The role of CDC48 in the retro-translocation of non-ubiquitinated toxin substrates in plant cells

When the catalytic A subunits of the castor bean toxins ricin and Ricinus communis agglutinin (denoted as RTA and RCA A, respectively) are delivered into the endoplasmic reticulum (ER) of tobacco protoplasts, they become substrates for ER-associated protein degradation (ERAD). As such, these orphan polypeptides are retro-translocated to the cytosol, where a significant proportion of each protein is degraded by proteasomes. Here we begin to characterise the ERAD pathway in plant cells, showing that retro-translocation of these lysine-deficient glycoproteins requires the ATPase activity of cytosolic CDC48. Lysine polyubiquitination is not obligatory for this step. We also show that while RCA A is found in a mannose-untrimmed form prior to its retro-translocation, a significant proportion of newly synthesised RTA cycles via the Golgi and becomes modified by downstream glycosylation enzymes. Despite these differences, both proteins are similarly retro-translocated

Moisture Flow Through Different Floor Structures and Its Influence on Floor Coverings

publishedVersionPeer reviewe

Kosteusvirta-tutkimus

Tutkimuksessa selvitettiin pääasiassa laboratoriossa mittaamalla paikallavaletun betonilattian kuivumista. Laboratorio-olosuhteissa tutkittiin välipohjien kuivumista. Lisäksi kenttämittauksin selvitettiin maanvaraisen betonilattian kuivumista kahdessa todellisessa rakennuskohteessa. Tutkimuksessa selvitettiin erityisesti betonilattian pintakerrosten, kuten päällysteen, ja erilaisten kuivumisolosuhteiden vaikutusta kosteuden kulkeutumiseen betonilattiassa.Tutkimus aloitettiin tekemällä materiaalikokeita suomalaisissa betonilattioissa tyypillisesti käytetyille materiaaleille. Samanaikaisesti aloitettiin tutkimuslaitteiston ja mittausjärjestelyjen suunnittelu ja rakentaminen. Tutkimuksen ensimmäisen vaiheen päättyessä mittauslaitteisto oli valmis. Tehtyjen materiaalikokeiden ja johtoryhmän asiantuntemuksen perusteella päätettiin tutkimuksen toisessa vaiheessa tutkittavat lattiarakennevaihtoehdot ja kuivumisolosuhteet.Tutkimuslaitteistoon kuului 16 sylinterimäistä tutkimuskammiota, joiden sisälle tutkittavat lattiat rakennettiin. Kammioiden sisäolosuhteita voitiin säädellä siten, että tutkittavan välipohjan eri puolille aikaansaatiin erilaiset kosteus- ja lämpötilaolosuhteet. Tutkittavat lattiarakenteet rakennettiin kammioihin samassa järjestyksessä kuin työmaalla, ja niiden rakennekerrokset vastasivat käytännön lattioita. Betonilaatan paksuus poikkesi todellisesta ollen 100 mm. Osalle koekappaleista aiheutettiin ylimääräinen kosteusrasitus, jolla kuvattiin työmaalla tapahtuvaa rakenteen kastumista esimerkiksi sateen seurauksena. Yhden välipohjan yli aikaansaatiin noin 4 °C suuruinen lämpötilaero.Tutkimuksessa tarkasteltiin yksityiskohtaisimmin tavanomaisen lattiabetonin (K30) ja ns. nopeasti päällystettävän erikoisbetonin (NP40), paremmin vesihöyryä läpäisevän ja tiiviin lattiapäällysteen sekä paksuudeltaan erilaisten tasoitekerrosten vaikutusta lattiarakenteen kuivumiseen. Kokeissa havaittiin selvä ero tavanomaisen lattiabetonin ja ns. nopeasti päällystettävän erikoisbetonin kuivumisnopeudessa valun jälkeen. Erikoisbetonista valetut välipohjakoekappaleet saavuttivat päällystyskriteerinä pidetyn 90 %:n suhteellisen kosteuden 20 %: n syvyydellä laatassa muutaman vuorokauden kuluessa jälkihoidon päättymisestä, kun taas betonin K30 kuivuminen päällystyskelpoiseksi kesti selvästi kauemmin.Kokeissa havaittiin ero tavanomaisen ja erikoisbetonin välillä myös betonilaatan kuivumisessa päällystämisen jälkeen. Suhteellinen kosteus lähellä betonilaatan pintaa kohosi päällystämisen jälkeen molemmilla betoneilla, mutta erikoisbetonilla vähemmän kuin tavanomaisella lattiabetonilla. Kuivuminen takaisin päällystämistä edeltävälle tasolle tapahtui erikoisbetonilla selvästi nopeammin kuin tavanomaisella lattiabetonilla. Ylimääräisen kastelun vaikutus kesti selvästi pidempään tavanomaisesta betonista valetussa koekappaleessa kuin erikoisbetonista valetussa koekappaleessa.Kokeiden perusteella päällysteen tiiviys vaikuttaa siihen, kuinka korkealle pintakerrosten alapuolinen suhteellinen kosteus nousee ja kuinka nopeasti se laskee kosteuden siirtyessä päällysteen läpi huoneilmaan.Lattian päällystyskelpoisuutta arvioitaessa tulisi ottaa huomioon tasoitekerroksen paksuuden mahdollinen vaihtelu, koska tasoitepaksuudella on koetulosten perusteella merkittävä vaikutus välipohjarakenteen kostumiseen ja kuivumiseen. Betonirakenteen suunnitelmien mukaisen kuivumisen varmentamiseksi suhteellisen kosteuden mittauksia tulee tehdä jo ennen pintatyövaiheeseen siirtymistä. Lattian päällystettävyyden lopullinen toteaminen on kuitenkin varminta tehdä vasta lattian tasoittamisen jälkeen

The prevalence of depressive symptoms before and after surgery and its association with disability in patients undergoing lumbar spinal fusion

PURPOSE: The aim of this study was to evaluate the prevalence of depressive symptoms and disability pre-operatively, at 3 months and at 1 year after lumbar spine fusion surgery. METHODS: Data was extracted from a dedicated lumbar spine fusion register, giving 232 patients (mean age 62 years, 158 females) who had undergone instrumented lumbar spine fusion. The frequency of depressive symptoms and disability was evaluated using the Depression Scale (DEPS) and Oswestry Disability Index (ODI). RESULTS: Depressive symptoms were found in 34, 13, and 15 % of the patients pre-operatively, at 3 months and at 1 year after surgery, respectively. The mean DEPS score decreased from 16.2 to 8.6 (p < 0.001) in patients who had depressive symptoms pre-operatively, and from 6.1 to 3.8 (p < 0.001) in those patients without pre-operative depressive symptoms. The mean ODI values pre-operatively, at 3 months and at 1 year after surgery were 53, 30, and 23, respectively, in patients with pre-operative depressive symptoms and 41, 23, and 20 in those patients without pre-operative depressive symptoms. The differences between the groups were statistically significant at all time points (p < 0.001). CONCLUSIONS: One-third of our patients with chronic back pain undergoing spinal fusion had depressive symptoms pre-operatively. The prevalence of depressive symptoms decreased after surgery. Although disability remained higher in those patients who had reported depressive symptoms pre-operatively, disability did decrease significantly in both groups post-operatively. Thus, there is no need to exclude depressive patients from operation, but screening measures and appropriate treatment practises throughout both pre-operative and post-operative periods are encouraged

Ricin A chain insertion into endoplasmic reticulum membranes is triggered by a temperature increase to 37 {degrees}C

After endocytic uptake by mammalian cells, the heterodimeric plant toxin ricin is transported to the endoplasmic reticulum (ER), where the ricin A chain (RTA) must cross the ER membrane to reach its ribosomal substrates. Here, using gel filtration chromatography, sedimentation, fluorescence, fluorescence resonance energy transfer, and circular dichroism, we show that both fluorescently labeled and unlabeled RTA bind both to ER microsomal membranes and to negatively charged liposomes. The binding of RTA to the membrane at 0-30 degrees C exposes certain RTA residues to the nonpolar lipid core of the bilayer with little change in the secondary structure of the protein. However, major structural rearrangements in RTA occur when the temperature is increased. At 37 degrees C, membrane-bound toxin loses some of its helical content, and its C terminus moves closer to the membrane surface where it inserts into the bilayer. RTA is then stably bound to the membrane because it is nonextractable with carbonate. The sharp temperature dependence of the structural changes does not coincide with a lipid phase change because little change in fluorescence-detected membrane mobility occurred between 30 and 37 degrees C. Instead, the structural rearrangements may precede or initiate toxin retrotranslocation through the ER membrane to the cytosol. The sharp temperature dependence of these changes in RTA further suggests that they occur optimally in mammalian targets of the plant toxin

Real-Time Fluorescence Detection of ERAD Substrate Retrotranslocation in a Mammalian In Vitro System

Secretory proteins unable to assemble into their native states in the endoplasmic reticulum (ER) are transported back or “retrotranslocated” into the cytosol for ER-associated degradation (ERAD). To examine the roles of different components in ERAD, one fluorescence-labeled ERAD substrate was encapsulated with selected lumenal factors inside mammalian microsomes. After mixing microsomes with fluorescence-quenching agents and selected cytosolic proteins, the rate of substrate efflux was monitored continuously in real time by the decrease in fluorescence intensity as cytosolic quenchers contacted dye-labeled substrates. The retrotranslocation kinetics of nonglycosylated pro-α factor were not significantly altered by replacing all lumenal proteins with only protein disulfide isomerase or all cytosolic proteins with only PA700, the 19S regulatory particle of the 26S proteasome. Retrotranslocation was blocked by antibodies against a putative retrotranslocation channel protein, derlin-1, but not Sec61α. In addition, pro-α factor photocrosslinked derlin-1, but not Sec61α. Thus, derlin-1 appears to be involved in pro-α factor retrotranslocation