S-Nitrosothiols modulate G protein-coupled receptor signaling in a reversible and highly receptor-specific manner

BACKGROUND: Recent studies indicate that the G protein-coupled receptor (GPCR) signaling machinery can serve as a direct target of reactive oxygen species, including nitric oxide (NO) and S-nitrosothiols (RSNOs). To gain a broader view into the way that receptor-dependent G protein activation – an early step in signal transduction – might be affected by RSNOs, we have studied several receptors coupling to the G(i )family of G proteins in their native cellular environment using the powerful functional approach of [(35)S]GTPγS autoradiography with brain cryostat sections in combination with classical G protein activation assays. RESULTS: We demonstrate that RSNOs, like S-nitrosoglutathione (GSNO) and S-nitrosocysteine (CysNO), can modulate GPCR signaling via reversible, thiol-sensitive mechanisms probably involving S-nitrosylation. RSNOs are capable of very targeted regulation, as they potentiate the signaling of some receptors (exemplified by the M2/M4 muscarinic cholinergic receptors), inhibit others (P2Y(12 )purinergic, LPA(1)lysophosphatidic acid, and cannabinoid CB(1 )receptors), but may only marginally affect signaling of others, such as adenosine A(1), μ-opioid, and opiate related receptors. Amplification of M2/M4 muscarinic responses is explained by an accelerated rate of guanine nucleotide exchange, as well as an increased number of high-affinity [(35)S]GTPγS binding sites available for the agonist-activated receptor. GSNO amplified human M4 receptor signaling also under heterologous expression in CHO cells, but the effect diminished with increasing constitutive receptor activity. RSNOs markedly inhibited P2Y(12 )receptor signaling in native tissues (rat brain and human platelets), but failed to affect human P2Y(12 )receptor signaling under heterologous expression in CHO cells, indicating that the native cellular signaling partners, rather than the P2Y(12 )receptor protein, act as a molecular target for this action. CONCLUSION: These in vitro studies show for the first time in a broader general context that RSNOs are capable of modulating GPCR signaling in a reversible and highly receptor-specific manner. Given that the enzymatic machinery responsible for endogenous NO production is located in close proximity with the GPCR signaling complex, especially with that for several receptors whose signaling is shown here to be modulated by exogenous RSNOs, our data suggest that GPCR signaling in vivo is likely to be subject to substantial, and highly receptor-specific modulation by NO-derived RSNOs

Talousmetsien luonnonhoidon kehitys vuosina 1995‒2018 luonnonhoidon laadun arvioinnin sekä valtakunnan metsien inventoinnin tulosten perusteella

Talousmetsien luonnonhoidon laatua on arvioitu vuodesta 1995 lähtien. Yksityismailla on arvioitu vuosittain keskimäärin noin 750 leimikkoa (vaihteluväli 350–1000 leimikkoa), joiden yhteispinta-ala on noin 2500 hehtaaria (1100–3900 ha). Tarkastettavat leimikot on valittu satunnaisotannalla tai suunnatulla otannalla metsänkäyttöilmoitusten perusteella. Valtakunnan metsien inventointiin (VMI) sisällytettiin talousmetsien luonnonhoitoon liittyviä tunnuksia, kuten avainbiotooppien määrä ja laatu sekä kuolleen puun tilavuus, VMI9:stä (1996‒2003) lähtien. Molemmat seurantajärjestelmät ovat tuottaneet aineistoja, joita analysoimalla voidaan saada tietoa luonnonhoidon keinojen käytöstä hakkuissa ja metsänuudistamisessa parin edellisen vuosikymmenen aikana. Tämän raportin tarkoituksena on dokumentoida luonnonhoidon laadun arvioinnin menetelmät ja siinä tapahtuneet muutokset sekä koota yhteen edellisen runsaan 20 vuoden seurantajakson tulokset ja esittää ne havainnollisina graafeina. Raportissa tarkastellaan luonnonhoidon laatua kuvaavien muuttujien keskiarvojen tilastollista luotettavuutta vuositasolla tai pidemmillä jaksoilla. Tavoitteena on selvittää, millaisia johtopäätöksiä luonnonhoidon laadun kehittymisestä aikasarjojen perusteella voidaan tehdä, sekä arvioida tarvittavaa otoskokoa siihen, että halutun suuruinen muutos tietyn muuttujan keskiarvoissa vuosien välillä voitaisiin havaita tilastollisesti merkitseväksi. Luonnonhoidon laadun arvioinnin aineiston aikasarjojen tarkastelussa keskityttiin pääasiassa osa-aineistoon vuosilta 1998–2018, jossa olivat mukana vain satunnaisella otannalla tarkastettavaksi valitut uudistushakkuut. Tämä osa-aineisto käsitti 71 % yksityismaiden arviointialasta. Keskeisiä tarkasteltavia muuttujia olivat luontokohteiden ja eri luontokohdeluokkien (luonnonsuojelulakikohteet, metsälakikohteet, sertifioinnin turvaamat kohteet sekä muut huomionarvoiset luontokohteet) pinta-alaosuus, luontokohteille säästetyn elävän ja kuolleen puuston tilavuus, luontokohteiden säilyminen sekä uudistushakkuiden elävän säästöpuuston ja kuolleen puuston määrä. Kaikille tarkasteltaville muuttujille laskettiin vuosittaiset keskiarvot sekä keskivirheet. Muuttujien keskiarvoista esitetään aikasarjagraafit, joihin on laskettu 95 %:n luottamusvälit. Tilastollisesti merkitseviä muutoksia keskiarvoissa tarkasteltiin sekä vertaamalla vuosittaisia tuloksia että testaamalla keskiarvojen eroja pidemmillä jaksoilla. Keskivirheiden avulla arvioitiin kullekin muuttujalle tarvittavaa otoskokoa, kun halutaan havaita esimerkiksi 20 %:n suuruinen muutos vuosien välillä tilastollisesti merkitseväksi. VMI-aineistoista laskettiin tietoja mm. metsälakikohteiden ja arvokkaiden kohteiden pinta-aloista, elävän säästöpuuston ja kuolleen puuston määristä hakkuilla sekä kuolleen puuston säilymisestä hakkuissa. Luontokohteiden keskimääräinen osuus koko tarkastelujaksolla on ollut 2,7 %. Tästä metsälakikohteiden osuus on ollut 0,7 %. Vuonna 2005 voimaan astuneen FSCS-sertifioinnin vaatimuksista poistettiin velvoite turvata tiettyjä luontokohteita, minkä seurauksena sertifioinnin turvaamien kohteiden osuus laski 0,6 %:sta 0,04 %:iin. Valtaosa näistä kohteista näytti siirtyneen muihin huomionarvoisiin luontokohteisiin, joiden keskimääräinen osuus on ollut 1,6 %. Muiden luontokohteiden osuudessa on kuitenkin viime vuosina ollut laskeva trendi, ja arviointijakson kolmen viimeisen vuoden aikana niiden osuus on ollut keskimäärin vain 0,6 %. Tulos viittaa siihen, että muita arvokkaita luontokohteita on jäänyt aiempaa enemmän huomiotta joko hakkuiden ja uudistamistöiden toteutuksessa tai luonnonhoidon laadun arvioinnissa. Tulos korostaa sitä, että luontokohteiden määrän ja osuuden säilymistä metsänkäsittelyssä on tarpeen jatkossakin seurata, jotta satunnaisvaihtelu pystytään erottamaan todellisista muutoksista. Muiden luontokohteiden osuuden lasku näkyy vastaavana laskuna myös luontokohteille säästetyn elävän ja kuolleen puuston määrissä. Säästöpuuston keskimääräinen tilavuus uudistushakkuilla on pysynyt melko tasaisena. Säästöpuuston tilavuus laski 2000-luvun alkuvuosista 2010-luvun alkuun. Viimeiset vuodet säästöpuumäärään on vaikuttanut PEFC-sertifioinnin muutos, jossa säästöpuiden jättämistä on alettu edellyttää jokaiselta leimikolta, ja säästöpuiden minimimäärä nostettiin 10 puuhun per hehtaari. Tämän jälkeen säästöpuiden kappalemäärä on hiukan kasvanut, mutta säästöpuiden puukohtainen keskitilavuus on laskenut. Säästöpuuvalinta on selvästi kohdentunut järeisiin lehtipuihin ja erityisesti haapaan, sillä nämä ovat säästöpuuryhmissä paremmin edustettuina kuin metsien puustossa keskimäärin. Haavan ja raidan osuus säästöpuustosta on noin 20 %, kun muun lehtipuuston kuin koivun osuus koko puustosta on vain vähän yli 3 %. Luonnonhoidon laadun seurannassa arvioitu tai mitattu uudistushakkuiden kuolleen puun määrä on mitä todennäköisimmin systemaattinen aliarvio. Keskitilavuuden arvio on vain 1 m3/ha, kun VMI:n tuottama arvio avohakkuualojen kuolleen puun keskitilavuudesta on lähes kuusinkertainen, vähän alle 6 m3/ha. Luonnonhoidon laadun seurannassa ei tosin mitata 10–20 cm läpimittaista kuollutta puuta toisin kuin VMI:ssa, mikä voi selittää osan tilavuuden erosta. Kuolleen puuston säilyminen hakkuissa on keskeinen luonnonhoidon laadun arvioinnissa seurattava muuttuja, joten jatkossa tulee pyrkiä sen mittaustarkkuuden parantamiseen. Luonnonhoidon laadun kokonaisarvio on ollut viime vuosina hyvä noin 70 %:ssa leimikoita, mikä tarkoittaa sitä, että luonnonhoito on ollut metsäsertifioinnin ja metsänhoitosuositusten mukaisella tasolla. Sellaisten leimikoiden, joissa luonnonhoidon taso on arvioitu erinomaiseksi, osuus on ollut parhaimmillaan 2000-luvulla noin 30 %, mutta on viime vuosina laskenut noin 15 %:n tasolle. Vastaavasti hyväksi tai välttäväksi arvioitujen leimikoiden osuus on kasvanut. Laadunarvioinnin tulosten valossa talousmetsien luonnonhoito on 20 vuoden aikana heijastellut sille lainsäädännössä ja sertifioinnissa asetettuja kriteereitä. Jos kriteereissä ei ole tapahtunut merkittäviä muutoksia, myös toteutus on pysynyt suunnilleen samalla tasolla. Missään seurattavissa muuttujissa ei ole tapahtunut dramaattisia muutoksia. Toisaalta luonnonhoidon taso ei suosituksista ja neuvonnasta huolimatta ole 2000-luvun alusta lähtien parantunut, vaan taso on päinvastoin laskenut 2010-luvulla. Tarkastelujakson viimeisten viiden vuoden (2014–2018) aikana luonnonhoidon taso on määrällisissä muuttujissa keskimäärin noin 20 % heikompi kuin mitä se oli 2000-luvulla, ja lähes 30 % heikompi kuin mitä se on ollut parhaalla viisivuotisjaksolla aikavälillä 1998–2009. Luonnonhoidon laadun nykyinen otoskoko, noin 350 leimikkoa vuodessa, riittää säästöpuuston sekä kohtuullisella luotettavuudella uudistushakkuiden kuolleen puuston muutosten seurantaan. Luontokohteiden osuuksien arvioimiseen ja seurantaan tarvitaan huomattavasti suurempia, suuruusluokkaa 1000–5000 olevia otoskokoja. Yleisesti ottaen suuri otoskoko tarvitaan sellaisten muuttujien luotettavaan seurantaan, joiden arvoissa on paljon leimikoiden välistä satunnaista vaihtelua, kuten esimerkiksi metsälakikohteiden osuus. Vastaavasti pienempi otoskoko tarvitaan sellaisten muuttujien seurantaan, joiden arvot vaihtelevat vähemmän leimikoiden välillä, kuten esimerkiksi säästöpuuston tilavuus uudistushakkuilla. Muuttujan keskiarvon tilastollisesti merkitsevän pienenemisen havaitsemiseen vaaditaan aina pienempi otoskoko kuin vastaavan suuruisen keskiarvon kasvun havaitsemiseen. Luonnonhoidon laadun seurannassa tullaan jatkossa siirtymään yhä enemmän digitaalisten aineistojen hyödyntämiseen, kuten satelliittikuvien ja drone-kuvauksen käyttöön. Tämä tulee sekä parantamaan useiden seurattavien muuttujien (mm. elävä säästöpuusto, kuollut puu hakkuilla) mittauksen tarkkuutta että alentamaan seurannan kustannuksia. Jatkossa on mittausmenetelmien kehittämisen lisäksi syytä kiinnittää enemmän huomiota myös siihen, että otoskoko on seurannan tarpeisiin riittävä. Riittävä otoskoko riippuu siitä 1) mitä muuttujia halutaan seurata, 2) mitkä ovat niiden keskiarvot ja keskivirheet aineistossa, 3) kuinka suuria muutoksia halutaan luotettavasti pystyä todentamaan ja 4) onko seurantatuloksia tarpeen saada vuosittain vai pidemmällä aikavälillä. Tarvittavaa otoskokoa pystytään arvioimaan raportissa kuvatuilla menetelmillä. Raportti on osa Luontolaatu-hanketta. Hankkeen päätavoitteena on tuottaa tarvittava tietopohja talousmetsien luonnonhoidon laadun seurannan uudistamiseksi. Raportti auttaa päätöksentekijöitä arvioimaan, miltä osin seurantaa on hyödyllistä jatkaa nykyisessä muodossaan.202

Discovery of 12-thiazole abietanes as selective inhibitors of the human metabolic serine hydrolase hABHD16A

Screening of an in-house library of compounds identified 12-thiazole abietanes as a new class of reversible inhibitors of the human metabolic serine hydrolase. Further optimization of the first hit compound lead to the 2-methylthiazole derivative 18, with an IC50 value of 3.4 ± 0.2 µM and promising selectivity. ABHD16A has been highlighted as a new target for in-flammation-mediated pain, although selective inhibitors of hABHD16A (human ABHD16A) have not yet been reported. Our study presents abietane-type diterpenoids as an attractive starting point for the design of selective ABHD16A inhibitors, which will contribute towards understanding the significance of hABHD16A inhibition in vivo

Discovery of Triterpenoids as Reversible Inhibitors of α/β hydrolase Domain Containing 12 (ABHD12)

Peer reviewe

High-Resolution Confocal Fluorescence Imaging of Serine Hydrolase Activity in Cryosections - Application to Glioma Brain Unveils Activity Hotspots Originating from Tumor-Associated Neutrophils

Background Serine hydrolases (SHs) are a functionally diverse family of enzymes playing pivotal roles in health and disease and have emerged as important therapeutic targets in many clinical conditions. Activity-based protein profiling (ABPP) using fluorophosphonate (FP) probes has been a powerful chemoproteomic approach in studies unveiling roles of SHs in various biological systems. ABPP utilizes cell/tissue proteomes and features the FP-warhead, linked to a fluorescent reporter for in-gel fluorescence imaging or a biotin tag for streptavidin enrichment and LC-MS/MS-based target identification. Existing ABPP approaches characterize global SH activity based on mobility in gel or MS-based target identification and cannot reveal the identity of the cell-type responsible for an individual SH activity originating from complex proteomes. Results Here, by using an activity probe with broad reactivity towards the SH family, we advance the ABPP methodology to glioma brain cryosections, enabling for the first time high-resolution confocal fluorescence imaging of global SH activity in the tumor microenvironment. Tumor-associated cell types were identified by extensive immunohistochemistry on activity probe-labeled sections. Tissue-ABPP indicated heightened SH activity in glioma vs. normal brain and unveiled activity hotspots originating from tumor-associated neutrophils (TANs), rather than tumor-associated macrophages (TAMs). Thorough optimization and validation was provided by parallel gel-based ABPP combined with LC-MS/MS-based target verification. Conclusions Our study advances the ABPP methodology to tissue sections, enabling high-resolution confocal fluorescence imaging of global SH activity in anatomically preserved complex native cellular environment. To achieve global portrait of SH activity throughout the section, a probe with broad reactivity towards the SH family members was employed. As ABPP requires no a priori knowledge of the identity of the target, we envisage no imaginable reason why the presently described approach would not work for sections regardless of species and tissue source.Peer reviewe

High-Resolution Confocal Fluorescence Imaging of Serine Hydrolase Activity in Cryosections - Application to Glioma Brain Unveils Activity Hotspots Originating from Tumor-Associated Neutrophils

Background Serine hydrolases (SHs) are a functionally diverse family of enzymes playing pivotal roles in health and disease and have emerged as important therapeutic targets in many clinical conditions. Activity-based protein profiling (ABPP) using fluorophosphonate (FP) probes has been a powerful chemoproteomic approach in studies unveiling roles of SHs in various biological systems. ABPP utilizes cell/tissue proteomes and features the FP-warhead, linked to a fluorescent reporter for in-gel fluorescence imaging or a biotin tag for streptavidin enrichment and LC-MS/MS-based target identification. Existing ABPP approaches characterize global SH activity based on mobility in gel or MS-based target identification and cannot reveal the identity of the cell-type responsible for an individual SH activity originating from complex proteomes. Results Here, by using an activity probe with broad reactivity towards the SH family, we advance the ABPP methodology to glioma brain cryosections, enabling for the first time high-resolution confocal fluorescence imaging of global SH activity in the tumor microenvironment. Tumor-associated cell types were identified by extensive immunohistochemistry on activity probe-labeled sections. Tissue-ABPP indicated heightened SH activity in glioma vs. normal brain and unveiled activity hotspots originating from tumor-associated neutrophils (TANs), rather than tumor-associated macrophages (TAMs). Thorough optimization and validation was provided by parallel gel-based ABPP combined with LC-MS/MS-based target verification. Conclusions Our study advances the ABPP methodology to tissue sections, enabling high-resolution confocal fluorescence imaging of global SH activity in anatomically preserved complex native cellular environment. To achieve global portrait of SH activity throughout the section, a probe with broad reactivity towards the SH family members was employed. As ABPP requires no a priori knowledge of the identity of the target, we envisage no imaginable reason why the presently described approach would not work for sections regardless of species and tissue source.Peer reviewe

A 2 year physical activity and dietary intervention attenuates the increase in insulin resistance in a general population of children: the PANIC study

Funder: The NIHR Biomedical Research Centre in CambridgeFunder: Finnish Innovation Fund SitraFunder: Foundation for Paediatric ResearchFunder: Ministry of Social Affairs and Health of FinlandFunder: Yrjö Jahnsson FoundationFunder: Research Committee of the Kuopio University Hospital Catchment Area (State Research Funding)Funder: The city of KuopioFunder: The UK Medical Research CouncilFunder: Finnish Cultural FoundationFunder: Ministry of Education and Culture of FinlandFunder: Juho Vainio FoundationFunder: Paavo Nurmi FoundationFunder: Diabetes Research Foundation in FinlandFunder: Finnish Foundation for Cardiovascular ResearchFunder: Social Insurance Institution of FinlandAbstract: Aims/hypothesis: We studied for the first time the long-term effects of a combined physical activity and dietary intervention on insulin resistance and fasting plasma glucose in a general population of predominantly normal-weight children. Methods: We carried out a 2 year non-randomised controlled trial in a population sample of 504 children aged 6–9 years at baseline. The children were allocated to a combined physical activity and dietary intervention group (306 children at baseline, 261 children at 2-year follow-up) or a control group (198 children, 177 children) without blinding. We measured fasting insulin and fasting glucose, calculated HOMA-IR, assessed physical activity and sedentary time by combined heart rate and body movement monitoring, assessed dietary factors by a 4 day food record, used the Finnish Children Healthy Eating Index (FCHEI) as a measure of overall diet quality, and measured body fat percentage (BF%) and lean body mass by dual-energy x-ray absorptiometry. The intervention effects on insulin, glucose and HOMA-IR were analysed using the intention-to-treat principle and linear mixed-effects models after adjustment for sex, age at baseline, and pubertal status at baseline and 2 year follow-up. The measures of physical activity, sedentary time, diet and body composition at baseline and 2 year follow-up were entered one-by-one as covariates into the models to study whether changes in these variables might partly explain the observed intervention effects. Results: Compared with the control group, fasting insulin increased 4.65 pmol/l less (absolute change +8.96 vs +13.61 pmol/l) and HOMA-IR increased 0.18 units less (+0.31 vs +0.49 units) over 2 years in the combined physical activity and dietary intervention group. The intervention effects on fasting insulin (regression coefficient β for intervention effect −0.33 [95% CI −0.62, −0.04], p = 0.026) and HOMA-IR (β for intervention effect −0.084 [95% CI −0.156, −0.012], p = 0.023) were statistically significant after adjustment for sex, age at baseline, and pubertal status at baseline and 2 year follow-up. The intervention had no effect on fasting glucose, BF% or lean body mass. Changes in total physical activity energy expenditure, light physical activity, moderate-to-vigorous physical activity, total sedentary time, the reported consumption of high-fat (≥60%) vegetable oil-based spreads, and FCHEI, but not a change in BF% or lean body mass, partly explained the intervention effects on fasting insulin and HOMA-IR. Conclusions/interpretation: The combined physical activity and dietary intervention attenuated the increase in insulin resistance over 2 years in a general population of predominantly normal-weight children. This beneficial effect was partly mediated by changes in physical activity, sedentary time and diet but not changes in body composition. Trial registration: ClinicalTrials.gov NCT01803776 Graphical abstrac