TESTE DE ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) PARA IMUNODIAGNÓSTICO DA CISTICERCOSE BOVINA

A primeira etapa do trabalho consta de uma revisão de literatura da ciclozoonose teníase e cisticercose. Foi avaliado o comportamento imunológico de bovinos experimentalmente infectados com ovos de Taenia saginata através da cinética de produção de anticorpos anti- Cysticercus bovis. Três bezerros de 6,5 meses e um com 19 meses de idade foram infectados, por via oral, com 2 x 104 ovos de Taenia saginata. Um quinto bezerro serviu como testemunha. Após 90 a 111 dias da infecção, os animais foram abatidos. Fez-se inspeção por fatiamento de órgãos e musculatura esquelética com intervalo entre os cortes de, no máximo, cinco milímetros. Dos quatros bezerros desafiados foram recuperados 702 cisticercos sendo 570 (81,20%) vivos e 132 (18,80%) degenerados. A taxa de recuperação foi de 0,01% a 1,43% com média de 0,88%. Os 702 cisticercos encontrados apresentaram a seguinte distribuição anatômica: músculos hióideos 02 (0,28%), rins 03 (0,43%), língua 07 (1,00%), fígado 12 (1,71%), pulmões 15 (2,14%), diafragma 18 (2,56%), músculos da mastigação 25 (3,56%), coração 49 (6,98%), musculatura dianteira 323 (46,00%) e musculatura traseira 248 (35,33%). Foi padronizado o teste de ELISA indireto para pesquisa de anticorpos anti- Cysticercus bovis em bovinos, utilizando como antígeno o extrato salino parcial de Cysticercus cellulosae. O cut-off foi obtido com soro de 99 bovinos jovens considerados não portadores de cisticercos, ficou estabelecido como 0,310. Nos bovinos, experimentalmente infectados, foram pesquisados o desenvolvimento e a quantificação de anticorpos anti-Cysticercus bovis através da prova de ELISA indireta em 16 amostras de soros de cada animal. A primeira amostra foi colhida 97 dias antes da infecção dos animais, a segunda no dia da infecção experimental e as restantes, semanalmente, até o abate. Os anticorpos foram detectados a partir de 12 dias após a infecção, com pico inicial aos 27 dias. O ápice de reação, em todos os animais, ocorreu entre 41 e 55 dias depois da infecção. Em seguida, observou-se um lento declínio com um segundo pico de anticorpos, de menor intensidade, a partir de 75 dias. Através da prova ELISA foi comparada a reatividade dos antígenos extrato salino parcial de Cysticercus cellulosae, extrato salino total de Cysticercus bovis e antígeno total de Cysticercus longicollis com soros de bovinos portadores de cisticercos da Taenia saginata. Pesquisou-se também anticorpos anti-Cysticercus bovis, em soros de bovinos considerados como não portadores de cisticercos, pelo serviço de inspeção. De 20 amostras de soros analisadas, 2 (10%) apresentaram valores de absorbância acima do cut-off. Estes animais seriam possíveis portadores de cisticercos

PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA Cysticercus bovis, POR TESTE ELISA EM BOVINOS DE ABATEDOURO

Com o objetivo de padronizar e avaliar a campo um teste sorológico para diagnóstico de cisticercose em bovinos foram examinados 812 animais procedentes de 139 municípios do Estado do Paraná, a maioria bovinos azebuados, machos e fêmeas, de grupo etário variando de 18 meses a 60 meses. Os animais foram devidamente identificados e abatidos em frigorífico comercial na região metropolitana de Curitiba. Dos animais que apresentaram cistos durante a Inspeção post-mortem foi colhida amostra de sangue, as quais foram submetidas ao teste ELISA para pesquisa de anticorpos contra-Cysticercus bovis. O coeficiente de sensibilidade para o teste ELISA foi de 83,6% e o Coeficiente de Especificidade foi de 92,8%.  Portanto, o teste sorológico (ELISA) foi mais sensível do que o exame póst-mortem, pois este deixou de detectar 06 carcaças com infecção leve por cisticercose (VPP 99,7% - ELISA).In order to standardize a serological test for diagnosing cysticercosis in bovine cattle, 812 animals have been tested, most of them halfblooded zebu cattle, males and females, from age groups ranging from 18 months to 60 months. The animals were properly identified and slaughtered in a slaughterhouse - Frigorífico Argus Ltd., SIF 1710, located in São José dos Pinhais, in the Metropolitan Region of Curitiba – PR- Brazil. The animals had come from 139 municipalities in the State of Parana. From the animals that presented cysts during the post-mortem inspection, blood samples were also collected and submitted to the ELISA test for antibodies against cysticercosis. The Sensitivity Coefficient in the ELISA test was 83.62%, and the Specificity Coefficient was 92.85%. Therefore, the ELISA test proved to be more sensitive than the post-mortem examination, because the latter failed to detect 06 carcasses with mild infection with cysticercosis PPV 99.71% (ELISA)

In silico and in vitro Evaluation of Mimetic Peptides as Potential Antigen Candidates for Prophylaxis of Leishmaniosis

Antigen formulation is the main feature for the success of leishmaniosis diagnosis and vaccination, since the disease is caused by different parasite species that display particularities which determine their pathogenicity and virulence. It is desirable that the antigens are recognized by different antibodies and are immunogenic for almost all Leishmania species. To overcome this problem, we selected six potentially immunogenic peptides derived from Leishmania histones and parasite membrane molecules obtained by phage display or spot synthesis and entrapped in liposome structures.We used these peptides to immunize New Zealand rabbits and determine the immunogenic capacity of the chimeric antigen. The peptides induced the production of antibodies as a humoral immune response against L. braziliensis or L. infantum. Next, to evaluate the innate response to induce cellular activation, macrophages from the peptide mix-immunized rabbits were infected in vitro with L. braziliensis or L. infantum. The peptidemix generated the IFN-g, IL-12, IL-4 and TGF-b that led to Th1 and Th2 cellular immune responses. Interestingly, this mix of peptides also induced high expression of iNOS. These results suggest that themix of peptides derived fromhistone and parasitesmembranemolecules was able to mimic parasites proteins and induce cytokines important to CD4+ T cell Th1 and Th2 differentiation and effector molecule to control the parasite infection. Finally, this peptide induced an immune balance that is important to prevent immunopathological disorders, inflammatory reactions, and control the parasite infection.Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriale

A influência de diferentes grupos de soros-controle no diagnóstico da Cisticercose bovina pelo teste Elisa

Ensaios do teste Elisa foram desenvolvidos para a análise de amostras de soros de bovinos. As amostras foram constituídas de 80 soros-controle de bovinos com cisticercose, entre natural discreta e experimental maciça, sendo 60 negativos para a doença e dez positivos para outras patologias. Utilizaram-se os antígenos totais de Taenia solium e de T. crassiceps na determinação de anticorpos contra cisticercose. O referido teste revelou deficiências no diag- nóstico de animais destinados ao abate, em virtude de sua baixa sensibilidade, quando se consideraram soros de bovinos com infecção natural discreta, a mais freqüente em matadouros. No entanto, no caso de animais infectados experimentalmente, a sensibilidade aumentou. O teste ainda pode ser considerado útil na diferenciação entre a cisticercose e outras doenças, devido às suas elevadas taxas de especificidade, 81,4% a 100%, sempre alcançando o valor máximo quando os soros-controle negativos eram procedentes de animais confinados. A escolha de soros- controle para o cálculo do ponto de corte interferiu no desempenho do teste Elisa. Quando o ponto de corte envol- vendo os soros de animais confinados foi a referência para o diagnóstico da cisticercose, os valores de sensibilidade foram bastante elevados, chegando a 90%. Porém, quando o ponto de corte considerado na avaliação foi calculado a partir de todos os soros-controle negativos (situação não controlada), observou-se uma queda na capacidade do teste em identificar os verdadeiros positivos. Conclui-se que é de grande importância a seleção de soros-controle na interpretação dos resultados do teste Elisa e no estabelecimento do seu ponto de corte, visando assegurar a sua eficácia no diagnóstico da cisticercose bovina.An Elisa assay was carried out to analize bovine serum samples. The samples were constituted by 80 sera from bovine with cysticercosis, either naturally and experimentally infected, 60 samples which were negative for cysticercosis, and 10 which were positive for other pathologies. Taenia solium and Taenia crassiceps total antigens were used in the anti-cysticercosis antibody determinations. The test displayed low sensitivity and was deficient for the diagnosis of animals destined to the slaughterhouse, which often presents subclinical infections. However,for experimentally infected animals, sensitivity was considerably improved. The test can still be considered useful for the differentiation between cysticercosis and other diseases, due to its high specificity rate, from 81.4 to 100%, specially

Resposta imune-humoral e celular em bovinos da raça Nelore imunizados com extrato de larvas (L2 e L3) de Dermatobia hominis (Linnaeus Jr., 1781) Immune humoral and cellular response of nelore bovines immunized with larvae extract (L2 and L3) of Dermatobia hominis (Linnaeus Jr., 1781)

As larvas da Dermatobia hominis provocam lesões ulcerativas, danificando o tecido subcutâneo e conseqüentemente a pele do hospedeiro. O couro é o subproduto que sofre maior depreciação, o que, muitas vezes, impossibilita seu aproveitamento na industrialização. Atualmente o controle químico é utilizado como forma de combate à dermatobiose, entretanto, leva ao acúmulo de substâncias tóxicas nos animais e no ambiente. No presente trabalho, foram avaliadas as respostas imune-humoral e celular de bovinos imunizados com extrato antigênico preparado com larvas de D. hominis. Três grupos de oito bezerras da raça Nelore com 10 meses de idade foram usados, tendo o primeiro grupo (A) recebido aplicação de extrato imunogênico de larvas de D. hominis, com intervalos de quinze dias; o grupo (B), utilizado como controle, não recebendo nenhum tipo de tratamento; e o grupo (C) recebendo o tratamento ectoparasiticida à base de Dichlorvos associado a Cypermetrina. Neste mesmo período, foram avaliados o leucograma e os níveis de IgG contra D. hominis pela técnica de enzimoimunoensaio-ELISA. Quanto à avaliação da imunidade humoral, verificou-se que os animais do grupo A apresentaram maior produção de IgG contra D. hominis, com níveis máximos de anticorpos circulantes aos 45 dias após a primeira imunização. Estes animais também apresentaram maior produção de neutrófilos, eosinófilos e monócitos que os dos grupos B e C. O número de nódulos de larvas encontrado nos animais do grupo C foi 148,3% maior que nos animais dos grupos A e B. A comprovação da resposta imune celular e humoral, parcialmente caracterizadas, bem como a redução do número de nódulos, são indicadores que a imunização contra D. hominis foi parcialmente protetora para os bovinos imunizados.Dermatobia hominis larvae cause ulcerative lesions and damage to subcutaneous tissue and skin of the host. Leather is the subproduct which undergoes major depreciation, making it difficult to industrial use. Nowadays, the chemical control is utilized against dermatobiosis, therefore it leads to rising toxic chemicals in the animals and environment. The immunological challenge with D. hominis larval extract may represent an important altervative for this parasitosis control. Humoral and cellular immune responses were tested in bovine using an antigenic extract prepared with D. hominis larvae. Three groups of 10 months old Nelore females were used. The first group (A) received immunogenic larval extract of D. hominis with fifteen-days interval between injections; the group (B) was the control and has not received any sort of treatment; and the group (C) received an ectoparasitecide treatment based on Dichlorvos associated to Cypermetrina. Aditionally, leucogram and levels of IgG against D. hominis by immunoassay technique were evaluated. As for the humoral immunity, animals from group A presented higher IgG production against D. hominis with maximum levels of circulating antibodies at the 45th day after the first injection. These animals also showed higher production of neutrophils, eosinophils and monocytes than those from groups B and C. The number of D. hominis larvae nodules observed in animals from the group C was 148.3% larger than those from group A and B. The evidence concerning both cellular and humoral immune responses as well as the reduction on nodules number are an indication that the immunization against D. hominis was partially protective for the immunized bovines

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for imunodiagnostic of bovine cysticercosis and kinetics of antibodies production against-Cysticercus bovis

Um teste de ELISA indireto (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) foi desenvolvido para pesquisa de anticorpos contra-C. bovis em bovinos experimental e naturalmente infectados. Foram estudados três antígenos: antígeno parcial de C. cellulosae, antígeno total de C. bovis e antígeno total de C. longicollis. Na padronização do ELISA foram analisadas as seguintes combinações: antígeno 250 e 500ng de proteína/cavidade, diluição dos soros 50, 100, 200 e 400 vezes, diluição do conjugado (IgG de cabra anti-IgG bovina conjugada com peroxidase) 400 e 800 vezes. do cruzamento das condições acima resultou a seguinte padronização: antígeno 250ng/cavidade, soro e conjugado diluídos 100 e 400 vezes, respectivamente. O nível de corte (cut-off) da reação entre animais reagentes e não reagentes foi determinado pela média das densidades óticas de 54 soros negativos acrescidas de três desvio-padrão, resultando no valor de 0,303. Através da prova ELISA foram comparadas as reatividades dos antígenos parcial de C. cellulosae, total de C. bovis e total de C. longicollis com soros de bovinos portadores de cisticercose, empregando as diluições de soros e de conjugados padronizados anteriormente. O antígeno de C. bovis mostrou alta correlação com o teste padronizado com C. cellulosae. Entretanto, os valores de absorbância foram sensivelmente menores. Com C. longicollis observou-se reatividade bastante baixa, porém aumentando-se a quantidade de antígeno, até 3000ng/cavidade, houve um aumento proporcional da resposta. Após a padronização do teste foi analisado o comportamento imunológico de bezerros infectados experimentalmente com ovos de Taenia saginata. Dez bezerros foram infetados oralmente com 2 x 104 ovos de T. saginata. Seis bezerros não infetados foram usados como controle. Treze amostras de soro de cada animal foram analisadas. A primeira foi colhida no dia da infecção e o restante, quinzenalmente até o abate. A produção máxima de anticorpos foi observada entre 30 e 60 dias pós-infecção. Depois de 90 dias da infecção os animais foram sacrificados e o número de cistos contados e comparados com a resposta imunológica dos animais. Com o teste padronizado pesquisou-se anticorpos contra-C. bovis, em soros de bovinos considerados não portadores de cisticercos pelo serviço de inspeção e, de 20 amostras de soros analisadas, duas apresentaram valores de absorbância acima do cut-off indicando serem portadores de cisticercos .An indirect ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) was developed for searching of antibodies against-Cysticercus bovis in bovine. Three antigens were studied: partial antigen of C. cellulosae, total antigen of C. bovis, and total antigen of C. longicollis. In the standardization of the ELISA the following combinations were analyzed: antigen 250 and 500 ng of protein/well, dilution of the sera 50, 100, 200, and 400 times, dilution of the conjugated (anti bovine -IgG conjugated IgG of goat with peroxidase) 400 and 800 times. The crossing of the conditions above resulted in the following standardization: antigen 250 ng/well, sera and conjugated diluted 100 and 400 times respectively. The reaction cut-off between reagents and non-reagents animals was determined by the average of the optic densities of 54 negative sera plus three standard deviation resulting in the value of 0,303. The reactivity of the three antigens used in the ELISA test was compared using sera from experimentally infected calves, using sera dilutions and conjugated standardized previously. Using the antigen of C. bovis was verified high correlation with the test standardized with C. cellulosae. However, the absorbance values were significantly smaller. With C. longicollis was observed low reactivity, but increasing the amount of antigen, up to 3000ng/well, there was a proportional increase of the response. The kinetics of antibodies anti-C. bovis production was studied in ten calves experimentally infected with 2 x 104 T. saginata eggs. Six non-infected calves were used as control. After 90 days from the infection date, the animals were killed. Thirteen samples of sera of each animal were analyzed. The first was picked in the day of the infection and the remaining at each 15 days. The maximum production of antibody was observed between 30 and 60 days post infection. With the standardized test it was detected antibodies against-C. bovis, in 2 from 20 cattle considerated as non-holder of cyst by the inspection service. These animals could be considered possible cyst holders

New strategy to improve quality control of Montenegro skin test at the production level

International audienceIntroduction: The production of the Montenegro antigen for skin test poses difficulties regarding quality control. Here, we propose that certain animal models reproducing a similar immune response to humans may be used in the quality control of Montenegro antigen production.Methods: Fifteen Cavia porcellus (guinea pigs) were immunized with Leishmania amazonensis or Leishmania braziliensis, and, after 30 days, they were skin tested with standard Montenegro antigen. To validate C. porcellus as an animal model for skin tests, eighteen Mesocricetus auratus (hamsters) were infected with L. amazonensis or L. braziliensis, and, after 45 days, they were skin tested with standard Montenegro antigen.Results: Cavia porcellus immunized with L. amazonensis or L. braziliensis, and hamsters infected with the same species presented induration reactions when skin tested with standard Montenegro antigen 48-72h after the test.Conclusions: The comparison between immunization methods and immune response from the two animal species validated C. porcellus as a good model for Montenegro skin test, and the model showed strong potential as an in vivo model in the quality control of the production of Montenegro antigen

Experimental bovine infection with Taenia saginata eggs: recovery rates and cysticerci location

Studies were carried out on the recovery rate and cysticerci location in bovines experimentally infected with Taenia saginata eggs. Three calves of 6.5 months and one with 19 months of age were infected orally with 2 x 10(4) eggs of Taenia saginata. A fifth calf served as control. After 90 days of infection, the animals were slaughtered and organs and skeletal muscles were inspected using a slicing technique every 5 mm. From the four infected calves, 702 cysticerci were recovered, of which 570 (81.2%) were alive and 132 (18.8%) were degenerated. The recovery rate ranged from 0.01 to 1.43% with an average of 0.88%. The cysticerci presented the following anatomical distribution: hioideos muscles 02 (0.28%), kidneys 03 (0.43%), tongue 07 (1.00%), liver 12 (1.71%), lungs 15 (2.14%), diaphragm 18 (2.56%), mastication muscles 25 (3.56%), heart 49 (6.98%), anterior muscle 323 (46.00%) and posterior muscle 248 (35.33%)