Structure and dynamics of the outer membrane protein A from Klebsiella pneumoniae: a joint NMR–SMFS–proteolysis and MS approach

KpOmpA est une protéine de la membrane externe de K. pneumoniae. Elle fait partie de la famille des "outer membrane protein A", OmpA. KpOmpA est une protéine constituée de deux domaines: un domaine transmembranaire structuré en tonneau ß et une partie soluble, périplasmique. Le domaine transmembranaire de KpOmpA présente une homologie importante avec celle d'OmpA d'E. coli dont la structure a été déterminée par cristallographie aux rayons X et spectroscopie RMN. OmpA d'E. coli est responsable lors de la formation de biofilm. Elle a un rôle d'adhésine et d'invasine. Elle est la cible préférentielle du système immunitaire et est le récepteur de bactériophages. Il est admis que la plupart de ces fonctions sont dues aux boucles extracellulaires de ces protéines. Les différences majeures entre les protéines KpOmpA et OmpA d'E. coli concernent les boucles extracellulaires de longueur plus importante dans le cas de KpOmpA. Elles jouent un rôle important au cours de l'activation des macrophages et des cellules dendritiques par la voie des récepteurs TLR2. Les boucles extracellulaires jouent un rôle essentiel au cours de l'activation du système immunitaire. Mieux définir la structure et la dynamique de ces boucles est d'une importance essentielle afin de mieux appréhender la fonctionnalité des boucles extracellulaires de KpOmpA. Les informations structurales connues actuellement (structure RMN déterminée dans le groupe IPBS RMN en 2009) ont été obtenus jusqu'à présent avec des échantillons de protéines recombinantes purifiées et repliées dans des micelles de détergent. Dans le présent travail, nous avons d'abord établi un protocole de reconstitution de la protéine dans une membrane phospholipidique et caractérisé nos échantillons par microscopie électronique. Des expériences de spectroscopie de force atomique sur molécule unique ont été réalisées pour caractériser le repliement de la protéine dans son environnement membranaire. Ces expériences suggèrent un nouveau rôle de KpOmpA au sein même de la membrane (collaboration D. Müller, ETH Zürich). Le domaine soluble périplasmique de la protéine a été exprimé indépendamment du domaine membranaire. Les premières expériences HSQC réalisées montrent une structuration de ce domaine. La structure de ce domaine par spectroscopie RMN est en cours de réalisation. Le comportement dynamique des boucles extracellulaires du domaine membranaire KpOmpA reconstitué dans des liposomes a été étudié par spectroscopie RMN à l'angle magique (MAS) et notamment par mesure des temps de relaxation. Nous avons montré que la dynamique intrinsèque de la protéine est indépendante de l'environnement (membrane vs micelle). Des expériences de protéolyse ménagée suivie par spectrométrie de masse (MALDI-TOF) ont été comparées avec les informations RMN afin d'évaluer plus précisément les niveaux de mobilité des différentes boucles extracellulaires. La préservation au cours de l'évolution des boucles extracellulaires semble lier à leur dynamique, ce qui suggère l'importance de ces boucles extracellulaires, en termes de séquence, longueur mais aussi de dynamique lors de la réponse immunitaire.KpOmpA is a two-domain membrane protein from Klebsiella pneumoniae belonging to the outer membrane protein A (OmpA) family. It is composed of a transmembrane ß-barrel with 8 ß-strands and a C-terminal, soluble periplasmic domain. The transmembrane domain presents a significant homology with E. coli OmpA whose three dimensional structure has been determined by X-ray crystallography and by NMR. The E. coli homologue can function as an adhesin and invasin, participate in biofilm formation, act as both an immune target and evasin, and serves as a receptor for several bacteriophages. It is assumed that most of these functions involve the four protein loops that emanate from the protein to the exterior of the cell. The difference between KpOmpA and E. coli OmpA is mostly concentrated in these extracellular loops which are larger in the case of KpOmpA. KpOmpA was shown to activate macrophages and dendritic cells through the TLR2 dependent pathway, and these larger loops are supposed to play a specific role in the interactions with the immune system. Thus the structure and dynamics of these loops is of prime functional significance. The currently available information in this regard, including the NMR structure determined in the IPBS NMR group in 2009, have been obtained so far with recombinant protein samples purified and refolded in detergent micelles. In the present work we first established a reconstitution protocol that allowed the incorporation of the membrane protein in the more native environment of the lipid bilayer and characterised our samples by electron microscopy. SMFS experiments were used to probe the reconstituted KpOmpA unfolding-refolding pathways, exploring the folding mechanisms for ß-barrel proteins and suggesting a novel role for OmpA in the bacterial membrane (in collaboration with the group of D. Müller, ETH Zürich). The C-terminal periplasmic domain of KpOmpA was expressed and purified as a separate product and the feasibility of its structure elucidation by NMR was demonstrated by obtaining a high quality HSQC spectrum. The dynamic behaviour of the extracellular portion of the KpOmpA membrane domain reconstituted in liposomes has been investigated by solid state MAS NMR relaxation experiments. We confirmed that the previously observed gradient of dynamic along the molecule axis is an intrinsic property of the protein. Limited proteolysis and MALDI-TOF experiments were coupled with the NMR information in order to assess more precisely the different mobility levels in the loops. Evolutional preservation of the different loops regions is related to their observed flexibility, pointing towards immunologically important, variable, dynamic and accessible loops sections

Strategic Trade Between Two Countries - Exploring the Case of Partial Local Consumer Protection

The paper develops a dynamic model of trade between two countries where the trading entities interact in a strategic context. Consumers in both countries are endowed with certain incomes and try to acquire as much as possible of the quantities available on the markets. Consumers have privileged access to some of the good supplied locally, a form of partial local protection. Over time, prices are adjusted to respond to the outcomes of trading. For this setup, we prove the existence of Nash equilibria and simulate the model numerically in Python to illustrate the possibility of obtaining different types of price dynamics depending on the price adjustment rule used. ACM Computing Classification System (1998): J4, G4, I.6.3

Implementing Delaunay Triangulations of the Bolza Surface

The CGAL library offers software packages to compute Delaunay triangulations of the (flat) torus of genus one in two and three dimensions. To the best of our knowledge, there is no available software for the simplest possible extension, i.e., the Bolza surface, a hyperbolic manifold homeomorphic to a torus of genus two. In this paper, we present an implementation based on the theoretical results and the incremental algorithm proposed last year at SoCG by Bogdanov, Teillaud, and Vegter. We describe the representation of the triangulation, we detail the different steps of the algorithm, we study predicates, and report experimental results

Triangulations de Delaunay d'une famille de surfaces hyperboliques symétriques en pratique

The Bolza surface is the most symmetric compact orientable hyperbolic surface of genus 2. For any genus higher than 2, there exists one compact orientable surface constructed in a similar way as the Bolza surface having the same kind of symmetry. We refer to this family of surfaces as symmetric hyperbolic surfaces. This thesis deals with the computation of Delaunay triangulations of symmetric hyperbolic surfaces.Delaunay triangulations of compact surfaces can be seen as periodic Delaunay triangulations of their universal cover (in our case, the hyperbolic plane). A Delaunay triangulation is for us a simplicial complex. However, not all sets of points define a simplicial decomposition of a symmetric hyperbolic surface. In the literature, an algorithm has been proposed to deal with this issue by using so-called dummy points: initially a triangulation of the surface is constructed with a set of dummy points that defines a Delaunay triangulation of the surface, then input points are inserted with the well-known incremental algorithm by Bowyer, and finally the dummy points are removed, if the triangulation remains a simplicial complex after their removal. For the Bolza surface, the set of dummy points to initialize the triangulation is given. The existing algorithm computes a triangulation of the Bolza surface as a periodic triangulation of the hyperbolic plane and requires to identify a suitable subset of the hyperbolic plane in which to work.We study the properties of Delaunay triangulations of the Bolza surface defined by sets of points containing the proposed set of dummy points, and we describe in detail an implementation of the incremental algorithm for it. We begin by identifying a subset of the hyperbolic plane that contains at least one representative for each face of a Delaunay triangulation of the surface, which enables us to define a unique canonical representative in the hyperbolic plane for each face on the surface. We give a data structure to represent a Delaunay triangulation of the Bolza surface via the canonical representatives of its faces in the hyperbolic plane. We detail the construction of such a triangulation and additional operations that enable the location of points and the removal of vertices. We also report results on the algebraic degree of predicates needed for all operations. We provide a fully dynamic implementation for the Bolza surface, supporting insertion of new points, removal of existing vertices, point location, and construction of dual objects. Our implementation is based on CGAL, the Computational Geometry Algorithms Library, and is currently under revision for integration in the library. To incorporate our code into CGAL, all the objects that we introduce must be compatible with the existing framework and comply with the standards adopted by the library. We give a detailed description of the classes used to represent and handle periodic hyperbolic triangulations and related objects. Benchmarks and tests are performed to evaluate our implementation, and a simple application is given in the form of a CGAL demo.We discuss an extension of our implementation to symmetric hyperbolic surfaces of genus higher than 2. We propose three methods to generate sets of dummy points for each surface and present the advantages and shortcomings of each method. We identify a suitable subset of the hyperbolic plane that contains at least one representative for each face of a Delaunay triangulation of the surface, and we define a canonical representative in the hyperbolic plane for each face on the surface. We describe a data structure to represent such a triangulation via the canonical representatives of its faces, and give algorithms for the initialization of the triangulation with dummy points. Finally, we discuss a preliminary implementation in which we examine the difficulties of having efficient exact predicates for the construction of Delaunay triangulations of symmetric hyperbolic surfaces.La surface de Bolza est la surface hyperbolique orientable compacte la plus symétrique de genre 2. Pour tout genre supérieur à 2, il existe une surface orientable compacte construite de manière similaire à la surface de Bolza et ayant le même type de symétries. Nous appelons ces surfaces des surfaces hyperboliques symétriques. Cette thèse porte sur le calcul des triangulations de Delaunay (TD) de surfaces hyperboliques symétriques.Les TD de surfaces compactes peuvent être considérées comme des TD périodiques de leur revêtement universel (dans notre cas, le plan hyperbolique). Une TD est pour nous un complexe simplicial. Cependant, les ensembles de points ne définissent pas tous une décomposition simpliciale d'une surface hyperbolique symétrique. Dans la littérature, un algorithme a été proposé pour traiter ce problème avec l'utilisation de points factices : initialement une TD de la surface est construite avec un ensemble de points connu, puis des points d'entrée sont insérés avec le célèbre algorithme incrémental de Bowyer, et enfin les points factices sont supprimés, si la triangulation reste toujours un complexe simplicial. Pour la surface de Bolza, les points factices sont spécifiés. L'algorithme existant calcule une DT de la surface de Bolza comme une DT périodique du plan hyperbolique, ce qui nécessite de travailler dans un sous-ensemble approprié du plan hyperbolique.Nous étudions les propriétés des TD de la surface de Bolza définies par des ensembles de points contenants l'ensemble proposé de points factices, et nous décrivons en détail une implémentation de l'algorithme incrémentiel pour cette surface. Nous commençons par définir un représentant canonique unique qui est contenu dans un sous-ensemble borné du plan hyperbolique pour chaque face d'une TD de la surface. Nous donnons une structure de données pour représenter une TD de la surface de Bolza via les représentants canoniques de ses faces. Nous détaillons les étapes de la construction d'une telle triangulation et les opérations supplémentaires qui permettent de localiser les points et de retirer des sommets. Nous présentons également les résultats sur le degré algébrique des prédicats nécessaires pour toutes les opérations.Nous fournissons une implémentation entièrement dynamique pour la surface de Bolza, en offrant l'insertion de nouveaux points, la suppression des sommets existants, la localisation des points, et la construction d'objets duaux. Notre implémentation est basée sur la bibliothèque CGAL (Computational Geometry Algorithms Library), et est actuellement en cours de révision pour être intégrée dans la bibliothèque. L'intégration de notre code dans CGAL nécessite que tous les objets que nous introduisons soient compatibles avec le cadre existant et conformes aux standards adoptés par la bibliothèque. Nous donnons une description détaillée des classes utilisées pour représenter et traiter les triangulations hyperboliques périodiques et les objets associés. Des analyses comparatives et des tests sont effectués pour évaluer notre implémentation, et une application simple est donnée sous la forme d'une démonstration CGAL.Nous discutons une extension de notre implémentation à des surfaces hyperboliques symétriques de genre supérieur à 2. Nous proposons trois méthodes pour engendrer des ensembles de points factices pour chaque surface et présentons les avantages et les inconvénients de chaque méthode. Nous définissons un représentant canonique contenu dans un sous-ensemble borné du plan hyperbolique pour chaque face d'une TD de la surface. Nous décrivons une structure de données pour représenter une telle triangulation via les représentants canoniques de ses faces, et donnons des algorithmes pour l'initialisation de la triangulation. Enfin, nous discutons une implémentation préliminaire dans laquelle nous examinons les difficultés d'avoir des prédicats exacts efficaces pour la construction de TD de surfaces hyperboliques symétriques

Putative chanzyme activity of TRPM2 cation channel is unrelated to pore gating

Transient receptor potential melastatin 2 (TRPM2) is a Ca(2+)-permeable cation channel expressed in immune cells of phagocytic lineage, pancreatic β cells, and brain neurons and is activated under oxidative stress. TRPM2 activity is required for immune cell activation and insulin secretion and is responsible for postischemic neuronal cell death. TRPM2 is opened by binding of ADP ribose (ADPR) to its C-terminal cytosolic nudix-type motif 9 (NUDT9)-homology (NUDT9-H) domain, which, when expressed in isolation, cleaves ADPR into AMP and ribose-5-phosphate. A suggested coupling of this enzymatic activity to channel gating implied a potentially irreversible gating cycle, which is a unique feature of a small group of channel enzymes known to date. The significance of such a coupling lies in the conceptually distinct pharmacologic strategies for modulating the open probability of channels obeying equilibrium versus nonequilibrium gating mechanisms. Here we examine the potential coupling of TRPM2 enzymatic activity to pore gating. Mutation of several residues proposed to enhance or eliminate NUDT9-H catalytic activity all failed to affect channel gating kinetics. An ADPR analog, α-β-methylene-ADPR (AMPCPR), was shown to be entirely resistant to hydrolysis by NUDT9, but nevertheless supported TRPM2 channel gating, albeit with reduced apparent affinity. The rate of channel deactivation was not slowed but, rather, accelerated in AMPCPR. These findings, as well as detailed analyses of steady-state gating kinetics of single channels recorded in the presence of a range of concentrations of ADPR or AMPCPR, identify TRPM2 as a simple ligand-gated channel that obeys an equilibrium gating mechanism uncoupled from its enzymatic activity

Rastertunnelmikroskopische Untersuchungen zur Selbstorganisation und molekularen Erkennung von Tetralactam-Makrocyclen auf Oberflächen

In dieser Arbeit wurden die Selbstorganisation von Tetralactam-Makrocyclen (TLM) auf Einkristalloberflächen sowie die molekulare Erkennung ausgewählter organischer Moleküle (4-amino-N-(4-trityl-phenyl)-benzamide, s.g. "Stopper") in den selbstorganisierten TLM-Schichten mittels Rastertunnelmikroskopie (STM) untersucht. Diese Moleküle sind mögliche Bausteine für künstliche molekulare Maschinen und sind bekanntlich für die Synthese von Rotaxanen eingesetzt worden. Ziele waren die Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen der Selbstorganisation der TLM-Moleküle auf Oberflächen sowie das Verständnis der Rolle der oberflächenbedingten Templat-Effekte für die Strukturbildung und für die molekulare Erkennung, und damit ein besseres Verständnis der Mechanismen bei der Synthese oberflächengebundener molekularer Maschinen. Zum Erreichen der gestellten Ziele wurden Monolagen aus Tetralactam-Makrocyclen auf der Au(111)-Oberfläche mittels STM im Ultrahochvakuum untersucht. Die STM-Bilder zeigten, dass die TLM-Moleküle zweidimensionale geordnete Strukturen (s.g. a- und ß-Struktur) für Submonolagen- und Monolagenbedeckungen bilden. Der Aufbau dieser Strukturen wurde mit Hilfe von Dichtefunktionaltheorie-Rechnungen (DFT) aufgeklärt. Die Selbstorganisation der Tetralactam-Makrocyclen in der a- und ß-Struktur auf der Au(111)-Oberfläche beruht auf der Bildung von Paaren von intermolekularen Wasserstoffbrücken zwischen benachbarten Makrocyclen. Zusammen mit einer passenden Konformation der Makrocyclen führt das zur Ausbildung von Dimeren, Trimeren und linearen Ketten (in der a-Struktur) aus den Makrocyclen, deren Anordnung auf der Oberfläche die geordneten a- und ß-Strukturen ergibt. Eine wichtige Eigenschaft der TLM-Moleküle, die zur Ausbildung der geordneten Strukturen beiträgt, ist die sterische Abschirmung ihrer reaktiven funktionellen Gruppen von der Au(111)-Oberfläche durch jeweils vier Methyl-Gruppen auf jeder Seite der Makrocyclusebene. Dadurch sind die näherungsweise flach liegenden Makrocyclen an der Oberfläche nur schwach durch Physisorption gebunden. Allen geordneten Strukturen ist gemeinsam, dass sie in der Kristallstruktur des TLM-Festkörpers nicht beobachtet werden. Daraus wurde auf die Rolle des Au(111)-Substrats für die zweidimensionale Strukturbildung geschlossen. Im Fall der am besten untersuchten a-Struktur kann man die Au(111)-Oberfläche als ein strukturloses, planares Templat betrachten, welches eine für die Strukturbildung wichtige planare Lage der Makrocyclen auf der Oberfläche bewirkt. Zum Zweck der Untersuchung der molekularen Erkennung der Stopper-Moleküle in den geordneten Schichten der Tetralactam-Makrocyclen wurden die Stopper-Moleküle durch Aufdampfen im Ultrahochvakuum auf die TLM-Schichten bei verschiedenen Substrattemperaturen aufgebracht und mittels STM untersucht. Die gefundenen gut definierten Adsorptionsplätze der Stopper-Moleküle in den Kavitäten der TLM-Moleküle bei niedrigen Temperaturen erwiesen sich als kinetisch stabilisiert, konnten jedoch nicht als thermodynamisch stabil bestimmt werden. Sie wurden außerdem bei Raumtemperatur nicht beobachtet. Stattdessen wurden die TLM-Schichten bei Raumtemperatur an ihren Inselrändern durch die Stopper-Moleküle teilweise zerstört. Diese Beobachtungen wurden durch einen nur schwachen Templat-Effekt bei der Adsorption der Stopper-Moleküle in die Kavitäten der Makrocyclen (s.g. Durchfädelung) in den geordneten TLM-Schichten erklärt. Die Ursache dafür ist die Makrocyclus-Konformation, welche die Orientierung der für den Templat-Effekt wichtigen NH-Gruppen in den TLM-Kavitäten bestimmt. Bei TLM-Molekülen in der geordneten Schicht ist diese Orientierung für eine starke und thermodynamisch stabile Adsorption der Stopper-Moleküle nicht geeignet. Eine weitere mögliche Ursache für den schwachen Templat-Effekt ist möglicherweise die Aktivierungsenergie für die Konformationsänderungen der Makrocyclen in der a-Struktur, weil die Bewegungsfreiheitsgrade eines TLM-Moleküls im Inneren der a-Struktur durch seine Wechselwirkungen mit den Nachbarmolekülen stark reduziert sind. Eine zusätzliche Rolle spielt vermutlich auch die Substrat-Oberfläche, die zu einer sterischen Hinderung bei der Durchfädelung der Stopper-Moleküle in die Kavitäten der Makrocyclen führen kann

Implémentation des triangulations de Delaunay de la surface de Bolza

The CGAL library offers software packages to compute Delaunay triangulations of the (flat) torus of genus one in two and three dimensions. To the best of our knowledge, there is no available software for the simplest possible extension, i.e., the Bolza surface, a hyperbolic manifold homeomorphic to a torus of genus two.In this paper, we present an implementation based on the theoretical results and the incremental algorithm proposed recently. We describe the representation of the triangulation, we detail the different steps of the algorithm, we study predicates, and report experimental results.La bibliothèque logicielle CGAL offre des modules pour calculer des triangulations de Delaunay du tore plat de genre un en dimension deux et trois. À notre connaissance, il n’existe pas de logiciel pour l’extension la plus simple possible, c’est-à-dire la surface de Bolza, qui est une variété hyperbolique homéomorphe à un double tore.Dans cet article, nous présentons une implémentation basée sur les résultats théoriques et l’algorithme incrémental proposé récemment. Nous décrivons la représentation d’une triangulation, nous détaillons les différentes étapes de l’algorithme, nous étudions les prédicats et présentons des résultats expérimentaux

Delaunay triangulations of generalized Bolza surfaces

The Bolza surface can be seen as the quotient of the hyperbolic plane, represented by the Poincar\'e disk model, under the action of the group generated by the hyperbolic isometries identifying opposite sides of a regular octagon centered at the origin. We consider generalized Bolza surfaces $\mathbb{M}_g$, where the octagon is replaced by a regular $4g$-gon, leading to a genus $g$ surface. We propose an extension of Bowyer's algorithm to these surfaces. In particular, we compute the value of the systole of $\mathbb{M}_g$. We also propose algorithms computing small sets of points on $\mathbb{M}_g$ that are used to initialize Bowyer's algorithm.Comment: 50 pages, 28 figure

Selective profiling of N- And C-terminal nucleotide-binding sites in a TRPM2 channel

Transient receptor potential melastatin 2 (TRPM2) is a homotetrameric Ca2+-permeable cation channel important for the immune response, body temperature regulation, and insulin secretion, and is activated by cytosolic Ca2+ and ADP ribose (ADPR). ADPR binds to two distinct locations, formed by large N- and C-terminal cytosolic domains, respectively, of the channel protein. In invertebrate TRPM2 channels, the C-terminal site is not required for channel activity but acts as an active ADPR phosphohydrolase that cleaves the activating ligand. In vertebrate TRPM2 channels, the C-terminal site is catalytically inactive but cooperates with the N-terminal site in channel activation. The precise functional contributions to channel gating and the nucleotide selectivities of the two sites in various species have not yet been deciphered. For TRPM2 of the sea anemone Nematostella vectensis (nvTRPM2), catalytic activity is solely attributable to the C-terminal site. Here, we show that nvTRPM2 channel gating properties remain unaltered upon deletion of the C-terminal domain, indicating that the N-terminal site is single-handedly responsible for channel gating. Exploiting such functional independence of the N- and C-terminal sites, we selectively measure their affinity profiles for a series of ADPR analogues, as reflected by apparent affinities for channel activation and catalysis, respectively. Using site-directed mutagenesis, we confirm that the same N-terminal site observed in vertebrate TRPM2 channels was already present in ancient cnidarians. Finally, by characterizing the functional effects of six amino acid side chain truncations in the N-terminal site, we provide first insights into the mechanistic contributions of those side chains to TRPM2 channel gating. © 2020 Tóth et al. This article is distributed under the terms of an Attribution-Noncommercial-Share Alike-No Mirror Sites license for the first six months after the publication date (see http://www.rupress.org/terms/). After six months it is available under a Creative Commons License (Attribution-Noncommercial-Share Alike 4.0 International license, as described at https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/)