Regulation of osteoblast differentiation

Bot is een dynamisch weefsel en wordt voortdurend afgebroken door osteoclasten, de botafbrekende cellen, terwijl de osteoblasten (botvormende cellen) vervolgens weer voor botaanmaak zorgen. Osteoporose, ook wel botontkalking genoemd, is een skeletziekte die wordt gekarakteriseerd door een lage botmassa en het verlies van botstructuur. Dit leidt tot een verhoogde kans op botbreuken. Osteoporose wordt veroorzaakt doordat de botafbraak door de osteoclasten groter is dan de botaanmaak door osteoblasten Tot nu toe zijn medicijnen tegen osteoporose vooral gericht op het remmen van de botafbraak (zoals bijvoorbeeld bisphosphonaten). Al eerder verloren gegaan bot kan nog niet worden hersteld. Daarom wordt nu gezocht naar medicijnen die de botvorming kunnen stimuleren. Een van de potenti_le kandidaten is het parathyroid hormoon (PTH) en het gerelateerde eiwit (PTHrP). PTH is een bekende stimulator van botafbraak, maar als PTHrP of PTH in lage doseringen met tussenpozen wordt gegeven dan stimuleert het juist de botvorming. Hoe deze tegenstrijdige effecten van PTHrP en PTH tot stand komen is nog niet bekend. Om het werkingsmechanisme van PTHrP en PTH te onderzoeken en om andere nieuwe anabole medicijnen te ontwikkelen is een betere kennis van de botvormende cel, de osteoblast noodzakelijk. Doel van het onderzoek Het doel van het onderzoek beschreven in dit proefschrift was om verschillende aspecten van osteoblast differentiatie te bestuderen. Osteoblast differentiatie is het ontwikkelingsproces van voorlopercellen, de mesenchymale stamcellen, tot osteoblasten. In dit proefschrift is als model de KS483 cellijn gebruikt. KS483 cellen kunnen differentiëren van een voorlopercel tot een osteoblast, een vetcel (adipocyte) of een kraakbeencel (chondrocyte) afhankelijk van het gebruikte medium en de kweekomstandigheden. De differentiatie van KS483 cellen naar osteoblasten duurt 18 dagen en is verdeeld in verschillende fases. Eerst vermenigvuldigen de cellen zich (proliferatie fase), daarna wordt er een botmatrix gemaakt (matrix productie en maturatie fase) waarna deze matrix verkalkt (mineralisatie fase) Tijdens het differentiatieproces van voorlopercel naar gespecialiseerde cel heeft de voorlopercel signalen nodig om te weten hoe hij zich moet ontwikkelen (figuur 2). Voor de differentiatie naar osteoblast zijn er verschillende signaalroutes belangrijk waaronder de BMP, Hedgehog (Hh) en Wnt/b-catenine routes. Daarnaast zijn RunX2 en osterix essenti_le transcriptiefactoren voor osteoblast differentiatie. Zonder deze transcriptiefactoren is er geen differentiatie naar osteoblasten mogelijk. In dit proefschrift hebben we de effecten en de regulatie van deze belangrijke signaalroutes tijdens osteoblast differentiatie geanalyseerd. Daarnaast hebben we ook gekeken naar de interactie van deze routes met PTHrP en PTH. BMP signaalroute In hoofdstuk 2 zijn de effecten van de BMP signaalroute op osteoblast differentiatie beschreven. Tijdens alle differentiatie fases komen verschillende BMPs, BMP receptoren, intracellulaire signaalmoleculen (Smads) en BMP antagonisten tot expressie. Om na te gaan wat de mogelijke rol van BMP signalering tijdens osteoblast differentiatie is, werden BMPs weggevangen door BMP antagonisten toe te dienen. De BMP antagonisten blokkeerden osteoblast differentiatie, wat werd bepaald door de activiteit van alkalische fosfatase (ALP), een osteoblast marker, en de hoeveelheid mineraal in de extracellulaire matrix te meten. Uit deze experimenten bleek dat de productie van BMPs door de osteoblast noodzakelijk is tijdens het gehele differentiatieproces. De behandeling van KS483 cellen met BMPs resulteerde in stimulatie van ALP activiteit en de hoeveelheid mineraal tijdens alle fases van osteoblast differentiatie, wat suggereert dat BMPs niet alleen belangrijk zijn voor de initiatie van de differentiatie, maar ook voor de matrix productie en mineralisatie. Hedgehog signaalroute Een rol voor de Hedgehog (Hh) signaalroute tijdens osteoblast differentiatie was eerder aangetoond in een studie waarin Hh de initiatie van osteoblast differentiatie in de botkoker stimuleerde. In hoofdstuk 3 wordt de rol van Hedgehog tijdens matrix productie en mineralisatie en het werkingsmechanisme beschreven. Eerst is de expressie (hoeveelheid mRNA) van Indian Hh (IHh), de botspecifieke Hh, de Hh receptoren (Ptc1 en Smo) en de intracellulaire signaalmoleculen (Gli__s) bestudeerd. De expressie van IHh, Gli1 en Ptc1 was verhoogd tijdens de matrix maturatie fase, terwijl de expressie van de andere moleculen gelijk bleef. IHh expressie werd ook gevonden in de osteoblasten in de humerus van een groeiend humaan skelet. Behandeling van de KS483 cellen met Hh eiwit resulteerde in een matig verhoogde ALP activiteit, terwijl de mineralisatie sterk werd gestimuleerd. Deze effecten werden geremd door de Hh antagonist cyclopamine, dat op zichzelf geen effect had op de differentiatie. Vervolgens werd bepaald tijdens welke fase van osteoblast differentiatie de Hh signaleringsroute belangrijk is. Uit deze experimenten bleek dat voorlopercellen reageerden op Hh, terwijl osteoblasten niet konden worden gestimuleerd. De Hh ge_nduceerde differentiatie werd compleet geremd door toedienen van BMP antagonisten, wat suggereert dat Hh signalering afhankelijk is van functionele BMP signalering. Toedienen van Hh en BMPs aan KS483 cellen resulteerde in synergistisch verhoogde ALP activiteit en mineralisatie. Experimenten toonden aan dat deze synergie op het niveau van de vroege Hh signaal transductie lag, en niet op het niveau van vroege BMP signalering. Hh stimuleerde niet alleen de osteoblast differentiatie, maar remde ook de differentiatie naar adipocyte. Deze data suggereren dat Hh signalering de ontwikkeling van voorlopercellen naar osteoblast stimuleert ten koste van de vetcelvorming. Een andere rol van Hh is de stimulatie van maturatie van vroege osteoblasten. Wnt/b-catenine signaalroute Een belangrijke rol voor de Wnt/b-catenine signaalroute in botvorming is recent aangetoond. Een aantal studies hebben laten zien dat Wnt/b-catenine signalering de proliferatie en differentiatie van osteoblasten stimuleert. In hoofdstuk 5, hebben we de rol van Wnt/b-catenine signalering tijdens matrix vorming en mineralisatie nader bestudeerd. Het toedienen van Wnt3A of LiCl, een stimulator van de Wnt/b-catenine route, aan KS483 cellen had geen enkel effect op de initiatie van de differentiatie, wat suggereert dat de Wnt/b-catenine signalering al maximaal aanstaat in deze cellen. Dit bleek ook uit experimenten met de Wnt antagonist Dkk-1, waarin toediening van Dkk-1 de initiatie van osteoblast differentiatie remde. Behandeling van KS483 cellen met Wnt3A of LiCl resulteerde in een remming van matrix mineralisatie. LiCl remde ook de mineralisatie van muizen beenmerg cellen. Opvallend was dat Wnt3A alleen in vroege osteoblasten de Wnt/b-catenine signaalroute kon aanzetten, terwijl LiCl dit kon in alle stadia van differentiatie. Dit zou kunnen komen door verlaagde expressie van Wnt receptoren, of door verhoogde expressie van Wnt antagonisten in volwassen osteoblasten. Experimenten toonden aan dat de expressie van Wnt receptoren niet veranderde tijdens osteoblast differentiatie, terwijl de expressie van de Wnt antagonisten juist werd ge_nduceerd. Dit zou kunnen betekenen dat de Wnt antagonisten Dkk-1 en Dkk-2 Wnt/b-catenine signalering remmen, wat noodzakelijk is voor mineralisatie van de matrix. Om dit te onderzoeken, werden stabiele KS483 cellijnen gemaakt waarin Dkk-1 of Dkk-2 expressie sterk werd verminderd (Dkk-1si en Dkk-2si). Differentiatie en cel proliferatie waren geremd in de Dkk-2si, terwijl mineralisatie was geremd in Dkk-1si en Dkk-2si. Samenvattend: remming van de Wnt/b-catenine signalering door inductie van de expressie van de antagonisten Dkk-1 en Dkk-2 is essentieel voor matrix mineralisatie. Werkingsmechanisme van PTH en PTHrP In hoofdstuk 6 laten we zien dat PTHrP en PTH de differentiatie van voorlopercel naar osteoblast remt, onafhankelijk van de dosering, tijd van toevoegen of de differentiatie status van de cel. Deze remming zou kunnen plaatsvinden doordat PTHrP belangrijke signaalroutes voor osteoblast differentiatie remt of doordat PTHrP osteoblast specifieke transcriptiefactoren remt. Deze remming kan plaatsvinden op allerlei niveaus, zoals (1) remming van de expressie van factoren in de BMP of Hh signaalroutes, (2) remming van de signalering van deze signaalroutes of (3) remming van de expressie of activiteit van de transcriptiefactoren RunX2 en Osterix. Om na te gaan of PTHrP osteoblast differentiatie kon remmen door de BMP route te blokkeren hebben we BMPs en PTHrP toegediend aan KS483 cellen. PTHrP kon inderdaad de BMP ge_nduceerde osteoblast differentiatie remmen en omgekeerd. Uit andere experimenten bleek echter dat deze remming waarschijnlijk indirect is. PTHrP zou ook een remmend effect kunnen hebben op osteoblast differentiatie door de Hh route te onderdrukken. Interacties tussen PTHrP en de Hh route waren al eerder beschreven in de groeischijf. PTHrP kon de Hh ge_nduceerde osteoblast differentiatie remmen en omgekeerd kon hedgehog het effect van PTHrP opheffen. Een van de oorzaken hiervan kan zijn dat in ongedifferentieerde cellen PTHrP de expressie van componenten van de Hh signaal route kon remmen. KSFrt model systeem In hoofdstuk 4 hebben we een model gemaakt waarbij KS483 cellen kunnen worden gebruikt om gemakkelijk en reproduceerbaar stabiele cellijnen te maken door middel van plaats specifieke homologe recombinatie. Daarvoor werd een unieke FRT site ge_ntroduceerd in het genoom (DNA) van de KS483 cellen, waardoor de KSFrt cellijnen ontstonden. Deze FRT site werd vervolgens gebruikt om genen te introduceren in het genoom in combinatie met positieve selectie door middel van een verandering in resistentie tegen antibiotica. Het voordeel van dit systeem is, dat er altijd __n kopie van het gen terechtkomt op dezelfde plek in het genoom. In de KSFrt cellen kunnen bepaalde genen worden ge_ntroduceerd en kan de expressie van genen worden verhoogd. De expressie van genen kan ook sterk worden verminderd door middel van RNA interference (RNAi). Daarvoor is een nieuwe RNAi vector gemaakt waarbij met de introductie van een kopie van de RNAi vector de expressie van een gen voldoende kan worden geremd. Dit model kan worden gebruikt om allerlei (onbekende) genen te introduceren, of juist de expressie van bepaalde genen te verminderen, en vervolgens de effecten te bekijken op de differentiatie naar osteoblast, adipocyte of chondrocyte. Deze studies kunnen als uitgangspunt worden gebruikt voor de ontwikkeling van medicijnen die specifiek op de osteoblast zijn gerichtUBL - phd migration 201

Metastasis of prostate cancer and melanoma cells in a preclinical in vivo mouse model is enhanced by L-plastin expression and phosphorylation

BACKGROUND: Tumor cell migration and metastasis require dynamic rearrangements of the actin cytoskeleton. Interestingly, the F-actin cross-linking and stabilizing protein L-plastin, originally described as a leukocyte specific protein, is aberrantly expressed in several non-hematopoietic malignant tumors. Therefore, it has been discussed as a tumor marker. However, systematic in vivo analyses of the functional relevance of L-plastin for tumor cell metastasis were so far lacking. METHODS: We investigated the relevance of L-plastin expression and phosphorylation by ectopical expression of L-plastin in human melanoma cells (MV3) and knock-down of endogenous L-plastin in prostate cancer (PC3M). The growth and metastatic potential of tumor cells expressing no L-plastin, phosphorylatable or non-phosphorylatable L-plastin was analyzed in a preclinical mouse model after subcutaneous and intracardial injection of the tumor cells. RESULTS: Knock-down of endogenous L-plastin in human prostate carcinoma cells led to reduced tumor cell growth and metastasis. Vice versa, and in line with these findings, ectopic expression of L-plastin in L-plastin negative melanoma cells significantly increased the number of metastases. Strikingly, the metastasis promoting effect of L-plastin was not observed if a non-phosphorylatable L-plastin mutant was expressed. CONCLUSIONS: Our data provide the first in vivo evidence that expression of L-plastin promotes tumor metastasis and, importantly, that this effect depends on an additionally required phosphorylation of L-plastin. In conclusion, these findings imply that for determining the importance of tumor-associated proteins like L-plastin a characterization of posttranslational modifications is indispensable

BMP-7 inhibits TGF-β-induced invasion of breast cancer cells through inhibition of integrin β3 expression

BACKGROUND The transforming growth factor (TGF)-β superfamily comprises cytokines such as TGF-β and Bone Morphogenetic Proteins (BMPs), which have a critical role in a multitude of biological processes. In breast cancer, high levels of TGF-β are associated with poor outcome, whereas inhibition of TGF-β-signaling reduces metastasis. In contrast, BMP-7 inhibits bone metastasis of breast cancer cells. METHODS In this study, we investigated the effect of BMP-7 on TGF-β-induced invasion in a 3 dimensional invasion assay. RESULTS BMP-7 inhibited TGF-β-induced invasion of the metastatic breast cancer cell line MCF10CA1a, but not of its premalignant precursor MCF10AT in a spheroid invasion model. The inhibitory effect appears to be specific for BMP-7, as its closest homolog, BMP-6, did not alter the invasion of MCF10CA1a spheroids. To elucidate the mechanism by which BMP-7 inhibits TGF-β-induced invasion, we analyzed invasion-related genes. BMP-7 inhibited TGF-β-induced expression of integrin α(v)β(3) in the spheroids. Moreover, targeting of integrins by a chemical inhibitor or knockdown of integrin β(3) negatively affected TGF-β-induced invasion. On the other hand, overexpression of integrin β(3) counteracted the inhibitory effect of BMP7 on TGF-β-induced invasion. CONCLUSION Thus, BMP-7 may exert anti-invasive actions by inhibiting TGF-β-induced expression of integrin β(3).Prostatic carcinom

An ex vivo Tissue Culture Model for the Assessment of Individualized Drug Responses in Prostate and Bladder Cancer

Urological malignancies, including prostate and bladder carcinoma, represent a major clinical problem due to the frequent occurrence of therapy resistance and the formation of incurable distant metastases. As a result, there is an urgent need for versatile and predictive disease models for the assessment of the individualized drug response in urological malignancies. Compound testing on ex vivo cultured patient-derived tumor tissues could represent a promising approach. In this study, we have optimized an ex vivo culture system of explanted human prostate and bladder tumors derived from clinical specimens and human cancer cell lines xenografted in mice. The explanted and cultured tumor slices remained viable and tissue architecture could be maintained for up to 10 days of culture. Treatment of ex vivo cultured human prostate and bladder cancer tissues with docetaxel and gemcitabine, respectively, resulted in a dose-dependent anti-tumor response. The dose-dependent decrease in tumor cells upon administration of the chemotherapeutic agents was preceded by an induction of apoptosis. The implementation and optimization of the tissue slice technology may facilitate the assessment of anti-tumor efficacies of existing and candidate pharmacological agents in the complex multicellular neoplastic tissues from prostate and bladder cancer patients. Our model represents a versatile “near-patient” tool to determine tumor-targeted and/or stroma-mediated anti-neoplastic responses, thus contributing to the field of personalized therapeutics

Adenomatous polyposis coli-mediated control of β-catenin is essential for both chondrogenic and osteogenic differentiation of skeletal precursors

Background: During skeletogenesis, protein levels of β-catenin in the canonical Wnt signaling pathway determine lineage commitment of skeletal precursor cells to osteoblasts and chondrocytes. Adenomatous polyposis coli (Apc) is a key controller of β-catenin turnover by down-regulating intracellular levels of β-catenin. Results: To investigate whether Apc is involved in lineage commitment of skeletal precursor cells, we generated conditional knockout mice lacking functional Apc in Col2a1-expressing cells. In contrast to other models in which an oncogenic variant of β-catenin was used, our approach resulted in the accumulation of wild type β-catenin protein due to functional loss of Apc. Conditional homozygous Apc mutant mice died perinatally showing greatly impaired skeletogenesis. All endochondral bones were misshaped and lacked structural integrity. Lack of functional Apc resulted in a pleiotropic skeletal cell phenotype. The majority of the precursor cells lacking Apc failed to differentiate into chondrocytes or osteoblasts. However, skeletal precursor cells in the proximal ribs were able to escape the noxious effect of functional loss of Apc resulting in formation of highly active osteoblasts. Inactivation of Apc in chondrocytes was associated with dedifferentiation of these cells. Conclusion: Our data indicate that a tight Apc-mediated control of β-catenin levels is essential for differentiation of skeletal precursors as well as for the maintenance of a chondrocytic phenotype in a spatio-temporal regulated manner

Spontaneous development of Epstein-Barr Virus associated human lymphomas in a prostate cancer xenograft program

Prostate cancer research is hampered by the lack of in vivo preclinical models that accurately reflect patient tumour biology and the clinical heterogeneity of human prostate cancer. To overcome these limitations we propagated and characterised a new collection of patient-derived prostate cancer xenografts. Tumour fragments from 147 unsupervised, surgical prostate samples were implanted subcutaneously into immunodeficient Rag2-/-γC-/- mice within 24 hours of surgery. Histologic and molecular characterisation of xenografts was compared with patient characteristics, including androgen-deprivation therapy, and exome sequencing. Xenografts were established from 47 of 147 (32%) implanted primary prostate cancers. Only 14% passaged successfully resulting in 20 stable lines; derived from 20 independent patient samples. Surprisingly, only three of the 20 lines (15%) were confirmed as prostate cancer; one line comprised of mouse stroma, and 16 were verified as human donor-derived lymphoid neoplasms. PCR for Epstein-Barr Virus (EBV) nuclear antigen, together with exome sequencing revealed that the lymphomas were exclusively EBV-associated. Genomic analysis determined that 14 of the 16 EBV+ lines had unique monoclonal or oligoclonal immunoglobulin heavy chain gene rearrangements, confirming their B-cell origin. We conclude that the generation of xenografts from tumour fragments can commonly result in B-cell lymphoma from patients carrying latent EBV. We recommend routine screening, of primary outgrowths, for latent EBV to avoid this phenomenon

The aldehyde dehydrogenase enzyme 7A1 is functionally involved in prostate cancer bone metastasis

High aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity can be used to identify tumor-initiating and metastasis-initiating cells in various human carcinomas, including prostate cancer. To date, the functional importance of ALDH enzymes in prostate carcinogenesis, progression and metastasis has remained elusive. Previously we identified strong expression of ALDH7A1 in human prostate cancer cell lines, primary tumors and matched bone metastases. In this study, we evaluated whether ALDH7A1 is required for the acquisition of a metastatic stem/progenitor cell phenotype in human prostate cancer. Knockdown of ALDH7A1 expression resulted in a decrease of the α2hi/αvhi/CD44+ stem/progenitor cell subpopulation in the human prostate cancer cell line PC-3M-Pro4. In addition, ALDH7A1 knockdown significantly inhibited the clonogenic and migratory ability of human prostate cancer cells in vitro. Furthermore, a number of genes/factors involved in migration, invasion and metastasis were affected including transcription factors (snail, snail2, and twist) and osteopontin, an ECM molecule involved in metastasis. Knockdown of ALDH7A1 resulted in decreased intra-bone growth and inhibited experimentally induced (bone) metastasis, while intra-prostatic growth was not affected. In line with these observations, evidence is presented that TGF-β, a key player in cancer invasiveness and bone metastasis, strongly induced ALDH activity while BMP7 (an antagonist of TGF-β signaling) down-regulated ALDH activity. Our findings show, for the first time, that the ALDH7A1 enzyme is functionally involved in the formation of bone metastases and that the effect appeared dependent on the microenvironment, i.e., bone versus prostate

Preclinical imaging of the cellular and molecular events in the multistep process of bone metastasis

Urolog

The Identification of Small Molecule Inhibitors That Reduce Invasion and Metastasis of Aggressive Cancers

Contains fulltext : 231433.pdf (publisher's version ) (Open Access