Avaliação da biodisponibilidade dos principais metabólitos secundários do guaco a partir da forma farmacêutica xarope

Orientador: Prof. Dr. Roberto PontaroloTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmaceuticas. Defesa: Curitiba, 21/02/2013Bibliografia: fls.125-138Resumo: O objetivo com este trabalho foi realizar um estudo farmacocinético da cumarina (CUM), 7-hidroxicumarina (7-HC), ácido o-cumárico (AOC) e ácido caurenóico (CAU) em voluntários sadios. Para quantificação em plasma dessas substâncias, dois métodos por CLAE-EM/EM foram desenvolvidos e validados. A pré-purificação dos analitos foi realizada por meio de extração líquido-líquido com tert-butil metil éter e através da técnica de precipitação de proteínas com acetonitrila. A cumarina, a 7-hidroxicumarina e o padrão interno (PI) 6-metilcumarina foram monitorados no modo positivo de ionização enquanto que os ácidos o-cumárico, caurenóico, isoferúlico (PI) e a prednisona (PI) no modo negativo de ionização. A separação cromatográfica foi realizada em uma coluna XBridge Shield RP18 150 x 2,1 mm (tamanho de partícula 5 ?m). Para o modo positivo de ionização a fase móvel foi composta de uma mistura de acetonitrila/água/ácido fórmico (65:35:0.05, v/v/v) eluída em modo isocrático. Para o modo negativo de ionização a fase móvel foi composta de um gradiente entre água e acetonitrila/água (95:5, v/v), ambos contendo 1 mM de formiato de amônio. Os resultados de validação mostraram que os novos métodos são seletivos e livres de efeito residual e de matriz. Os baixos limites de detecção (1,5 ng/mL para CAU, 3,0 ng/mL para CUM e 2,5 ng/mL para 7-HC e AOC) e de quantificação (5,0 ng/mL para CAU, 7,5 ng/mL para 7-HC e 10,0 ng/mL para AOC e CUM) indicaram que os novos métodos são muito sensíveis. As curvas de calibração apresentaram uma excelente correlação (r ? 0,99) nas faixas de 10,0 - 1500 ng/mL para CUM, 7,5 - 1000 ng/mL para 7-HC, 10,0 - 1000 ng/mL para AOC e 5,0 - 750 ng/mL para AOC. Nos diferentes níveis de concentração as variações de precisão e exatidão foram 70%) foi obtida com elevada precisão (CV 70%) was reached with high precision (RSD < 5.0%). Under normal working conditions, an excellent stability of the analytes was observed in both plasma and solutions. The methods were successfully applied for determining COU, 7-HC, OCA and KAU in plasma volunteers who orally received guaco syrup or guaco syrup spiked with COU. In volunteers who received 60 mL guaco syrup (single dose) the bioavailability of COU, 7-HC, OCA and KAU was insufficient to reach quantifiable levels of these substances. By administering 60 mL of guaco syrup spiked with 1500 mg of COU, sufficient levels of COU, 7-HC and OCA were obtained and the pharmacokinetic parameters of each compound were determined. The study demonstrated that OCA is one of the main bioavailable metabolite of COU making necessary additional studies to evaluate their toxic and therapeutic potential in humans. Analysis of pharmacokinetic parameters demonstrated that the elimination of OCA is limited to its rate formation. The study also demonstrated that the plasmatic levels of 7-HC are extremely low. The kinetic profile of 7-HC suggests sequential metabolism in the liver with low access of 7-HC to the systemic circulation. The study also evidenced that the recommended dose of guaco syrup does not provide sufficient levels of the main guaco metabolites to obtain a bronchodilation effect. Because the use of guaco have public health impact, clinical studies are necessary to prove their efficacy or to avoid public spending

Determinação de metabólitos secundários do guaco nas especialidades farmacêuticas xarope e solução oral via Claedad e Clae-EM/EM

Orientador : Prof. Dr. Roberto PontaroloCo-Orientadora : Dra. Francinete Ramos CamposDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 19/03/2010Bibliografia: fls.195-210Área de concentração: Insumos, medicamentos e correlatosResumo: No Brasil, as especies de Mikania glomerata e M. laevigata (popularmente conhecidas como guaco), sao amplamente utilizadas para o tratamento de diversas condicoes inflamatorias e alergicas, principalmente as do sistema respiratorio. Em virtude das propriedades farmacologicas atribuidas a essas especies, os fitoterapicos a base de guaco tem seu uso amplamente difundido na populacao brasileira, sendo incluidos nos programas de fitoterapia do Sistema Unico de Saude (SUS). Apesar do reconhecimento terapeutico destes medicamentos, apenas tres metodos analiticos foram encontrados na literatura para o controle de qualidade de especialidades farmaceuticas a base de guaco. Alem destes metodos serem bastante laboriosos, pois envolvem diversas etapas de extracao, avaliam somente a 1,2-benzopirona (cumarina), nao sendo determinado nenhum outro metabolito relacionado aos efeitos farmacologicos do guaco. O objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento e validacao de metodos analiticos para quantificacao de cinco metabolitos do guaco (cumarina, acido o-cumarico, dihidrocumarina, siringaldeido e acido caurenoico) atraves de CLAE-DAD e CLAE-EM/EM sem a necessidade de nenhum pre-tratamento das amostras. O metodo atraves de CLAE-DAD foi desenvolvido e validado em uma coluna Zorbax XDB C18 (150 x 4.6 mm, 5 ƒÝm) utilizando como fase movel uma mistura de agua/metanol/acetonitrila/acido formico (65:30:5:1, v/v/v/v), com fluxo de 1.0 mL min-1 em modo isocratico de eluicao. O volume de injecao foi de 20 £gL sendo os analitos monitorados em comprimento de onda unico de 274 nm. Para todos os compostos, o metodo foi linear em um intervalo compreendido de 1.0 a 200 ƒÝg mL-1. O intervalo de recuperacao para o ensaio de exatidao foi de 97.9 a 101.8% com um DPR < 5% para precisao intra-dia e inter-dia. O estudo de robustez indicou que o fluxo e um fator critico. Os metodos atraves de CLAE-EM/EM foram desenvolvidos e validados em uma coluna XBridge C18 (150 x 2,1mm, 5 ƒÝm) utilizando como fase movel um gradiente de eluicao entre agua e acetonitrila contendo 0,05% de acido formico ou 5 mM de formiato de amonio de acordo com as caracteristicas de ionizacao de cada composto. O fluxo foi mantido em 200 £gL min-1 no modo positivo de ionizacao e 220 mL min-1 no modo negativo de ionizacao. Os metodos apresentaram linearidade nas faixas de 1,25 a 400 ng mL-1 para cumarina, 10 a 600 ng mL-1 para dihidrocumarina, 5 a 250 ng mL-1 para o acido caurenoico e 25 a 500 ng mL-1 para siringaldeido e acido o-cumarico. O intervalo de recuperacao para o ensaio de exatidao foi de 95,3 a 103,8% com um DPR < 6,3% para precisao intra-dia e inter-dia. Os novos metodos podem ser aplicados para a quantificacao destes metabolitos nas apresentacoes farmaceuticas xarope e solucao oral, sendo, portanto, uma alternativa para o controle de qualidade deste tipo de produto na industria farmaceutica.Abstract: Mikania glomerata and M. laevigata popularly known as guaco are widely used for the treatment of several inflammatory and alergic conditions, particularly in the respiratory system, probably acting through their bronchodilator and antinflamatory properties. Due to therapeutic proprerties attributed to these species, guaco preparation has a widespread used in brazilian population and it has beem included in the government phyoterapy programs. Despite the widespread use, only three analytical methods were found in the literature for the quality control of guaco pharmaceutical preparations. Furthermore, these methods are very laborious (with several extraction processes required) and assess only 1,2 benzopyrone content (coumarin). Therefore do not quantify any other metabolites related to the pharmacological effects of guaco. The aim of this work is to development and validation of analytical methods to determine five guaco secondary metabolites (coumarin, o-coumaric acid, dihydrocoumarin, kaurenoic acid and syringaldehyde) by HPLC-DAD and HPLC-MS/MS without need any pretreatment of the samples. HPLC-DAD chromatographic separations were carried out on a Zorbax Eclipse XDB C18 150 x 4.6 mm i.d., 5-ƒÝm particle size column. The mobile phase consisted of water/methanol/acetonitrile/formic acid (65:30:5:1, v/v/v/v) at a flow rate of 1.0 mL min-1 in isocratic elution mode. The detection wavelength was set at 274 nm and the injection volume of the sample was 20 ƒÝL. For all compounds, the method was linear, over a range of 1.0 - 200 ƒÝg mL-1. The range of recovery was 97.9 to 101.8% with a RSD < 5% for intra-day and inter-day precision. The robustness study indicated that flow rate is a critical factor. HPLC-MS/MS methods were carried out using Xbridge C18 150 x 2.1 mm i.d, 5 £gm particle size column. The mobile phase consisted in a gradient of water and acetonitrile containig 0.05% formic acid or 5 mM ammonium formate according the ionization characteristics of each analyte. The flow rates were 200 £gL min-1 to the positive ionization mode and 220 £gL min-1 to the negative ionization mode. The volume of injections was maintened 10 £gL in both methods. The methods showed linearity over a range of 1.25 to 400 ng mL-1 for coumarin, 10 to 600 ng mL-1 for dihydrocoumarin, 5 to 250 ng mL-1 kaurenoic acid and 25 to 500 ng mL-1 for syringaldehyde and o-coumaric acid. The range of recovery was 95.3 to 103.8% with a RSD < 6.3% for intra-day and inter-day precision. These methods are presented as an alternative for the quality control of pharmaceutical preparations containing guaco

DETERMINAÇÃO DE GENISTEÍNA E GENISTINA POR ESPECTROFOTOMETRIA DE UV-VISÍVEL EM EXTRATOS SECOS DE SOJA UTILIZADOS COMO MATÉRIA-PRIMA EM FARMÁCIAS DE MANIPULAÇÃO

As isoflavonas são predominantemente encontradas em leguminosas e mais abundantes na soja. Estas são fitoestrógenos que mimetizam a ação do estradiol, porém com menor intensidade e tem sido utilizadas principalmente na terapia de reposição hormonal. Genisteína, daidzeína e gliciteína são as agliconas mais abundantes nos extratos de soja, ocorrendo também como glicosídeos. Neste contexto, a genisteína é considerada a isoflavona com maior atividade estrogênica, sendo que sua quantidade pode variar devido à influência de diversos fatores. Portanto, sua determinação em extratos de soja é importante uma vez que o conteúdo individual de isoflavonas pode ter implicações na atividade biológica. No presente trabalho foi avaliado o teor de genisteína+genistina em dez amostras de extratos secos de soja utilizados como matéria-prima em farmácias de manipulação. O método utilizado foi o doseamento por UV-VIS após reação com cloreto de alumínio. Os resultados demonstraram que há uma considerável variação na concentração de genisteína+genistina entre os diferentes lotes de extrato seco e que 62,5% das amostras apresentaram teores aproximados dos valores declarados nos certificados de análises, demonstrando a necessidade de padronização de isoflavonas individuais nestas matérias-primas. O método utilizado se mostrou simples e rápido para a avaliação dos teores de genisteína+genistina de extratos secos de soja comercializados em farmácias de manipulação

Determinação de metabólitos secundários do guaco nas especialidades farmacêuticas xarope e solução oral via Claedad e Clae-EM/EM

Orientador : Prof. Dr. Roberto PontaroloCo-Orientadora : Dra. Francinete Ramos CamposDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 19/03/2010Bibliografia: fls.195-210Área de concentração: Insumos, medicamentos e correlatosResumo: No Brasil, as especies de Mikania glomerata e M. laevigata (popularmente conhecidas como guaco), sao amplamente utilizadas para o tratamento de diversas condicoes inflamatorias e alergicas, principalmente as do sistema respiratorio. Em virtude das propriedades farmacologicas atribuidas a essas especies, os fitoterapicos a base de guaco tem seu uso amplamente difundido na populacao brasileira, sendo incluidos nos programas de fitoterapia do Sistema Unico de Saude (SUS). Apesar do reconhecimento terapeutico destes medicamentos, apenas tres metodos analiticos foram encontrados na literatura para o controle de qualidade de especialidades farmaceuticas a base de guaco. Alem destes metodos serem bastante laboriosos, pois envolvem diversas etapas de extracao, avaliam somente a 1,2-benzopirona (cumarina), nao sendo determinado nenhum outro metabolito relacionado aos efeitos farmacologicos do guaco. O objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento e validacao de metodos analiticos para quantificacao de cinco metabolitos do guaco (cumarina, acido o-cumarico, dihidrocumarina, siringaldeido e acido caurenoico) atraves de CLAE-DAD e CLAE-EM/EM sem a necessidade de nenhum pre-tratamento das amostras. O metodo atraves de CLAE-DAD foi desenvolvido e validado em uma coluna Zorbax XDB C18 (150 x 4.6 mm, 5 ƒÝm) utilizando como fase movel uma mistura de agua/metanol/acetonitrila/acido formico (65:30:5:1, v/v/v/v), com fluxo de 1.0 mL min-1 em modo isocratico de eluicao. O volume de injecao foi de 20 £gL sendo os analitos monitorados em comprimento de onda unico de 274 nm. Para todos os compostos, o metodo foi linear em um intervalo compreendido de 1.0 a 200 ƒÝg mL-1. O intervalo de recuperacao para o ensaio de exatidao foi de 97.9 a 101.8% com um DPR < 5% para precisao intra-dia e inter-dia. O estudo de robustez indicou que o fluxo e um fator critico. Os metodos atraves de CLAE-EM/EM foram desenvolvidos e validados em uma coluna XBridge C18 (150 x 2,1mm, 5 ƒÝm) utilizando como fase movel um gradiente de eluicao entre agua e acetonitrila contendo 0,05% de acido formico ou 5 mM de formiato de amonio de acordo com as caracteristicas de ionizacao de cada composto. O fluxo foi mantido em 200 £gL min-1 no modo positivo de ionizacao e 220 mL min-1 no modo negativo de ionizacao. Os metodos apresentaram linearidade nas faixas de 1,25 a 400 ng mL-1 para cumarina, 10 a 600 ng mL-1 para dihidrocumarina, 5 a 250 ng mL-1 para o acido caurenoico e 25 a 500 ng mL-1 para siringaldeido e acido o-cumarico. O intervalo de recuperacao para o ensaio de exatidao foi de 95,3 a 103,8% com um DPR < 6,3% para precisao intra-dia e inter-dia. Os novos metodos podem ser aplicados para a quantificacao destes metabolitos nas apresentacoes farmaceuticas xarope e solucao oral, sendo, portanto, uma alternativa para o controle de qualidade deste tipo de produto na industria farmaceutica.Abstract: Mikania glomerata and M. laevigata popularly known as guaco are widely used for the treatment of several inflammatory and alergic conditions, particularly in the respiratory system, probably acting through their bronchodilator and antinflamatory properties. Due to therapeutic proprerties attributed to these species, guaco preparation has a widespread used in brazilian population and it has beem included in the government phyoterapy programs. Despite the widespread use, only three analytical methods were found in the literature for the quality control of guaco pharmaceutical preparations. Furthermore, these methods are very laborious (with several extraction processes required) and assess only 1,2 benzopyrone content (coumarin). Therefore do not quantify any other metabolites related to the pharmacological effects of guaco. The aim of this work is to development and validation of analytical methods to determine five guaco secondary metabolites (coumarin, o-coumaric acid, dihydrocoumarin, kaurenoic acid and syringaldehyde) by HPLC-DAD and HPLC-MS/MS without need any pretreatment of the samples. HPLC-DAD chromatographic separations were carried out on a Zorbax Eclipse XDB C18 150 x 4.6 mm i.d., 5-ƒÝm particle size column. The mobile phase consisted of water/methanol/acetonitrile/formic acid (65:30:5:1, v/v/v/v) at a flow rate of 1.0 mL min-1 in isocratic elution mode. The detection wavelength was set at 274 nm and the injection volume of the sample was 20 ƒÝL. For all compounds, the method was linear, over a range of 1.0 - 200 ƒÝg mL-1. The range of recovery was 97.9 to 101.8% with a RSD < 5% for intra-day and inter-day precision. The robustness study indicated that flow rate is a critical factor. HPLC-MS/MS methods were carried out using Xbridge C18 150 x 2.1 mm i.d, 5 £gm particle size column. The mobile phase consisted in a gradient of water and acetonitrile containig 0.05% formic acid or 5 mM ammonium formate according the ionization characteristics of each analyte. The flow rates were 200 £gL min-1 to the positive ionization mode and 220 £gL min-1 to the negative ionization mode. The volume of injections was maintened 10 £gL in both methods. The methods showed linearity over a range of 1.25 to 400 ng mL-1 for coumarin, 10 to 600 ng mL-1 for dihydrocoumarin, 5 to 250 ng mL-1 kaurenoic acid and 25 to 500 ng mL-1 for syringaldehyde and o-coumaric acid. The range of recovery was 95.3 to 103.8% with a RSD < 6.3% for intra-day and inter-day precision. These methods are presented as an alternative for the quality control of pharmaceutical preparations containing guaco

Applying liquid chromatography-tandem mass spectrometry to assess endodontic sealer microleakage

The objective of this study was to describe a new method for the quantitative analysis of a microleakage of endodontic filling materials. Forty extracted single-rooted teeth were randomly divided into three experimental groups. After root canal shaping, the experimental groups were filled using the lateral condensation technique with the Epiphany system (G1), with gutta-percha + Sealapex (G2), and with gutta-percha + AH Plus (G3). Each root was mounted on a modified leakage testing device, and caffeine solution was used as a tracer (2000 ng mL-1, pH 6.0), applied in the coronal direction towards the tooth apex, creating a hydrostatic pressure of 2.55 kPa. Presence of caffeine in the receiving solution was measured after 10, 30, and 60 days, using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). None of the groups presented microleakage at 10 days. At 30 days, G2 and G3 showed similar infiltration patterns (means: 16.0 and 13.9 ng mL-1, respectively), whereas G1 showed significantly higher values (mean: 105.2 ng mL-1). At 60 days, leakage values were 182.6 ng mL-1for G1, 139.0 ng mL-1 for G2, and 53.5 ng mL-1 for G3. AH Plus showed the best sealing ability and HPLC-MS/MS showed high sensitivity and specificity for tracer quantification

New Metabolites of Coumarin Detected in Human Urine Using Ultra Performance Liquid Chromatography/Quadrupole-Time-of-Flight Tandem Mass Spectrometry

Coumarin (1,2-benzopyrone) is a natural compound whose metabolism in humans was established in the 1970s. However, a new metabolite was recently identified in human plasma, indicating that the metabolism of coumarin has not been completely elucidated. To complement the knowledge of its metabolism, a rapid and sensitive method using UPLC-QTOF-MS was developed. A total of 12 metabolites was identified using MetaboLynxTM software, including eight metabolites not previously reported in human urine. The identified biotransformation included hydroxylation, glucuronidation, sulfation, methylation, and conjugation with N-acetylcysteine. The present work demonstrates that the metabolism study of coumarin was incomplete, possibly due to limitations of old techniques. The identification of eight inedited metabolites of such a simple molecule suggests that the information regarding the metabolism of other drugs may also be incomplete, and therefore, new investigations are necessary

Temporal profile of (A) coumarin, (B) 7-hydroxicoumarin and (C) <i>o</i>-coumaric acid plasma concentrations in human volunteers receiving oral administration of 60 mL of guaco syrup spiked with different amounts of coumarin.

<p>Temporal profile of (A) coumarin, (B) 7-hydroxicoumarin and (C) <i>o</i>-coumaric acid plasma concentrations in human volunteers receiving oral administration of 60 mL of guaco syrup spiked with different amounts of coumarin.</p

Temporal profile of the mean plasma concentrations of coumarin, 7-hydroxycoumarin and o-coumaric acid in human volunteers receiving oral administration of 60 mL of guaco syrup spiked with 1500 mg of coumarin.

<p>Temporal profile of the mean plasma concentrations of coumarin, 7-hydroxycoumarin and o-coumaric acid in human volunteers receiving oral administration of 60 mL of guaco syrup spiked with 1500 mg of coumarin.</p