On the possible role of ERK, p38 and CaMKII in the regulation of CGRP expression in morphine-tolerant rats

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>The neuropeptide, calcitonin gene-related peptide (CGRP) has been proposed to be a regulator of the development of morphine analgesic tolerance and thereby could be a target to reduce the induction of this phenomenon under clinical conditions. However, the mechanisms of CGRP regulation are unclear. We investigated here the possible role of the extracellular signal-regulated protein kinase (ERK), p38 and calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) in CGRP regulation following chronic morphine treatment.</p> <p>Results</p> <p>A 7-day treatment with morphine (15 μg/day) led to an increase in CGRP contents in the spinal cord dorsal horn (SCDH) and dorsal root ganglion (DRG) and this effect was prevented by the inhibition of the ERK, p38 or CaMKII pathway. The phosphorylation/activation of ERK, p38 and CaMKII was enhanced in the SCDH following chronic morphine while in DRG only the phosphorylation of CaMKII was increased. Moreover, our chronic morphine treatment up-regulated neuronal nitric oxide synthase (nNOS) levels in the SCDH, an effect blocked by the inhibition of the ERK, p38 or CaMKII pathway. The blockade of nNOS activity also suppressed chronic morphine-induced CGRP increases in the DRG and SCDH. Double immunofluorescence studies revealed that nNOS and CaMKII are co-localized in the SCDH and that CaMKII is activated in CGRP-expressing DRG neurons.</p> <p>Conclusions</p> <p>The activation of spinal ERK, p38 and CaMKII, alongside nNOS, is involved in chronic morphine-induced CGRP up-regulation in both the DRG and SCDH. Moreover, the stimulation of CaMKII in the DRG likely directly regulates the expression of CGRP associated with morphine analgesic tolerance.</p

Effet du jeûne, de la pentagastrine et du facteur de croissance épidermique (EGF) sur le comportement biochimique et l'aspect morphologique de la muqueuse intestinale de souris adulte in vivo et in vitro

Au cours de ce travail, le métabolisme de la muqueuse intestinale de la souris adulte a été étudiée à différents points de vue. Dans des conditions de culture normale, la préservation morphologique des explants duodénaux et jéjunaux est excellente à 24 heures et reste satisfaisante à 48 heures de culture. Du point de vue morphologique, la desquamation d'unités de la membrane apicale de cellules absorbantes de la villosité a été observée tant au niveau du duodénum que du jéjunum, au cours des 48 heures de culture. Nous montrons que la synthèse protéique et la synthèse d'ADN sont des fonctions préservées durant 48 heures, en culture organotypique jéjunale. Biochimiquement, le duodénum et le jéjunum en culture possèdent des caractéristiques communes qui sont : 1) une stabilité du niveau des protéines totales durant 48 heures; 2) une réduction du contenu en ADN en fonction du temps; 3) des activités tissulaires totales supérieures aux valeurs tissulaires basales pour les disaccharidases, la glucoamylase et la phosphatase-alcaline; 4) une apparition crois sante de ces activités dans les milieux de culture en fonction du temps; 5) une dualité quant à la forme d'apparition de ces activités enzymatiques dans les milieux: la glucoamylase étant la plus soluble; et 6) un contenu enzymatique total de chaque enzyme supérieur à la valeur d'activité tissulaire basale. Cependant, le duodénum se distingue du jéjunum 1) par l'établissement d'une stabilité de l'activité tissulaire totale des enzymes entre 24 et 48 heures de culture, 2) par l'absence d'un enrichissement de la fraction particulaire du milieu de culture en enzymes membranaires et 3) par un comportement différent du contenu enzymatique total de la glucoamylase et de la phosphatase alcaline. Trois principaux faits ressortent de l'étude biochimique détaillée de la culture organotypique jéjunale; 1) une évolution différente des niveaux tissulaires d'enzymes de la membrane de la bordure en brosse (MBB) intestinale et une accentuation de ces différences en fonction du temps; 2) une augmentation constante de ces activités enzymatiques dans les milieux de culture en fonction du temps, quoique les taux d'apparition diffèrent d'une enzyme è l'autre; et 3) une cinétique d'accumulation différente entre les enzymes au cours des 48 heures de culture. Dans un deuxième temps, nous avons abordé l'effet du jeûne sur l'intestin de la souris adulte. Tant au niveau de l'intestin entier que du duodénum distal et du jéjunum proximal, un jeûne de 24 ou 48 heures ne provoque aucune altération du niveau des protéines totales, du contenu en ADN, mais amène une hausse des activités des disaccharidases et de la glucoamylase. De plus, le jeûne n'altère pas l'activité spécifique de l'ADN du duodénum et du jéjunum. Cette hausse des diverses activités enzymatiques observées lors du jeûne in vivo, et in vitro peut être attribuable à un ralentissement ou à un arrêt de la dégradation de ces glycoprotéines enzymatiques à cause d'une libération moindre d'agents solubilisants se retrouvant dans les sécrétions biliopancréatiques, in vivo, et à leur absence dans les milieux de culture. En outre, l'apparition d'activités enzymatiques de la MBB intestinale dans les milieux de culture semble résulter de trois phénomènes distincts; 1) la desquamation cellulaire et 2) la desquamation d'unités de la membrane apicale des cellules épithéliales absorbantes, les deux constituant la fraction particulaire du milieu, et 3) l'apparition de ces activités sous une forme soluble dont le processus reste à déterminer. Nous avons enfin analysé l'action de deux facteurs trophiques. L'administration exogène de pentagastrine ne provoque aucune augmentation des contenus protéiques et en ADN, et de l'incorporation de thymidine tritiée dans l'ADN de la muqueuse fundique de l’estomac, et dans la muqueuse duodénale et jéjunale de souris adultes soumises è un jeûne hydrique. En outre, diverses concentrations de pentagastrine (0.5, 2.5 et 5.0 /µg/ml) ne provoque aucune modification des contenus protéiques et en ADN, des activités enzymatiques de la MBB intestinale, de la synthèse protéique et de la synthèse d'ADN, en culture organotypique de duodénum et de jéjunum. Ces résultats indiquent donc que la pentagastrine ne semble pas exercer une action trophique sur la muqueuse gastrointestinale de la souris adulte. L'administration exogène du facteur de croissance épidermique (EGF) ne modifie pas les contenus protéiques et en ADN et l'activité de diverses enzymes de la MBB du duodénum, du jéjunum et de l'iléon de souris adultes nourries ad libitum ou soumises à un jeûne hydrique. L'EGF ne stimule pas la synthèse d'ADN au niveau de l'intestin grêle de souris nourries. Par contre, ce polypeptide stimule la synthèse d'ADN au niveau de l'intestin grêle de souris soumises à un jeûne hydrique, au cours des 12 premières heures après l'administration. Toutefois, diverses concentrations d'EGF (10, 50, 100, 200 et 800 ng/ml) ne provoque aucune altération de ces mêmes paramètres, en culture organotypique de duodénum et de jéjunum. En conclusion, les résultats, obtenus jusqu'à présent, indiquent d'une part que l'administration exogène d'EGF n'exerce aucun effet stimulant sur la muqueuse de l'intestin grêle de souris nourries et d'un autre côté que la stimulation de la synthèse d'ADN notée au niveau de l'intestin grêle de souris soumises à un jeûne n'est probablement pas due à une action directe de l'EGF

Stimulation de la glucose-6-phosphatase au niveau de l'intestin de souris adulte in vitro par le fructose. Etudes morphologique, cytochimique et biochimique.

Des explants jéjunaux de souris adultes Swiss ICR ont été maintenus en culture organotypique selon la méthode préconisée par Ferland et Hugon. En microscopie électronique, on note une bonne préservation morphologique pendant 24 et 48 heures. En général, les cellules absorbantes villositaires conservent leur forme cylindrique. Les villosités connaissent une diminution de leur hauteur et un élargissement en fonction du temps. Au niveau ultrastructural, la morphologie est bien préservée durant les 24 premières heures de culture. A la trentième heure de culture, on note spécialement une augmentation du "terminal web" des cellules absorbantes villositaires. Une diminution de la hauteur des microvillosités de ces cellules s'observe après 48 heures de culture. Durant quarante-huit heures de culture, les contenus protéiques et en ADN ne sont pas modifiées

A proteomic approach to the identification of heterogeneous nuclear ribonucleoproteins as a new family of poly(ADP-ribose)-binding proteins.

A new class of poly(ADP-ribose) (pADPr)-binding proteins, heterogeneous nuclear ribonucleoproteins (hnRNPs), has been identified by a proteomic approach using matrix-assisted laser-desorption-ionization time-of-flight ('MALDI-TOF') MS. Liquid-phase isoelectric focusing with a Rotofor cell (Bio-Rad) allowed pre-fractionation of proteins extracted from HeLa cells. Rotofor protein fractions were further separated by SDS/PAGE and then transferred to a PVDF membrane. pADPr-binding proteins were analysed by autoradiography of the protein blot after incubation with (32)P-labelled automodified pADPr polymerase-1 (PARP-1). Peptide mass fingerprinting of selected bands identified the most abundant pADPr-binding proteins as hnRNPs, a family of proteins that bind pre-mRNA into functional complexes involved in mRNA maturation and transport to the cytoplasm. Sequence homology database searching against a previously reported pADPr-binding sequence motif revealed that the hnRNPs contain a putative pADPr-binding sequence pattern [Pleschke, Kleczkowska, Strohm and Althaus (2000) J. Biol. Chem. 275, 40974-40980]. pADPr-binding assays performed with synthetic peptides by the dot-blot technique and with nitrocellulose-transferred recombinant hnRNPs confirmed the pADPr-binding protein identification and the specificity of the interaction. These results could establish a link between increased levels of pADPr in DNA damaged cells and the modified protein expression pattern resulting from altered mRNA trafficking

Selection of the most environmentally benign ionic liquids option by coupling OECD standardized tests and fish leucocyte mortality

To reduce health and environmental risks of chemicals and to minimize the environmental footprint of human activities, green chemistry searches for alternative, environment-friendly reaction media and at the same time strives to increase reaction rates and milder reaction conditions. A growing area of research is devoted to ionic liquids (ILs) often termed as “designer” solvents due to the extreme tunability of sought functional properties. As the aftermath of earlier misleading messages reporting ILs generically as intrinsically “safe and risk free” whatever ILs considered, their increase in potential or emerging applications in key domains (like bio-refining, energy storage, nano-material processing, pollution remediation…) dictates a more scientifically-sound approach of actual risk profiles of ILs, including both physico-chemical, health and environmental risks that might be triggered by inadequate selection of use of ionic liquids. In this context, we proposed a advanced approach serving comprehensive evaluation of environmental hazard by combined use of OECD standardized tests (Daphnia magna acute immobilization test ; algal growth inhibition test) and fish ex vivo leucocyte mortality analysis. This innovative approach integrating multicriteria assessment has been tested to on a first set of seven imidazolium-based ([BMIM][Cl], [EMIM][Cl], [EMIM][DCA], [EMIM][MeSO3], [EMIM][EtOSO3], [EMIM][BF4], [HMIM][Cl]) and four phosphonium-based ionic liquids ([P6,6,6,14][Cl], [P6,6,6,14][DCA], [P6,6,6,14][(iC8)2PO2], [Pi4,i4,i4,1][TOS]) and is expected to be further used to examine other ILs (biobased, ILs, pyrrolidinium, …) in soon future. Results of ecotoxicity tests obtained so far have revealed a clear potential to rank clearly the families of ILs according to the studied risk and even to identify influencing structural factors within a same family of ILs and compounds within the same family. Complementarity of these tests and ecotoxic properties of IL will be discussed specifically in terms of ecological footprint reduction strategies in chemical engineering processes for successful IL utilization in the future

Synthesis and biological evaluation of enantiomerically pure cyclopropyl analogues of combretastatin A4

International audienceTo evaluate the influence of stereochemistry on biological activities of cis-cyclopropyl combretastatin A4 (CA4) analogues, we have prepared several cyclopropyl compounds in their pure enantiomeric forms. The key reactions in our synthesis are the cyclopropanation of a (Z)-alkenylboron compound bearing a chiral auxiliary, and the cross-coupling of both enantiomeric cyclopropyl trifluoroborate salts with aryl and olefinic halides. Three pairs of cis-cyclopropyl CA4 analogues were evaluated for their potential antivascular activities. The diarylcyclopropyl compounds with SR-configuration (-)-1b, (-)-2b and the cyclopropylvinyl enantiomer (+)-3a with RR-configuration were the most potent tubulin polymerization inhibitors. A correlation was noted between anti-tubulin activity and rounding up activity of endothelial cells. The cytotoxic activity on B16 melanoma cells was in the submicromolar range for most compounds, but unlike the anti-tubulin activity, there was no difference in cytotoxic activity between racemic and enantiomerically pure forms for the three series of compounds. Molecular docking studies within the colchicine binding site of tubulin were in good agreement with the tubulin polymerization inhibitory data and confirmed the importance of the configuration of the synthesized cis-cyclopropyl CA4 analogues for potential antivascular activities