Marine Mammal Brucella Reference Strains Are Attenuated in a BALB/c Mouse Model

Brucellosis is a zoonosis of worldwide distribution with numerous animal host species. Since the novel isolation of Brucella spp. from marine mammals in 1994 the bacteria have been isolated from various marine mammal hosts. The marine mammal reference strains Brucella pinnipedialis 12890 (harbour seal, Phoca vitulina) and Brucella ceti 12891 (harbour porpoise, Phocoena phocoena) were included in genus Brucella in 2007, however, their pathogenicity in the mouse model is pending. Herein this is evaluated in BALB/c mice with Brucella suis 1330 as a control. Both marine mammal strains were attenuated, however, B. ceti was present at higher levels than B. pinnipedialis in blood, spleen and liver throughout the infection, in addition B. suis and B. ceti were isolated from brains and faeces at times with high levels of bacteraemia. In B. suis-infected mice serum cytokines peaked at day 7. In B. pinnipedialis-infected mice, levels were similar, but peaked predominantly at day 3 and an earlier peak in spleen weight likewise implied an earlier response. The inflammatory response induced pathology in the spleen and liver. In B. ceti-infected mice, most serum cytokine levels were comparable to those in uninfected mice, consistent with a limited inflammatory response, which also was indicated by restricted spleen and liver pathology. Specific immune responses against all three strains were detected in vitro after stimulation of splenocytes from infected mice with the homologous heat-killed brucellae. Antibody responses in vivo were also induced by the three brucellae. The immunological pattern of B. ceti in combination with persistence in organs and limited pathology has heretofore not been described for other brucellae. These two marine mammal wildtype strains show an attenuated pattern in BALB/c mice only previously described for Brucella neotomea.This work was supported by the grants RTA 2013-00065-C02-01 from The National Institute for Agricultural and Food Research and Technology (INIA) and agrifood research in Spain (MPJdB) and SAF2014-54763-C2 from the European Social Fund (JP). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.Publishe

Experimental Challenge of Atlantic Cod (Gadus morhua) with a Brucella pinnipedialis Strain from Hooded Seal (Cystophora cristata)

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Informe del proyecto Nuevas especies de brucella: nuevas estrategias para el control y el diagnóstico de la brucelosis animal. análisis de virulencia, respuesta inmune y desarrollo de vacunas y biomarcadores (RTA2013-00065-C02-01)

La consecución de este proyecto ha permitido que se haya descrito por primera vez la virulencia y patogenicidad de diversas cepas de Brucella de reciente descripción, como las cepas de origen marino y las cepas de Brucella de origen anfibio en un modelo murino. La puesta a punto de modelos de experimentación animal en brucelosis es fundamental para estudios subsecuentes de aspectos concernientes a la virulencia o patogenicidad de dichas cepas, considerándose, por tanto, una herramienta necesaria e imprescindible en el estudio de la brucelosis. El análisis de la virulencia de las cepas estudiadas en este proyecto ha servido como base científico- técnica para plantear desarrollo de nuevas vacunas para la brucelosis basadas en el uso de las nuevas cepas de Brucella.Ministerio de Economía y Competitividad y Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA

Detección mediante PCR-dúplex a tiempo real y aislamiento de virus RHDV2/b durante un brote de enteropatía mucoide (póster)

El presente trabajo describe la detección mediante PCR-dúplex a tiempo real de virus RHDV2/b en muestras de duodeno, bazo y timo de un conejo de cebo de 50 días de edad muerto durante un brote de enteropatía mucoide. El brote tuvo una duración de 31 días afectando a animales con edades comprendidas entre los 42 y los 72 días, produciendo 1113 bajas (17,5%) del total de animales en cebo. En ningún momento, a lo largo de la evolución del brote, se detectaron signos típicos de mortalidad por enfermedad hemorrágica (RHD). Para confirmar la infecciosidad del virus y utilizando un inóculo purificado preparado a partir de las muestras analizadas, se infectó por vía intramuscular a un conejo susceptible a la enfermedad el cual murió tras desarrollar un cuadro agudo de RHD. A partir de una muestra de hígado de este conejo infectado se procedió a caracterizar el virus implicado mediante la secuenciación del gen que codifica para la proteína VP60, confirmando su pertenencia a la variante RHDV2/b. Este hallazgo sugiere la posibilidad de que el virus RHDV2/b pueda circular de forma silente sin causar brotes aparentes de RHDPublishe

Duplex real time PCR detection of rabbit haemorrhagic disease virus genotypes RHDV and RHDV2

La enfermedad hemorrágica (RHD) es uno de los principales factores de mortalidad del conejo silvestre en la península ibérica. Desde su aparición a finales de los años 80 el agente etiológico predominante han sido cepas víricas pertenecientes a un único genogrupo (RHDV). Sin embargo, en 2011 se detectó, inicialmente en el tercio norte de España, una nueva variante vlrica (RHDV2) que cursó de forma atlpica, modificando la epidemiologla de la enfermedad y afectando a animales con menos de 30 días de edad. Entre los años 2009 y 2016 se ha estudiado la epidemiologia de la RHD en cuatro poblaciones experimentales de conejo silvestre mediante captura-recaptura, encontrándose en 2011 el primer aislado de RHDV2 en estas poblaciones (Calvete et al., 2014). Debido a la necesidad de llevar a cabo un diagnóstico rápido y sensible de las dos variantes y estudiar la epidemiologia de la enfermedad antes y después de la aparición del RHDV2, se presenta en este trabajo la puesta a punto de un protocolo que permite identificar los dos genotipos de la enfermedad (RHDV y RHDV2) mediante PCR dúplex a tiempo real (qPCRdúplex).RHDV2 genotypes of the rabbit haemorrhagic disease (RHD) in the sama assay. The primers and probes target sequences are conserved in all samples analysed showing 100% sensitivity and specificity, being all RHDV or RHDV2 isolates correctly genotyped by duplex-qPCR according to their sequence data. Standardisation was performed using standard curves. Efficiencies ranged from 2.01-2.04 and 1.96-1.98 for the RHDV and RHDV2 genotypes, respectively, and correlation of 0.99 for both genotypes reflecting a good linearity of the standard curve. High repeatability and reproducibility of the assay was found with very low variation, with CV lower than 1.89 and 1.21% for RHDV and RHDV2, respectively. The sensitivity of detection was higher far the duplex-qPCR assay than a direct ELISA assay.Estos resultados derivan del desarrollo de los proyectos de l+D "INMUNE 8011" e "INMUNIZADOS 1316" realizados en el marco de un convenio de colaboración entre el CITA y TRAGSATEC, así como del proyecto E-RTA2014-00009-00-00 del INIA.Publishe

Aromatic amino acid biosynthesis is dispensable for intramacrophagic growth of Brucella suis, despite attenuation of an aroC mutant

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