ainda, o veneno bruto, assim como as duas toxinas induzem a produção de superóxido, sugerindo que a atividade de fosfolipase não é essencial para o desencadeamento desse efeito. Esses estudos contribuem para a melhor compreensão da fisiopatologia do envenenamento e para o mecanismo de ação do veneno botrópico e das fosfolipases, presentes nesses venenos, para a ativação dos macrófagos

Expressão de receptores "toll-like" no músculo gastrocnêmio de camundongos induzida pela peçonha de Bothrops jararacussu e por duas fosfolipases A2 (BthTX-I e BthTX-II) isoladas

Dissertação apresentada ao programa de Pós- Graduação em Biologia Experimental/UNIR como requisito para a obtenção do título de mestre em Biologia Experimental. Orientadora: Drª. Giselle Martins Gonçalves Co-orientadora: Drª. Juliana Pavan ZulianiOs acidentes ofídicos se caracterizam como um grave problema de saúde pública devido a sua alta incidência, afetando principalmente pessoas de baixa renda que vivem em áreas isoladas ou de difícil acesso a unidades de tratamento, podendo ocasionar assim, incapacidade do membro atingido, amputações ou em casos mais graves a morte do indivíduo. No Brasil, as serpentes do gênero Bothrops, são causadoras de 90% dos envenenamentos, sendo a Bothrops jararacussu, uma das que mais se destaca por inocular grandes quantidades de peçonha na sua presa provocando ações miotóxicas, proteolíticas, coagulantes e hemorrágicas. Dados na literatura mostram que as fosfolipases A2 isoladas de toxinas de serpentes do gênero Bothrops estão envolvidas na resposta inflamatória local. No entanto, os mecanismos pelos os quais as toxinas de serpentes desencadeiam esse processo, ainda não foram elucidados. Os receptores Toll-Like (TLRs) são proteínas transmembrana que reconhecem padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), ou ainda, padrões moleculares associados a danos (DAMPs). Após esse reconhecimento, é ativada uma cascata de sinalização que resulta na produção de citocinas proinflamatórias e consequente resposta imune inata. Dessa forma, a proposta deste trabalho foi estudar a participação de diferentes TLRs durante o processo inflamatório local induzido pela peçonha e duas fosfolipases A2 isoladas da serpente B. jararacussu. Para isso, doses sub-letais de peçonha de B. jararacussu, ou BthTX-I ou BthTX-II foram aplicados por via i.m em modelos murinos. A atividade miotóxica foi avaliada por análise histológica e pela quantificação dos níveis plasmáticos de CKtotal. A produção das citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-1β foi dosada do tecido muscular e do plasma por método imunoenzimático – ELISA. Foi realizada a quantificação da expressão gênica dos TLRs 2, 4, 5 e 9 nos tecidos pelo método da reação em cadeia da polimerase em tempo real (RTq-PCR). De acordo com os resultados, pode-se observar que a peçonha e suas toxinas provocaram alterações teciduais caracterizando mionecrose e infiltrado neutrofílico; também induziram a um significativo aumento de CK na corrente sanguínea dos murinos; assim como, levaram a um aumento de TNF-α e IL-1β nos animais testados quando comparados ao controle. Ainda, os resultados apontaram importante aumento na expressão dos TLR2 e TLR4. A participação desses receptores na inflamação provocada pela peçonha de B.jararacussu e suas fosfolipases sugere que os TLRs são importantes alvos para o desenvolvimento de futuras terapias no que diz respeito a inflamação provocada pelos envenenamentos ofídicos ou por fosfolipases A2 miotóxicas

Prostaglandina E2 induz ovulação em camundongos pré-púberes

The objective of this study was to determine the ability of prostaglandin E2 (PGE2) to induce ovulation and expression of PGE2 receptor (EP2 and EP4) and COX genes (COX-1 and COX-2) in the ovary and pituitary of prepubertal mice. The positive control consisted of the application of 5 μg of gonadotropin-releasing hormone (GnRH, n = 29); the negative control applied 0.5 mL of phosphate buffered saline (PBS, n=31); the treatment tested the application of 250 μg of PGE2 (n = 29), making a total of 89 prepubertal mice (BALB/c). Mice were euthanized 14 to 15 h after treatments to detect ovulation and tissue collection. A Chi-square test was used to compare the proportion of animals ovulating. Gene expressions and number of ovulation were analyzed by one-way ANOVA and Tukey’s test was used to compare means among groups. A greater proportion of mice (P < 0.001) ovulated after receiving GnRH (89.7%, 26/29) compared to PGE2 group (58.6%, 17/29). However, the proportion was higher compared to those treated with PBS (0%, 0/31). Ep2 gene expression in the pituitary was > two-fold higher (P < 0.05) in the PGE2 group compared to the PBS and GnRH groups. Further, PGE2 stimulated Cox1 (2.7 fold, P < 0.05) while GnRH stimulated Cox2 expression (6.5 fold, P < 0.05) in the pituitary when compared to the PBS group. In conclusion, our results support the hypothesis that PGE2 can induce ovulation in prepubertal mice with a concomitant increase in Ep2 and Cox1 gene expression in the pituitary gland.O objetivo deste estudo foi determinar a capacidade da prostaglandina E2 (PGE2) em induzir a ovulação e expressão do receptor PGE2 (EP2 e EP4) e genes COX (COX-1 e COX-2) no ovário e na hipófise de camundongos pré-púberes. O controle positivo consistiu na aplicação de 5 μg de hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH, n = 29); o controle negativo aplicação 0,5 mL de tampão fosfato-salino (PBS, n=31); o tratamento testado aplicação de 250 μg de PGE2 (n = 29), perfazendo um total de 89 camundongos (BALB/c) pré-púberes. Os camundongos foram sacrificados 14 a 15 h após os tratamentos para detectar ovulações e coleta de tecido. O teste do qui-quadrado foi usado para comparar a proporção de animais ovulando. As expressões gênicas e o número de ovulação foram analisados por ANOVA e o teste de tukey foi usado para comparar as médias entre os grupos. Uma maior proporção de camundongos (P <0,001) ovulou após receber GnRH (89,7%, 26/29) em comparação com o grupo PGE2 (58,6%, 17/29). No entanto, a proporção foi maior em comparação com aqueles tratados com PBS (0%, 0/31). A expressão do gene Ep2 na hipófise foi duas vezes maior (P <0,05) no grupo PGE2 em comparação com os grupos PBS e GnRH. Além disso, a PGE2 estimulou a Cox1 (2,7 vezes, P <0,05) enquanto o GnRH estimulou a expressão de Cox2 (6,5 vezes, P <0,05) na pituitária em comparação com o grupo PBS. Em conclusão, nossos resultados suportam a hipótese de que PGE2 é capaz de induzir ovulação em camundongos pré-púberes com aumento concomitante na expressão dos genes Ep2 e Cox1 na glândula pituitária

Amazonian biodiversity: a view of drug development for Leishmaniasis and malaria

Chemotherapy is the only validated therapy for the treatment for the neglected diseases leishmaniasis and malaria. However, the emergence of drug resistance, collateral effects and long-term treatment encourage the development of new and more efficient drugs. The Amazon tropical forest includes the richest areas of biodiversity in the world, including a great number of microbes, plant and animal species that produce a source of interesting biologically active molecules. Several of these molecules, obtained from plant extracts and frog venom have leishmanicidal and plasmodicidal activity, highlighting the potential of this biodiversity for the development of new drugs. In research, modern approaches in new drug development are carried out using combinatorial chemistry, high-throughput screening, bioinformatics, molecular interaction, crystallography and dynamic studies of cellular and systemic toxicity. In Brazil, these techniques are mainly present in only a few academic groups with no efficient connection to industry. The problem associated with over-regulation for accessing the biological material in restricted areas, local populations and indigenous areas places major barriers in the path of research and development of new drugs. Thus, the association of academic research groups in Brazil, encouraged and supported by government and industry, is essential to overcome these major barriers related to the development of new products for treatment of neglected diseases from Amazonian biodiversity in future years.A quimioterapia é o único procedimento farmacológico validado para a terapêutica da leishmaniose e da malária, consideradas doenças negligenciadas para o desenvolvimento de fármacos pelas indústrias farmacêuticas. Com a não renovação medicamentosa, o surgimento de resistência, os efeitos colaterais e o longo período de tratamento indicam a necessidade do desenvolvimento de novos e mais eficientes fármacos. A Floresta Amazônica é a região com a maior biodiversidade do planeta, com uma riqueza de animais e plantas produtoras de moléculas com atividades biológicas relevantes para o desenvolvimento e exploração biotecnológica. Algumas destas moléculas, obtidas de extratos vegetais e de venenos de anuros, apresentam atividade leishmanicida e plasmodicida, o que demonstra o potencial desta biodiversidade para a investigação de novas drogas. A moderna abordagem na pesquisa de novos fármacos envolve a associação de química combinatória, high-throughput screening, bioinformática, interação molecular, cristalografia e o estudo dinâmico de toxicidade sistêmica e celular, que atualmente no Brasil, estão distribuídas em poucos grupos acadêmicos sem a devida associação industrial. Esta deficiência, agregada ao excesso de regulamentação para o acesso ao material biológico, sobretudo, proveniente de unidades de conservação, populações tradicionais e nações indígenas, é um importante entrave para o desenvolvimento deste tipo de pesquisa. A associação de grupos de pesquisa do Brasil, estimulados por políticas governamentais de financiamento acadêmico e industrial, são essenciais para a superação destas dificuldades, de forma que nos próximos anos possam surgir novos produtos para terapia de doenças negligenciadas oriundas da biodiversidade amazônica