The molecular basis of polysaccharide cleavage by lytic polysaccharide monooxygenases.

Lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) are copper-containing enzymes that oxidatively break down recalcitrant polysaccharides such as cellulose and chitin. Since their discovery, LPMOs have become integral factors in the industrial utilization of biomass, especially in the sustainable generation of cellulosic bioethanol. We report here a structural determination of an LPMO-oligosaccharide complex, yielding detailed insights into the mechanism of action of these enzymes. Using a combination of structure and electron paramagnetic resonance spectroscopy, we reveal the means by which LPMOs interact with saccharide substrates. We further uncover electronic and structural features of the enzyme active site, showing how LPMOs orchestrate the reaction of oxygen with polysaccharide chains.We thank K. Rasmussen and R.M. Borup for experimental assistance, and MAXLAB, Sweden and the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), France, for synchrotron beam time and assistance. This work was supported by the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (grant numbers BB/L000423 to P.D., G.J.D. and P.H.W., and BB/L021633/1 to G.J.D. and P.H.W.), Agence Française de l'Environnement et de la Maîtrise de l'Energie (grant number 1201C102 to B.H.), the Danish Council for Strategic Research (grant numbers 12-134923 to L.L.L. and 12-134922 to K.S.J.). Travel to synchrotrons was supported by the Danish Ministry of Higher Education and Science through the Instrument Center DANSCATT and the European Community's Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013) under BioStruct-X (grant agreement 283570). L.M., S.F., S.C. and H.D. were supported by Institut de Chimie Moléculaire de Grenoble FR 2607, LabEx ARCANE (ANR-11-LABX-0003-01), the PolyNat Carnot Institute and the French Agence Nationale de la Recherche (PNRB2005-11).This is the author accepted manuscript. The final version is available from Nature Publishing Group via http://dx.doi.org/10.1038/nchembio.202

Additions, catalysées par le chlorure chromeux, de N-haloamides à des systèmes oléfiniques

L'addition, catalysée par les sels chromeux, de N-chlorocarbamates aux oléfines simples conduit â la synthèse de B-chlorocarbamates avec d'excellents rendements. Nous montrerons dans ce travail la versatilité et les limitations de cette méthode par l'addition de divers carboxamides et carbamates N-halogénés à une grande variété de systèmes insaturés comme: - des oléfines simples mono-, di-, et trisubstituées par des groupements alkyles, et des halogénures vinyliques; - des systèmes doublement insaturés: des diènes conjugués et non conjugués, des cétones et esters x, B-insaturés; - des éthers énoliques simples linéaires et cycliques, et plus complexes comme des sucres 1,2-insaturés. Nous verrons la régiospécificité de la réaction et nous étudierons sa stéréosélectivité ainsi que la nature des produits obtenus en fonction d'une part de la nature de l'halogène et du radical azoté, et d'autre part de la densité électronique ou de la polarisation de la double liaison et de l'encombrement stérique au voisinage du site réactionnel. Enfin certaines réactions supplémentaires seront rapportées pour nous permettre de proposer une hypothèse quant au mécanisme de cette réaction en accord avec les résultats expérimentaux

Synthèse chimique et biotechnologique d oligosaccharides sialylés

LES GANGLIOSIDES CONTENANT DE L'ACIDE SIALIQUE SONT IMPLIQUËS DANS DES NOMBREUX PHENOMENES DE RECONNAISSANCE ET DE SIGNALISATION MOLÉCULAIRES. L'ACIDE SIALIQUE JOUE UN RÔLE IMPORTANT DANS CES FONCTIONS, EN ÉTANT LE RÉCEPTEUR SPÉCIFIQUE POUR DES TOXINES, DES BACTÉRIES ET DES VIRUS. LE DÉVELOPPEMENT DES MÉDICAMENTS BASÉS SUR DES CARBOHYDRA TES DÉPEND DE LA DISPONIBILITÉ DE TELLES STRUCTURES COMPLEXES. UNE MÉTHODE TRÉS EFFICACE, DÉVELOPPÉE AU CERMAV, PERMET LA PRODUCTION À L'ÉCHELLE DE GRAMME D'OLIGOSACCHARIDES, PAR LA CULTURE À HAUTE DENSITÉ CELLULAIRE DES SOUCHES D'E. COLI QUI SUREXPRIMENT LES ENZYMES NÉCESSAIRES, COMME LES GL YCOSYL TRANSFERASES ET LES GL YCOSYL NUCLÉOTIDES SYNTHÉT ASES.CETTE MÉTHODE, L'USINE CELLULAIRE , A PERMIS D'OBTENIR À LARGE ÉCHELLE, DES PORTIONS OLiGOSACCHARlDIQUE DES GANGLIOSIDES GM3 ET GM2 AVEC DES AGL YCONES DIFFÉRENTS. CES AGLYCONES ACTIVABLES, COMME L'ALLYLE OU LE PROPARGYLE ONT ÉTÉ PAR LA SUITE UTILISÉS POUR LA PRÉPARATION DES GLYCOCONJUGUÉS, EN VUE DU DÉVELOPPEMENT ET LA PRÉPARATION DES VACCINS ANTICANCÉREUX. DES OLiGOSACCHARlDES GM3 ET GM2 MODIFIÉS, POTENTIELLEMENT AVEC DES CARACTÉRISTIQUES IMMUNOGÉNÉTIQUE AMÉLIORÉS, ONT ÉTÉ PRÉPARÉES PAR CULTURE DES SOUCHES RECOMBINANTES EN UTILISANT COMME SUBSTRATS DES ACIDES SIALIQUES NON NATURELS. CES OLIGOSACCHARIDES DU GM3 MODIFIÉS, ÉGALEMENT OBTENUS PAR SYNTHÈSE CHIMIQUE, SONT RECONNUS PAR LA LECTINE MAACK/A AMURENS/S COMME L' OLiGOSACCHARlDE GM3 NATUREL ET PRÉSENTENT UNE PLUS GRAND STABILITÉ PAR APPORT À L' HYDROLYSE PAR LA NEURAMINIDASE DU V/BRIO CHOLERAE. UN NOUVEL OLIGOSACCHARIDE DU GM3 CONTENANT UN ANALOGUE DE L'ACIDE SIALIQUE, AVEC UN SULFURE ENDOCYCLIC A ÉTÉ PRÉPARÉ PAR INGÉNIERIE MÉTABOLIQUE.GANGLIOSIDES, SIALIC ACID CONTAINING GLYCOSPHINGOLIPIDS, ARE INVOLVED lN NUMEROUS MOLECULAR RECOGNITION, TARGETING AND SIGNALING PROCESSES. THESE PHENOMENA ARE MEDIATED BY SIALIC AClDS, IDEALLY SITUATED AT TERMINAL AND OUTER POSITIONS, WHICH ACT AS HIGHLY SPECIFIC RECEPTORS FOR TOXINS, BACTERIA AND VIRUSES. DEVELOPMENT OF CARBOHYDRATE-BASED DRUGS, INCLUDING ANTICANCER VACCINES, IS TIGHTLY ASSOCIATED WITH THE AVAILABILITY OF SUCH COMPLEX OLiGOSACCHARlDIC STRUCTURES. AN EFFICIENT METHOD FOR THE LARGE SCALE PRODUCTION OF OLiGOSACCHARlDES, DEVELOPED AT CERMAV, INVOLVES THE HIGH-CELL DENSITY CULTURE OF METABOLICALL Y ENGINEERED E. COLI BACTERIAL STRAINS, WHICH OVEREXPRESS THE NECESSARY NUCLEOTIDE SYNTHASES AND GLYCOSYLTRANSFERASES GENES. USING THIS METHOD, THE "LIVING FACTORY" PROCESS, THE LARGE SCALE SYNTHESIS OF OLiGOSACCHARlDIC STRUCTURES OF GM3 AND GM2 HAVING VARIOUS AGLYCONS WAS ACHIEVED. CONJUGATABLE AGLYCONS, SUCH AS PROP ARGYL AND ALL YL GROUPS, WERE USED FOR THE SUBSEQUENT SYNTHESIS OF GL YCOCONJUGA TES, lN VIEW OF THE DESIGN AND PREPARATION OF ANTICANCER VACCINES. MODIFIED GM3 AND GM2 OLiGOSACCHARlDES, AIMING TO INCREASE THEIR IMMUNOGENICITY, WERE PREP ARED BY CULTURE OF MET ABOLICALL Y ENGINEERED BACTERIA EXOGENOUSL Y SUPPLIED WITHUNNATURAL N-MODIFIED SIALIC ACID SUBSTRATES. MODIFIED GM3 OLIGOSACCHARIDES, WHICH WERE AS WELL PREP ARED BY CHEMICAL SYNTHESIS, WERE RECOGNIZED BY THE LECTIN MAACKIA AMURENSIS WITH THE SAME AFFINITY AS THE NA TURAL GM3 OLiGOSACCHARlDE AND SHOWED AN INCREASED ST ABILITY TOW ARDS THE HYDROL YTIC ACTION OF NEURAMINIDASE. A NEW GM3 OLiGOSACCHARlDE HA VING AN ENDOCYCLIC SULFUR A TOM lN THE SIALIC ACID RESIDUE W AS PREP ARED BY MET ABOLICALL Y ENGINEERED BACTERIA.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

Obtention de dextrines limites non-naturelles, analogues de substrat pour étudier les relations structure/fonction d'enzymes intervenant dans la dégradation de l'amidon

Dans ce travail est décrite la synthèse d'analogues de substrat des amylases par voie chimio-enzymatique en utilisant des fluorures d'[alpha]-maltosyle protégés en 4II. La première série de composés cibles est constituée de quatre hémithio-maltooligosides de méthyle. Il s'agit, à notre connaissance, de la plus importante série d'analogues de substrat d'[alpha]-1,4 glucane hydrolase. Cette série de composés devrait permettre de comparer aisément différentes amylases entre elles. Nous avons ensuite abordé la synthèse d'un composé photolysable destiné à l'étude de l'isozyme 1 de l'[alpha]-amylase d'orge. Les résultats obtenus, bien que décevants, ont permis de considérer de nouveaux composés cibles. L'étude des interactions de ces dérivés avec la protéine est actuellement en cours. Ensuite la synthèse d'analogues de dextrine limite comportant une liaison thio-glycosidique [alpha]-1,6 est décrite. La série obtenue, constituée de six hémithio-dextrine limite, a permis d'étudier la pullulanase de type II de hermococcus hydrothermalis et de comparer la limite-dextrinase d'orge à deux pullulanases. L'évaluation biochimique des composés obtenus n'est pas achevée. Finalement, la stratégie développée dans l'ensemble de ce travail été appliquée à l'obtention d'une dextrine limite et à la modification du pullulane.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

Synthèses chimio-enzymatiques de xylogluco-oligosaccharides pour l'étude des enzymes intervenant dans le métabolisme des xyloglucanes

Le manque de substrats parfaitement caractérisés limite considérablement les études structures/activité des enzymes impliquées dans le métabolisme des xyloglucanes. Les potentialités de la glycosynthase Cel7B E197A d'Humicola insolens pour la synthèse chimio-enzymatique d'oligosaccharides branchés complexes ont été démontrées et appliquées à la préparation de xylogluco-oligosaccharides. Cette méthodologie, combinée à un nouveau concept de protection/déprotection enzymatique en utilisant un autre motif saccharidique comme groupement protecteur, a permis d'éliminer les réactions concurrentes et d'obtenir ainsi spécifiquement chacune des molécules cibles. Cette bibliothèque de xylogluco-oligosaccharides a été utilisée pour étudier les spécificités de substrat de la xyloglucane-endotransglycosylase de Populus trema x tremuloides (PttET16A) et de xylosyltransférases d'Arabidopis thaliana dont l'AtXT1. La pttXET16A accepte des substrats donneurs de basses masses moléculaires et notamment des motifs nonasaccharidiques qui sont les structures minimales reconnues par une XET. De plus, la modulation de l'activité de cette enzyme par la production de mutants a permis de mettre en évidence une nouvelle glycosynthas. L'activité de AtXt1 vis-à-vis de certains substrats xylogluco-oligosaccharidiques est inattendue et modifie les conclusions préalablement établies.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

Valorisation de nouveaux oligosaccharides fonctionnels dans la synthèse de copolymères cationiques

Depuis quelques années une attention particulière a été portée aux polymères synthétiques présentant des pendants saccharidiques, appelés glycopolỳmères, dus à leurs potentiels dans les domaies biotechnologiques, pharmacologiques et médicaux. Cependant peu d'études ont été reportées sur les applications cosmétiques de tels polymères et leurs apports. Au cours de ce travail, nous avons synthétisé des copolymèresà l'aide de monomères à pendants saccharidiques à base de cellobiose et de xyloglucane. Après une brève mise au point bibliographique sur les différentes voies de synthèses possibles pour obtenir des glycopolymères, nous décrivons dans le deuxième chapitre la conception de différents monomères glycosidiques présentant un groupement polymérisable (méth)acrylamide. Le troisième chapitre est consacré à la synhtèse de glycopolymères, à l'aide d'un comomère cationique, le MAPTAC. Nous nous sommes employés à trouver une méthode de copolymérisation simple en réacteur fermé agité permettant d'atteindre des taux de conversion proche de 100%. Les glycopolymères ont été synhtétisés à différents taux molaires en monomères glycosidiques '2.5 ; 5 et 8% molaire). Enfin le quatrième chapitre aborde la caractérisation physico-chimique des glycopolymères en utilisant différentes techniques telles que la viscosimétrie, la chromatographie d'exclusion stérique et la diffusion statique de la lumière. Nous avons ainsi pu montrer que les glycopolymères possédaient de très hautes masses molaires, un des principaux objectifs de ce travail.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

SYNTHESES CHIMIQUES ET ENZYMATIQUES DE GLYCOMIMETIQUES POUR L'ETUDE DE CELLULASES

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Synthèse chimioenzymatique de facteurs Nod et d'analogues structuraux en vue de l'isolement et de la caractérisation de récepteurs Nod végétaux

La symbiose azotée entre les plantes légumineuses et les bactéries rhizobia fixatrices d'azote met en jeu la production de novo par la bactérie de lipochitooligosaccharides(LCOs) : les facteurs de nodulation ou facteurs Nod. La diversité structural de ces molécules est responsable en grande partie de la spécificité de l'interaction plante/bactérie. La mise au point d'une méthode d'acylation chimique de chitooligosaccharides "recombinants" (produits par E.coli) a permis l'obtention d'une grande variété de facteurs Nod, existants ou non à l'état naturel. Ils diffèrent par la longueur du squelette oligosaccharidique, les substitutions à ses extrémités et la nature de la chaine grasse introduite chimiquement. Des LCOs ont ensuite été modifiés chimiquement pour l'obtention de sondes en vue de l'isolement de récepteurs Nod végétaux par chromatographie d'affinité et photoaffinité. Dans un dernier temps, un analogue de lipochitotétraose a été obtenu par synthèse chimio-enzymatique multiétape. Il représente un autre type d'analo gues de facteur Nod, dans lequel une unité N-acétyl-d-glucosamine a été remplacée par du d-glucose. l'étape-clef de la synthèse réside dans l'utilisation du mutant Glu-197-Ala de Cel7B de humicola insolens pour le couplage entre deux dimères. La synthèse chimique du dimère donneur a permis de mettre en évidence la formation d'une oxazoline comme intermédiaire réactionnel du couplage de deux monomères par la méthode d'activation au phénylsulfoxyde développée par Kahne et coll. Ces molécules sont utilisées dans le cadre d'études biochimiques pour l'isolement et la caractérisation de récepteurs Nod végétaux.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

COPOLYMÈRES À BLOCS HYBRIDES À BASE DE XYLOGLUCANE ET DE POLYMÈRE VINYLIQUE EN COMBINANT MODIFICATION CHIMIO-ENZYMATIQUE ET POLYMÉRISATION RADICALAIRE CONTRÔLÉE

Le xyloglucane issu de la graine de tamarin (XG) est un polysaccharide provenant de la biomasse. Son association à un bloc vinylique dans une architecture de copolymères à blocs hybrides naturels/synthétique permet d'envisager des applications de par leur auto-assemblage en solution aqueuse. Afin d'obtenir de tels copolymères à blocs, deux stratégies de synthèse sont proposées, basées sur la modification chimio-enzymatique du xyloglucane et la polymérisation radicalaire contrôlée MADIX de monomères vinyliques : acrylamide (Am), acétate de vinyle (AcV), N-vinyl-2-pyrrolidone (NVP). La stratégie starting from consiste en la polymérisation radicalaire contrôlée MADIX d'un monomère vinylique à partir de l'oligosaccharide du xyloglucane modifié par une ou plusieurs fonctions polymérisantes. La stratégie coupling onto consiste en un couplage par chimie click entre un polymère vinylique issu de la polymérisation radicalaire contrôlée MADIX à partir d'un agent de transfert de chaîne porteur d'une fonction azoture, et l'oligosaccharide modifié par une fonction alcyne. Ainsi, quatre familles de copolymères à blocs hybrides ont été obtenus (XG-b-PAm, PAm-b-XG-b-PAm, XG-b-PAcV, XG-b-PNVP). Une étude physico-chimique en solution préliminaire des copolymères XG-b-PAcV et XG-b-PNVP a également été réalisée indiquant la formation de polymersomes.Xyloglucan from tamarind seeds (XG) is a natural occurring polysaccharide. The association of the xyloglucan with a vinylic polymer part in an hybrid natural/synthetic block copolymer architecture gives the possibility to take advantages of its self-assembly in aqueous solution. We propose in this manuscript two synthetic strategies giving rise to hybrid block copolymers, based on chemo-enzymatic modification of xyloglucan oligosaccharides and controlled radical polymerization MADIX of vinylic monomers: acrylamide (Am), vinyl acetate (AcV), N-vinyl-2-pyrrolidone (NVP). The starting from strategy consists in MADIX controlled radical polymerization of a vinylic monomer starting from a modified oligosaccharide bearing one/two polymerizable group(s). The coupling onto strategy consists in a coupling by click chemistry between vinylic polymer obtained by controlled radical polymerization of a chain transfer agent bearing an azide function and a modified oligosaccharide bearing an alkyne function. Four families of hybrid block copolymers were thus obtained (XG-b-PAm, PAm-b-XG-b-PAm, XG-b-PAcV, XG-b-PNVP). A previous physic-chemical study in solution of these copolymers has also been achieved suggesting the formation of polymersomes.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF