Multiplex Real-Time PCR in Bovine Mastitis Diagnostics

Mastitis is the most common and economically damaging production disease of dairy cows. In the majority of cases it is induced by intramammary infection with a pathogen. Identification of mastitis-causing pathogens enables treatments to be targeted appropriately, avoiding unnecessary antimicrobial treatments, and enabling design of the best possible herd level management protocols. Diagnosis of bovine IMI has been traditionally based on microbial culture of aseptically taken quarter milk samples. Due to the requirements of modern dairy production and development of molecular technologies, milk samples can be examined for target pathogens with DNA-based methods such as multiplex real-time PCR assays. Despite several years of routine use of PCR assays in some countries, scientific knowledge concerning interpretation of the results is sparse. This dissertation focuses on providing new information for diagnosing bovine mastitis using multiplex real-time PCR. In order to accomplish that, first a commercial multiplex real-time PCR assay was compared with the current reference method, conventional culture (I). It showed that PCR was a reliable diagnostic method for Staphylococcus aureus, but less reliable for diagnosing true non-aureus staphylococci infections. In an experimental challenge study (IV), elimination of Staphylococcus epidermidis and S. simulans was followed with PCR in addition to conventional culture. The results showed that PCR yielded target-positive results for several days after the culture results were negative. Subsequently, the time of sampling related to the onset of inflammation may be of importance when interpreting the PCR results. Secondly, quarters with suspected mastitis were sampled using two experimental techniques, in addition to the conventional aseptic technique (II, III), and examined with multiplex real-time PCR. In the needle technique, the whole teat and teat area were bypassed. With the cannula technique, the teat orifice and the teat canal were bypassed. The results showed that samples taken with alternative techniques were of better hygienic quality. We also reported that over half of the non-aureus staphylococci findings in our PCR results originated from sites other than the mammary gland. A diagnosis of a true IMI or mastitis, with possible outcome of an antimicrobial treatment course for the animal, cannot be based solely on a PCR result, but must be combined with all the available information about a cow`s history, symptoms, changes in milk and indicators of inflammation. Some microbes detected with PCR can be considered to be contaminants, especially when present with low levels of DNA. If the signs of the cow or the degree of udder inflammation do not fit the usual signs caused by the pathogen detected, the possibility of contamination should be considered.Lypsylehmien yleisin ja kallein tuotannollinen sairaus on utaretulehdus. Lypsylehmän elinympäristö on täynnä erilaisia mikrobeja ja yleisin syy utaretulehdukselle on yhden mikrobilajin aiheuttama infektio utareneljänneksessä. Tulehdusta aiheuttavat mikrobit tulee tunnistaa luotettavasti ja nopeasti, jota voidaan arvioida hoitotarve, kohdistaa hoito oikein ja välttää turhia antibioottikuureja. Utaretulehdusten aiheuttajista muodostuu ajan kuluessa tilakohtaista tietokantaa, jota käytetään apuna utareterveyden hallinta- ja utaretulehduksen ennaltaehkäisysuunnitelmissa. Utaretulehdusten diagnosoinnin viitemenetelmä on bakteeriviljely. Viljelyssä tulehdusten aiheuttajat tunnistetaan ottamalla aseptinen neljänneskohtainen maitonäyte ja viljelemällä maitoa erilaisille kasvatusalustoille. Bakteerien lajitunnistus perustuu niiden ulkonäköön, kasvuun tietyillä alustoilla ja kemiallisiin reaktioihin. Viljelyssä nähdään aina vain elinkelpoisia bakteereita. Tällöin voidaan olettaa, että ne pystyvät myös aiheuttamaan taudin. Lisäksi bakteerikantoja on voitu tallettaa tutkimuskäyttöön. Näytteiden käsittely, kuljetus ja tulehdusmaito itsessään tuovat omat haasteensa viljelyn onnistumiseen. Selvästi sairaastakin utareneljänneksestä peräisin olevan maitonäytteen viljelytulos voi usein olla negatiivinen. Lisäksi lajitunnistus kestää kuljetukseen kuluvan ajan lisäksi vähintään kaksi vuorokautta, joka on pitkä aika odottaa tulosta ja sen mukaisia toimenpiteitä nykyaikaisilla, tehokkuuteen pyrkivillä tiloilla. Modernit, molekyylibiologiaan perustuvat menetelmät tulivat bakteeriviljelyn rinnalle 2000-luvun alussa. Yleisin Suomessa käytetty menetelmä on PCR (polymerase chain reaction), jossa reaaliaikaisesti voidaan tunnistaa jopa viisitoista eri utaretulehduksen taudinaiheuttajaa. PCR perustuu tietyn, kullekin bakteerille ominaisen geenin monistamiseen suoraan maidosta, ilman viljelyä. Jos maitonäyte sisältää kohdebakteerin DNA:ta, sen monistumisen aiheuttama fluoresenssi voidaan havaita tietyllä aallonpituudella. Mitä nopeammin monistuminen havaitaan, sitä enemmän kyseistä bakteeri-DNA:ta näytteessä on. Maitonäytteeseen voidaan lisätä säilöntäainetta, mikä helpottaa kuljetusta. PCR on nopea ja objektiivinen testi. Lajitunnistus on erittäin tarkkaa, mutta bakteerin elinvoimaisuudesta ei voida tehdä päätelmiä. Suomessa PCR-testi (PathoProofTM Mastitis PCR Assay) on ollut utaretulehdusdiagnostiikan rutiinimenetelmä jo vuodesta 2010, mutta tieteelliseen tietoon perustuvia ohjeita tulosten tulkinnasta ei ole ollut saatavilla. Tämän väitöskirjan tarkoituksena oli tuoda uutta tietoa helpottamaan PCR-tulosten tulkintaa naudan utaretulehdusdiagnostiikassa. Tämä tehtiin vertailemalla PCR:ää ja perinteistä viljelyä, sekä tutkimalla, kuinka erilaiset näytteenottotekniikat vaikuttavat PCR-tuloksiin. Ensimmäisessä, PCR- ja viljelytuloksia vertailevassa tutkimuksessa todettiin, että verrattuna perinteiseen viljelyyn, PCR on luotettava menetelmä Staphylococcus aureuksen tunnistamiseen puhtaasti otetusta maitonäytteestä. Tulosten perusteella suosittelimme, että pienetkin määrät S. aureus DNA:ta tulisi huomioida näytetuloksissa. Sen sijaan muiden stafylokokkien (non-aureus staphylocci, NAS, tai koagulaasi-negatiiviset stafylokokit) osalta vähäinen määrä tunnistettua DNA:ta ei välttämättä ole kliinisesti merkittävä löydös. PCR-paneelin todettiin olevan riittävän kattava rutiinikäyttöön. Viljelyä ja PCR tuloksia verrattiin myös väitöskirjan neljännessä osassa, jossa kahden eri stafylokokkilajin poistumista utareneljänneksestä seurattiin kahden viikon jaksoissa. PCR-tulokset olivat positiivisia vielä useita päiviä sen jälkeen, kun neljännes oli todettu perinteisen viljelyn avulla parantuneeksi. PCR-tuloksen luotettavuus oli paras, jos näyte otettiin heti tulehduksen akuutissa vaiheessa. Tulehduksen loppuvaiheessa positiivinen PCR-tulos voi olla peräisin jo kuolleesta, poistuvasta bakteerimassasta. Tutkielman toisessa ja kolmannessa osassa vertailtiin näytteenottotekniikan vaikutusta PCR-tuloksiin. Perinteisen, aseptisen maitonäytteenottotekniikan lisäksi käytimme kokeellisia neula- ja kanyylimenetelmiä. Kanyylinäytteenotossa vedinkanava ohitettiin kokonaan steriilin kanyylin avulla. Neulanäyte otettiin ohuella neulalla suoraan maitokammiosta, jolloin koko vedin ja sen alue ohitettiin. Kokeellisesti otetut näytteet sisälsivät vähemmän lajeja per näyte ja olivat siten hygieeniseltä laadultaan parempia kuin perinteisesti otetut näytteet. Vetimen alueelta näytteeseen joutuneet bakteerit esiintyivät tuloksissa pääosin vähäisillä DNA-määrillä. Jos vakavina taudinaiheuttajina pidettyjä bakteereita (kuten Streptococcus uberis, Str. dysgalactiae ja S. aureus) havaittiin sekä vaihtoehtoisella että perinteisellä menetelmällä otetuissa tuloksissa, niiden DNA-määrä oli suuri. Utaretulehdusdiagnoosi koostuu lehmän esitiedoista, tulehduksen voimakkuutta kuvaavasta soluluvusta, näkyvistä oireista sekä maitomuutoksista. Bakteerin laji ja määrä ovat diagnoosia täydentäviä tietoja, joiden todenmukaisuutta tulee peilata edellä mainittuihin seikkoihin. Näiden tietojen perusteella voidaan päättää lehmän mahdollisesta antibioottihoidosta tai muista toimenpiteistä. Etenkin PCR-pohjaisessa diagnostiikassa vaarana on, että epähygieenisesti otettu maitonäyte antaa kliinisesti merkityksettömän tai jopa virheellisen diagnoosin. Jos lehmän oireet ja saatu tulos eivät eläinlääkärin mielestä ole yhteneväisiä, näytteen likaantumisen riski sekä mahdollisuus jonkin PCR-paneelin ulkopuolisen mikrobin aiheuttamaan tulehdukseen tulee pitää mielessä. Suosittelemme, että uusintanäyte lähetetään tällöin perinteiseen viljelyyn

Vastakkainasettelusta tasapainoon: Rakenne ja lukija J. K. Rowlingin Harry Potter -fantasiaromaaneissa

Tutkielma käsittelee J.K. Rowlingin Harry Potter -fantasiaromaaneille ominaisia rakenteellisia yksityiskohtia ja sitä, kuinka nämä yksityiskohdat punoutuvat yhteen kokonaisen teossarjan juonen mahdollistavaksi kokonaisuudeksi lukijan näkökulmasta. Tutkielman pohjavireenä toimii kysymys lukijan immersiosta ja siitä, mitkä rakenteelliset tekijät efektin muodostumiseen vaikuttavat. Tutkielmassani väitän, ettei fantasiafiktiota voida automaattisesti lokeroida tiettyyn malliin, vaan myös genren alaisille teoksille on annettava mahdollisuus todistaa arvonsa yksilöllisinä kaunokirjallisina teoksina. Genremääritelmien sijaan keskitynkin tarkastelemaan Harry Potterien rakenteellisia piirteitä uniikkien yksityiskohtien kautta. Nämä yksityiskohdat merkityksellistyvät koko teossarjan kattavaksi monikerroksiseksi juonirakenteeksi, joka saa arvonsa teossarjan parissa aikaa viettäneen lukijan panoksesta. Siten lukijan näkökulma painottuu rakenteen tulkinnassa. Rakenteen yksityiskohdat motivoituvat temaattisesti toiminnan ja totuuden kaipuun ajatusten alaisuuteen. Fantasiafiktiolle ominainen toiminta ottaa paikkansa teoksen rakenteessa ajaen lukijaa kohti entistä dynaamisempaa lukuprosessia. Totuuden kaipuu puolestaan kokoaa yhteen teoksen kognitiivisen etenemisen aspektit. Lukuprosessin aikana nämä elementit henkilöityvät fantasian konvention mukaisesti teossarjan päähenkilöön Harryyn, mikä puolestaan mahdollistaa lukijan emotionaalisen responssin tekstiin ja siten vahvistaa tekstin rakenteen luomaa immersiivistä lukukokemusta. Tutkielman taustalla vaikuttavat kirjallisuudentutkimuksen formalistisen ja retorisen linjan perustekijät, kuten Boris Tomashevski, Wayne C. Booth ja James Phelan, mutta teksti sidotaan tiukasti keskusteluun nykypäivän (kognitiivisten) narratologien kanssa

Koagulaasinegatiivisten stafylokokkien aiheuttama utaretulehdus naudalla : kirjallisuuskatsaus ja patogeneesitutkimus kokeellisen infektiomallin avulla

Koagulaasinegatiivisia stafylokokkeja (KNS) on pidetty ja osittain pidetään edelleenkin vähäpätöisinä utaretulehdusta aiheuttavina bakteereina. Tämä on johtunut niiden aiheuttaman utaretulehduksen lievästä taudinkuvasta ja korkeasta paranemisprosentista, verrattuna esimerkiksi koagulaasipositiivisen Staphylococcus aureuksen aiheuttamaan utaretulehdukseen. Utaretulehdusdiagnostiikassa on näinollen tyydytty määrittämään KNS:t ainoastaan ryhmätasolle, ei lajitasolle. KNS:n esiintyvyys utaretulehdusten aiheuttajina on lisääntynyt jatkuvasti. Niistä on tullut Suomessa ja monessa muussakin maassa yleisimmin utaretulehdusnäytteistä eristetty taudinaiheuttaja. Joillakin tiloilla KNS:t ovat voineet muodostua jo karjaongelmaksikin. Tämä on herättänyt tutkijoiden ja karjanomistajien kiinnostuksen kyseistä bakteeriryhmää ja sen merkitystä kohtaan. Maidontuottajia KNS-bakteeriryhmä kiinnostaa eniten maidon laadun kannalta, koska KNS-tulehdus aiheuttaa muutoksia maidossa ja nostaa solulukua. KNS-tulehdukset ovat yleisimpiä ensikoilla, jotka ovat karjojen uudistumisen perusta. Kirjallisuuskatsauksessa perehdytään tämänhetkiseen tietoon KNS:n yleispiirteistä, niiden esiintyvyyteen, merkitykseen utaretulehduksen aiheuttajana, mikrobilääkeresistenssiin, etiologiaan ja taudinaiheutuskykyyn. Lisäksi käsitellään utareen puolustusmekanismeja sekä maidon tulehdusindikaattoreita. Kirjallisuuskatsauksen lopussa keskitytään KNS-tulehdusten hoitoon ja ehkäisyyn. Kokeellisessa osassa kuvataan tekemämme tartutuskoe, jossa kahdeksaan kerran poikineeseen lehmään tartutettiin peräkkäin S. epidermidis ja S. simulans. Tartutuksen jälkeen seurasimme mm. lehmien yleisoireita, maitomäärää, maidon solupitoisuutta sekä maidon entsyymiaktiivisuuksia. Koejärjestelyt perustuivat Simojoki ym. vuonna 2005 tekemään pilottikokeeseen. Kokeessa havaittiin eroavaisuuksia käyttämiemme KNS-lajien aiheuttamissa utaretulehduksissa. Tulosten perusteella voitiin todeta, että S. simulans aiheuttaa lehmälle voimakkaamman tulehdusvasteen kuin S. epidermidis. Lisätietoa eri KNS-lajien ominaisuuksista kaivataan edelleen ja uusia tutkimuksia julkaistaankin jatkuvasti. Jos tulevissa tutkimuksissa saadaan yhä enemmän todisteita KNS:n välisistä taudinaiheutuskyvyn eroista, epidemiologiasta sekä resistenssitilanteesta, uskon, että koagulaasinegatiivisia stafylokokkeja aletaan tyypittää lajitasolle asti. Lajitason tietämys mahdollistaisi yhä tehokkaampien utareterveyssuunnitelmien tekemisen KNS-tartuntojen ehkäisyä varten sekä yksityiskohtaisempien hoito-ohjeiden antamisen

Bovine milk microbiome : a more complex issue than expected

Abstract The aim of this study was to analyze bacterial profiles of bovine mastitic milk samples and samples from healthy quarters using Next Generation Sequencing of amplicons from 16S rRNA genes and to compare results with microbiological results by PCR assays of the same samples. A total of 49 samples were collected from one single dairy herd during the same day. The samples were divided in two sample sets, which were used in this study. The DNA extraction as well as the library preparation and sequencing of these two sets were performed separately, and results of the two datasets were then compared. The vast majority of genera detected appeared with low read numbers and/or in only a few samples. Results of PCR and microbiome analyses of samples infected with major pathogens Staphylococcus aureus or Streptococcus uberis were consistent as these genera also covered the majority of reads detected in the microbiome analysis. Analysis of alpha diversity revealed a much higher species richness in set 1 than in set 2. The dominating bacterial genera with the highest read numbers clearly differed between datasets, especially in PCR negative samples and samples positive for minor pathogens. In addition to this, linear discriminant analysis (LDA) was conducted between the two sets to identify significantly different genera/family level microbes. The genus Methylobacterium was much more common in set 2 compared to set 1, and genus Streptococcus more common in set 1. Our results indicate amplification of contaminating bacteria in excess in samples with no or minor amounts of pathogen DNA in dataset 2. There is a need for critical assessment of results of milk microbiome analyses

Prevalence of subclinical mastitis in Finnish dairy cows : changes during recent decades and impact of cow and herd factors

Background: The dairy industry has undergone substantial structural changes as intensive farming has developed during recent decades. Mastitis continues to be the most common production disease of dairy cows. Nationwide surveys of mastitis prevalence are useful in monitoring udder health of dairy herds and to study the impact of structural changes on the dairy industry. This survey on bovine subclinical mastitis was the first based on cow composite milk somatic cell count (SCC) data from the Finnish national health monitoring and milk recording database. A cow with composite milk SCC = 200,000 cells/ml in at least one of the four test milkings during the year was considered to have subclinical mastitis and a cow with composite milk SCC = 200,000 cells/ml in three or in all four test milkings during the year to have chronic subclinical mastitis. The aim of the study was to determine the prevalence of subclinical mastitis and chronic subclinical mastitis in Finland in 1991, 2001 and 2010 and to investigate cow and herd factors associated with elevated SCC. Results: Prevalence of subclinical mastitis in Finland decreased over recent decades from 22.3% (1991) and 20.1% (2001) to 19.0% (2010). Prevalence of chronic subclinical mastitis was 20.4% in 1991, 15.5% in 2001 and 16.1% in 2010. The most significant cow and herd factors associated with subclinical mastitis or high milk SCC were increasing parity, Holstein breed, free- stalls with an automatic milking system and organic production. Milk SCC were highest from July to September. Main factors associated with chronic mastitis were increasing parity and Holstein breed. Conclusions: Prevalence of subclinical mastitis in Finland decreased over recent decades, the greatest change taking place during the first decade of the study. Prevalence of chronic subclinical mastitis significantly decreased from 1991. The most significant factors associated with both types of mastitis were increasing parity and Holstein breed, and for subclinical mastitis also free-stalls with automatic milking. National surveys on mastitis prevalence should be carried out at regular intervals to monitor udder health of dairy cows and to study the impact of the ongoing structural changes in the dairy industry to enable interventions related to udder health to be made when needed.Peer reviewe

Bacteriological etiology and treatment of mastitis in Finnish dairy herds

Background: The Finnish dairy herd recording system maintains production and health records of cows and herds. Veterinarians and farmers register veterinary treatments in the system. Milk samples for microbiological analysis are routinely taken from mastitic cows. The laboratory of the largest dairy company in Finland, Valio Ltd., analyzes most samples using real-time PCR. This study addressed pathogen-specific microbiological data and treatment and culling records, in combination with cow and herd characteristics, from the Finnish dairy herd recording system during 2010-2012. Results: The data derived from 240,067 quarter milk samples from 93,529 dairy cows with mastitis; 238,235 cows from the same herds served as the control group. No target pathogen DNA was detected in 12% of the samples. In 49% of the positive samples, only one target species and in 19%, two species with one dominant species were present. The most common species in the samples with a single species only were coagulase-negative staphylococci (CNS) (43%), followed by Staphylococcus aureus (21%), Streptococcus uberis (9%), Streptococcus dysgalactiae (8%), Corynebacterium bovis (7%), and Escherichia coli (5%). On average, 36% of the study cows and 6% of the control cows had recorded mastitis treatments during lactation. The corresponding proportions were 16 and 6% at drying-off. For more than 75% of the treatments during lactation, diagnosis was acute clinical mastitis. In the milk samples from cows with a recorded mastitis treatment during lactation, CNS and S. aureus were most common, followed by streptococci. Altogether, 48% of the cows were culled during the study. Mastitis was reported as the most common reason to cull; 49% of study cows and 18% of control cows were culled because of mastitis. Culling was most likely if S. aureus was detected in the milk sample submitted during the culling year. Conclusions: The PCR test has proven to be an applicable method also for large-scale use in bacterial diagnostics. In the present study, microbiological diagnosis was unequivocal in the great majority of samples where a single species or two species with one dominating were detected. Coagulase-negative staphylococci and S. aureus were the most common species. S. aureus was also the most common pathogen among the culled cows, which emphasizes the importance of preventive measures.Peer reviewe

Akuutti paikallinen alaselkäkipu paranee hyvin : kotihoito-opas akuutin, epäspesifin alaselkäkivun hoitoon

Opinnäytetyön tarkoituksena on tuottaa akuuttia epäspesifiä alaselkäkipua käsitte-levä kotihoito-opas yhteistyössä Kouvolan manuaalinen terapia -yrityksen ja OMT-fysioterapeutti Tuija Mänttärin kanssa. Tavoitteena on saada opas suoraan työelämän käyttöön. Tarve kotihoito-oppaalle oli noussut esille Kouvolan manuaalisessa terapiassa jo ennen opinnäytetyöprosessin alkamista ja meille tarjottiin mahdollisuutta tuottaa opas opinnäytetyönämme. Kotihoito-opas on suunnattu ensisijaisesti Kouvolan manuaalinen terapia -yrityksen asiakkaille. Kotihoito-opas toimii kuntoutumisen tukena yhdessä fysioterapeutin antaman ohjeistuksen kanssa. Tarkoituksena on antaa kotihoito-opas asiakkaalle fysioterapian ensikäynnin yhteydessä, jotta asiakkaan on helpompi ymmärtää ja omaksua fysioterapeutin antamaa tietoa. Kotihoito-oppaan avulla jaetaan tietoa akuutista epäspesifistä alaselkäkivusta ja sen hoitomuodoista sekä pyritään motivoimaan asiakasta aktiiviseen kuntoutumiseen. Kotihoito-oppaassa käsitellään tiiviisti ja selkeästi lannerangan toimintaa, fysioterapian hoitokeinoja, kotihoitokeinoja, jatkohoitosuosituksia selkävaivan uusiutuessa sekä muutamia harjoitteita. Kotihoito-opas perustuu opinnäytetyön teoriaosuuteen. Oppaan visuaalisen ilmeen on toteuttanut graafisen suunnittelun opiskelija Janne Kuisma. Tuotteistamisprosessi ohjasi opinnäytetyön etenemistä. Prosessin pohjana toimi Jämsän ja Mannisen (2001) esittelemä malli osaamisen tuotteistamisesta sosiaali- ja terveysalalla. Opinnäytetyön teoriaosuudessa perustellaan kotihoito-oppaan sisältöä ja kuvataan tarkasti tuotteistamisprosessin eteminen. Työssä käsitellään kirjallisuudessa ja tutkimuksissa esiteltyä tietoa alaselän anatomiasta ja toiminnasta, akuutista epäspesifistä alaselkäkivusta ja sen hoitokeinoista sekä harjoitteista.The purpose of this Bachelor`s thesis was to produce a home care guidebook about the acute nonspecific low back pain. The guide is produced in cooperation with the manual therapy of Kouvola and OMT-therapist Tuija Mänttäri. The goal was to get the guidebook straight into use in real working conditions. A need for a home care guidebook had already emerged in the manual therapy of Kouvola before the process of writing our Bachelor`s thesis had begun. Therefore, we were offered the opportunity to produce the guidebook as a product of this bachelor`s thesis. The home care guidebook is primarily targeted at the customers of manual therapy of Kouvola. The home care guidebook is intented to function as a support to rehabilitation together with the instructions given by a physiotherapist. The idea is to give the home care guidebook to the customers during their first visit, so that it is easier for them to understand and embrace the information given by the physiotherapist. Information about the acute nonspecific low back pain and its treatment is distributed with the help of the home care guidebook. The guidebook is also used to motivate the customer towards active rehabilitation. The home care guidebook consists of lumbar function, physiotherapeutic treatments, ways of home care, follow-up recommendations if the back problem reoccurs and a few exercises. The guidebook is based on the theoretical part of this thesis and is illustrated by Janne Kuisma, a student of Graphic Design. Productization directed the progression of the Bachelor`s thesis. A model about the productization of know-how in social and health care by Jämsä and Manninen (2001) functioned as a base for the process. In the theoretical part of the Bachelor`s thesis the contents of the home care guidebook are argumented and the progress of the pruductization is accurately described. The Bachelor`s thesis contains information about the anatomy and function of the low back, acute non-specific low back pain and its treatment and exercises presented in the literature and research

Vastakkainasettelusta tasapainoon: Rakenne ja lukija J. K. Rowlingin Harry Potter -fantasiaromaaneissa

Tutkielma käsittelee J.K. Rowlingin Harry Potter -fantasiaromaaneille ominaisia rakenteellisia yksityiskohtia ja sitä, kuinka nämä yksityiskohdat punoutuvat yhteen kokonaisen teossarjan juonen mahdollistavaksi kokonaisuudeksi lukijan näkökulmasta. Tutkielman pohjavireenä toimii kysymys lukijan immersiosta ja siitä, mitkä rakenteelliset tekijät efektin muodostumiseen vaikuttavat. Tutkielmassani väitän, ettei fantasiafiktiota voida automaattisesti lokeroida tiettyyn malliin, vaan myös genren alaisille teoksille on annettava mahdollisuus todistaa arvonsa yksilöllisinä kaunokirjallisina teoksina. Genremääritelmien sijaan keskitynkin tarkastelemaan Harry Potterien rakenteellisia piirteitä uniikkien yksityiskohtien kautta. Nämä yksityiskohdat merkityksellistyvät koko teossarjan kattavaksi monikerroksiseksi juonirakenteeksi, joka saa arvonsa teossarjan parissa aikaa viettäneen lukijan panoksesta. Siten lukijan näkökulma painottuu rakenteen tulkinnassa. Rakenteen yksityiskohdat motivoituvat temaattisesti toiminnan ja totuuden kaipuun ajatusten alaisuuteen. Fantasiafiktiolle ominainen toiminta ottaa paikkansa teoksen rakenteessa ajaen lukijaa kohti entistä dynaamisempaa lukuprosessia. Totuuden kaipuu puolestaan kokoaa yhteen teoksen kognitiivisen etenemisen aspektit. Lukuprosessin aikana nämä elementit henkilöityvät fantasian konvention mukaisesti teossarjan päähenkilöön Harryyn, mikä puolestaan mahdollistaa lukijan emotionaalisen responssin tekstiin ja siten vahvistaa tekstin rakenteen luomaa immersiivistä lukukokemusta. Tutkielman taustalla vaikuttavat kirjallisuudentutkimuksen formalistisen ja retorisen linjan perustekijät, kuten Boris Tomashevski, Wayne C. Booth ja James Phelan, mutta teksti sidotaan tiukasti keskusteluun nykypäivän (kognitiivisten) narratologien kanssa